Anda di halaman 1dari 14

Lap.

Mikroteknik
TINJAUAN PUSTAKA
Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan
dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai
kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat
dengan metode paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah metode yang paling
umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan.
Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode parafin melalui beberapa
tahapan, yaitu:
A. Pembiusan (Narcose)
Pembiusan merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk memudahkan
pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan
diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-kelenjar(endokrinologi), karena
mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya.
Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah:
1. Eter, biasanya digunakan untuk membius tikus, kelinci, marmut, dan anjing
2. Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera.
Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, aseton- CHCl3, Morfin
HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium.
B. Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting)
Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa
tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan
hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses pencucian (washing).
Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan.
Percobaan ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan dengan tumbuhan.pencucian ini
perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keaadaan kotor oleh darah
atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi
yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai
fiksasi sementara. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis.
Larutan garam fisologis yang bisa dipakai:
1. NaCl 0.8-0.9%
2. Larutan Ringer, dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin. Komposisi larutan ringer
adalah:
o NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas.
o NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin.
NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15 menit. Perlu
diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan menyebabkan pembengkakan sel.
Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut:
1. objek yang diambil dalam kondisi sehat

2. objek yang diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan


3. menggunakan pisau yang tajam
4. ukuran jaringan yang diambil kurang lebih 0.5 cm
5. langsung dicuci dan difiksasi.
C. Fiksasi (Fixation)
Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap berada
pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran.. media yang digunakan untuk
fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan
atau gas yang berfungsi agar Jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan.
Fiksatif yang sering digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah FAA (Formaldehyde Acetic
Acid). Formula FAA untuk jaringan tumbuhan adalah:
Ethil alcohol . 50 ml
Asam asetat grasial . 5 ml
Formalin . 10 ml
Akuadest . 35 ml
FAA ini juga dapat digunakan untuk jaringan hewan. Formula FAA untuk jaringan hewan adalah:
Formalin . 10 ml
Alkohol 70% . 90 ml
Asam asetat grasial . 2 ml
Lama fiksatif 3 jam, tanpa pencucian.
Lama jaringan disimpan dalam larutan fiksatif tergantung pada:
o Jenis jaringan, misalnya jaringan tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan intestinum
o Tebal atau tipisnya jaringan atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar jaringan yang difiksasi maka
semakin lama waktu yang diperlukan
o Jenis fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi yang berbeda.
Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin adalah:
1. mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan keadaan
sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.
2. mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun kerusakan
oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autoloisis.
3. Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan
komponen jaringna fiksatif.
D. Aerasi
Aerasi merupakan proses penarikan udara dari dalam jaringan dengan cara di vakum, yang bertujuan
untuk memudahkan fiksatif masuk ke dalam jaringan dengan sempurna,. Tahap ini diutamakan pada
jaringan tumbuhan, karena sel pada jaringan hewan hanya terdiri dari membrane sel dan vakuola yang
kecil, sehingga udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan mudah keluar melalui
membrane sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola
yang besar, sehingga mengandung banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan
melalui dinding sel yang tebal waktu fiksasi.

E. Dehidrasi (dehydration)
Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan-bahan kimia
tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah difiksasi. Proses
dehidrasi merupakan serangkaian proses dengan cara memasukan sample ke dalam larutan dehidrasi
secara berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dengan mengurai konsentrasi air.
Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode paraffin adalah alkohol. Jenis
dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol, aniline oil dan bergamot oil.
Alcohol merupakan dehidran yang umum digunakan, karena relatife lebih murah dan mudah diperoleh,
tapi mampu menghasilkan hasil yang baik, bahkan untuk jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak,
sumsum tulang belakang, dan embrio. Dalam penggunaan alcohol dipakai serial dengan konsentrasi
yang berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi (35%-50%-70%-80%-95%-100%).
Lama perendaman tergantung untuk masing-masing konsetrasi berkisar 1-6 jam. Alcohol 70% sebagai
stoping point, jaringan di malamkan.
Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alcohol dilakukan setingkat demi setingkat. Tujuannya
adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan,
sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak
sempurna berarti masih ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini
dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat penjernih, dimana jaringan tidak
menjadi transparan walaupun jaringan telah lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang
demikian, maka jaringan harus dikembalikan ke dehidran.

F. Penjernihan (Clearing)
Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari penjernihan ini adalah
menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan
suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini
akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan
memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.
Lama jaringan dalam medium penjernih tergantung pada:
1. Ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan
2. jenis reagen yang dipakai
3. bila dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah setengah hingga tiga jam. Bila
dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka jaringan akan mengeras dan rapuh yang tentunya sulit
untuk di sayat.
4. Jenis jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam menggunakan minyak
cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung menjadi keras atau getas bila dijernihkan
dengan xilol atau benzene.
Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih:
1. minyak anilin

2. Benzene
3. karbon tetraklorida
4. karbon bisulfida
5. minyak kayu cadar
6. kloroform
7. minyak cengkeh
8. Xylol

G. Infiltrasi (Infiltration)
Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan
dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media
penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan
di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan
hewan bisa langsung digunakan paraffin keras dengan titik leleh 56-58C.
Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn langsung dimasukan ke dalam paraffin murni, tetapi
sebelum paraffin murni jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan
paraffin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan campuran ini terlalu
lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini
adalah untuk menghindari jaringan dsri prubshsn lingkungsn yang sangat mendadak. Perubahanperubahan yang mendadak ini dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan
menjadi sangat mengkerut,dll.
Setelah dalam campuran paraffin dan bahan penjernih, jaringan baru dipindahkan ke paraffin murni
sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan
terlalu lama ditinggalkan dalam oven.
Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin sebagi pengikat jaringan
agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.
H. Penanaman (Embedding)
Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke dalam balokbalik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan
dari tahap ini adalah untuk membuat balok paraffin yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat
permanen.
Paraffin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh yang sama dengan paraffin
yang digunakn waktu infiltrasi. Paraffin ketiga yang dipakai pada infiltrasi dapat digunakan langsung
untuk penanaman dengan syarat memang sudah bersih dari bahan penjernih.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam penanaman adalah:
o Paraffin yang digunakan benar-benar bersih dan murni
o Peralatan yang digunakan benar-benar khusu untuk prose situ saja
o Pembuatan balok sebaiknya dilakukan dekat oven atau lampu Bunsen agar lebih cepat, susunjaringan
sesuai dengan orientasi yang direncanakan.
o Jaringan sebaiknya diberi label untuk menghindari kesalahan atau bertukar.

o Untuk jenis-jenis jaringan yang halus perlu dikerjakan di bawah lup


o Jangan sampai ada gelembung udara pada balok paraffin yang dibuat terutama dekat jaringan.
I. Penyayatan (Sectioning)
Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk dengan
menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari
dalam mikroskop.
Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan, diantaranya adalah yaitu
proses embedding lebih cepat dan lebih simpel, material embedding dapat disimpan dalam waktu yang
lama pada kondisi kering, serta dapat membuat irisan yang tipis. Embedding menggunakan paraffin
sangat baik digunakan untuk studi embriologi, anatomi dan sitologi (Khasim, 2002).
Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagian yang sangat tipis untuk
pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotom menggunakan pisau baja dan digunakan untuk
mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam histologi(Wikipedia).
Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:
1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras seperti
kayu
2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akan mengerakan objek
maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik
metode paraffin
3. Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak
maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan pada mikroteknik metode paraffin, walau umumnya
digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objekobjek yang keras.
4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak
ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringan yang disayat adalah jaringan yang tidak di
tanam tetapi dibekukan dengan memakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang
dipakai lebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila
temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:
o Mikrotom harus seberat mungkin
o Meja tempat mikrotom harus stabil
o Pisau harus cocok dengan mikrotom
o Posisi pisau harus stabil
o Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang akan disayat.
J. Penempelan dan Afiksasi (Afixing)
Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan
media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah
berisi sayatan jaringan pada kaca objek.
Media pelekat yang umumnya digunakan adalam mayers albumen yang formulanya adalah sebagai

berikut :
Putih telur sebanyak 50 bagian
Gliserin sebanyak 50 bagian
Kristal Tymol beberapa butir
Akuadest beberapa tetes
K. Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining)
Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk
membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek. Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan
dengan pengerjaan pewarnaan. Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari
paraffin.
Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau memperjelas berbagai
elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.tanpa
pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk diamati.
Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan
dibedakan antara non vital dengan vital
a. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi. Teknik ini
merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan, terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari,
terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa.
b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam keadaan hidup.
Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna maupun
mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang
tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara umum
digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebut mampu memfagosit
zat warna.
c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan
Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang
mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati. Ditinjau dari berbagai segi, maka zat
warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu. Berikut ini adalah
pembagian zat warna bergasarkan berbagai kategori tersebut.
1. Berdasarkan sifatnya, meliputi:
a. Zat warna asam, adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna dengan radikal basa yang
tidak berwarna. Contoh: acid fuchsin, eosin, dan lain sebagainya
b. Zat warna basa, adalah garam-garam dari basa pembawa warna dengan radikal asam yang tidak
berwarna.
2. Berdasarkan asalnya, meliputi:
a. Zat warna alami, berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari tumbuhan maupun dari hewan,
contoh hematokillin, adalah zat warna yang berasal dari tumbuhan (Hehatoxylin campechianum)
b. Zat warna sintetis, mencakup jenis-jenis zat warna yang dibuat di pabrik. Contoh: basic fuchsin, dibuat
dari campuran analin dan paratoluidin.

3. Berdasarkan kemampuan mengenai warna (staining power), meliputi:


a. Zat warna substantife
Jenis zat warna yang mampu mewarnai jaringan secara langsung. Contoh janus green B, Neutral red.
b. Zat warna ajektif
Jenis zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan, harus menggunakan
bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada formula tersebut diberikan pula kalium
alumunium secara berlebihan yang berfungsi sebagai mordan.
4. Berdasarkan jumlah/ komposisi zat warna yang digunakan,meliputi:
a. Pewarna tunggal (single staining), hanya menggunakan satu jenis zat warna, contohnya untuk melihat
polysacharida sulphate ester serta hyaluronic, maka digunakan zat warna tunggal gentian violet.
b. Pewarna ganda/ rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat warna, contoh pada system
pewarnaan hematoxilin-eosin
c. Pewarnaan rangkap tiga (triple staining), menggunakan tiga jenis zat warna, contohnya formula
Marllory triple stai yang menggunakan zat-zat warna acid fuchsin, aniline blue serta orange G.
d. Pewarnaan rangkap empat, jarang digunakan dalam kerja rutin, kecuali untuk tujuan khusus.
5. Berdasarkan struktur jaringan yang akan diwarnai, meliputi:L
a. Pewarnaan umum, seperti Hematoxillin eosin, fastgreen safranin
b. Bewarnaan khusus, seperti pewarnaan jaringan ikat yaitu Molary azan, aniline blue, asam
phospatungistik, korhensen, dan lain-lain.

METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari senin dan jumat sepanjang semester 5, yang bertempat di
Laboratorium Terpadu lab.fisiologi, Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan dan hewan:
Botol film
Pinset
Skalpel
Mikrotom
Vakum
Kotak kertas kalender
Balok
Mikroskop
Kaca objek
Oven
Hotplate

Bahan yang digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan dan hewan:


Jaringan daun anggrek
Jaringan pada Burung
FAA
Alkohol, dengan berbagai konsentrasi
Xilol
Parafin lunak dan keras
mayers albumin
Hematoksilin
Eosin
Safranin
Fastgreen
3.3 Cara kerja
A. Pembuatan Preparat Tumbuhan
Pembuatan preparat tumbuhan terdiri beberapa tahap:
1. pengambilan jaringan tanaman dengan mengambil bagian organ tanaman berukuran 0.5 cm
2. Dilakuakn fiksasi dengan menggunakan larutan fiksatif (FAA)
3. Aerasi dalam larutan fiksatif menggunakan pompa vakum sampai udara dalam jaringan habis
4. difiksasi dengan larutan FAA 12jam
5. Didehidrasi dalam seri alkohol dari kosentrasi rendah ke konsentrasi tinggi (35%-40%-45%-50%-60%70%-80%-90%-96%-100%) masing-masing 1 jam, kecuali 70% boleh dimalamkan.
6. Dimasukan ke dalam Alkohol 100%:Xilol (1:1) selama 1 jam sebagai perantara sebelum proses
penjernihan
7. Sisa alcohol dijernihkan dengan proses clearing, yaitu xilol 1 jam
8. Dilakukan tahapan perantara sebelum infiltrasi yaitu perendaman di dalam larutan Xilol : paraffin
(paraffin keras)(1:1) 1 jam di dalam oven
9. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin lunak 3 kali masing-masing 30 menit dalam oven
10. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin keras 3 kali masing-masing 30 menit dalam oven. Paraffin ketiga
boleh dimalamkan
11. Parafin berisi objek dipotong seperti balok dan ditempel pada balok untuk pegangan pada mikrotom
12. Penyayatan dengan mikrotom
13. Afiksing atau diletakan sayatan jaringan ke kaca objek yang diolesi dengan mayers albumin.
14. Setelah pengeringan dengan menggunakan hotplate yang sebelumnya telah diteteskan oleh xilol
(disebut proses deparafinasi) mulai memasuki ke dalam proses staining/pewarnaan, dengan proses
sebagai berikut, rendam preparasi ke dalam xilol:alcohol (1:1) selama 3 menit, selanjutnya dilakukan
dehidrasi dengan alkohol 100%-90%-80%-70% masing-masing selama 3 menit lalu masukkan dalam air
lalu dilakukan pewarnaan dengan safranin selama 5-15 menit, kemudian bersihkan dengan air.
15. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan eosin dengna cara sbb, setelah distaining dengan
safranin masukkan dalam alcohol 50%, 60%, 70%, 80%, masing-masing 3 menit, lalu dimasukkan ke

dalam fastgreen 15-30 menit, dilanjutkan dengan alcohol (90%-100% tiga kali)masing-masing 3 menit.
Selanjutnya penjernihan dengan menggunakan xilol 5-15 menit serta dibersihkan
16. penyelesaian dengan ditutup pakai kaca penutup sebagai media pelekat
17. Amati preparat yang dibuat dengan menggunakan mikroskop
B. Pembuatan Preparat Hewan
1. Hewan percobaan (burung) dibius dengan menggunakan eter dan diambil organ-organ dalamnya,
seperti jantung, ginjal, lambung, hati, usus, testes, paru-paru dll. Potong organ-organ tersebut dengan
ukuran 0,5 cm.
Organ-organ yang diambil kemudian langsung dimasukan ke dalam larutan fiksasi (FAA) sebanyak 15
menit sebanyak 3X.
2. Dilakukan dehidrasi dengan direndam dalam alcohol 30, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, alcohol absolute.
Masing-masing selama 60 menit,kecuali alkohol 70% boleh dimalamkan.
3. Dimasukan ke dalam Alkohol 100%:Xilol (1:1) selama 1 jam sebagai perantara sebelum proses
penjernihan
4. Sisa alcohol dijernihkan dengan proses clearing, yaitu xilol 1 jam
5. Dilakukan tahapan perantara sebelum infiltrasi yaitu perendaman di dalam larutan Xilol : paraffin
(paraffin keras)(1:1) 1 jam di dalam oven
6. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin keras 3 kali masing-masing 1 jam dalam oven. Pada paraffin ketiga
boleh dimalamkan
7. Tahap selanjutnya adalah embedding atau penanaman, organ dimasukkan kedalam kotak
8. Parafin yang berisi objek dipotong seperti balik di tempel balok kayu untuk pegangan di mikrotom
9. Selanjutnya ke proses sectioning atau pengirisan, setelah melalui pendiaman dalam blok paraffin
10. Selanjutnya dilakukan Afiksing (membentuk sayatan jaringan ke kaca objek yang diolesi dengan
mayers albumin.
11. Setelah pengeringan dengan menggunakan hotplate yang sebelumnya telah diteteskan oleh xilol
(disebut proses deparafinasi) mulai memasuki ke dalam proses staining/pewarnaan, dengan proses
sebagai berikut, rendam preparasi ke dalam xilol:alcohol (1:1) selama 3 menit, selanjutnya dilakukan
dehidrasi dengan alkohol 100%-90%-80%-70% masing-masing selama 3 menit lalu masukkan dalam air
lalu dilakukan pewarnaan dengan hematoxillin selama 5-15 menit, kemudian bersihkan dengan air.
12. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan eosin dengna cara sbb, setelah distaining dengan
hematoxilin masukkan dalam alcohol 50%, 60%, 70%, 80%, masing-masing 3 menit, lalu dimasukkan ke
dalam eosin 15-30 menit, dilanjutkan dengan alcohol (90%-100%)masing-masing 3 menit. Selanjutnya
penjernihan dengan menggunakan xilol 5-15 menit serta dibersihkan
13. penyelesaian dengan ditutup pakai kaca penutup sebagai media pelekat
14. Amati preparat yang dibuat dengan menggunakan mikroskop

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN


Pembahasan
Pada praktikum mikroteknik ini, dilakukan pembuatan preparat tumbuhan dan hewan. Bahan yang

digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan adalah anggrek (Dendrobium sp.) dan bahan yang
digunakan untuk pembuatan preparat hewan adalah burung dara(. Pembuatan preparat pada praktikum
ini dilakukan dengan metode parafin. Metode ini dilakukan dengan beberapa tahap yang dilakukan
secara berurutan dan terus-menerus, yaitu pembiusan(untuk hewan), collecting, fiksasi, aerasi,
dehidrasi, clearing, infiltrasi, embedding, sectioning, afixing, deparafinasi dan pewarnaan. Metode ini
digunakan karena hampir semua jaringan dapat disayat dengan metode ini.
Pada proses pembuatan preparat tumbuhan tidak diawali dengan pembiusan, karena tahap ini hanya
untuk preparat hewan, yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan. Pembuatan preparat tumbuhan
diawali dengan pengambilan jaringan atau collecting, pengambilan jaringan biasanya menggunakan
pisau atau gunting yang tajam dengan ukuran kurang lebih 0,5 cm. Sampel jaringan yang telah diambil,
sebaiknya langsung dimasukan ke dalam larutan fiksatif agar dapat mempertahankan bentuk sel atau
jaringan seperti dalam keadaan hidup. Larutan fiksatif yang digunakan adalah FAA.
FAA (Formaldehyd Acetic Acid) yang digunakan dalam fiksasi merupakan larutan fiksatif campuran dan
sebagai fiksatif koagulan yang lebih banyak digunakan untuk studi dalam aspek anatomi dan morfologi,
serta studi pencocokan kromosom. Tujuan digunakan FAA yaitu untuk menjaga sel dalam waktu
tertentu atau tidak terbatas dan tanpa mengalami kerusakan. Waktu minimal yang diperlukan untuk
fiksasi dengan FAA adalah 18 jam. Komposisi dari FAA adalah sebagai berikut (Khasim, 2002 dalam
Imran,2008):
" Ethyl alcohol 70 % 90 ml
" Glacial acetic acid 5 ml
" Formalin 5 ml
Acetic acid berfungsi untuk membunuh jaringan, selanjutnya formalin dan etil alkohol berperan dalan
modifikasi gambar atau tampilan, pada intinya FAA untuk fiksasi yang memberikan tampilan yang tajam.
Untuk material daun, waktu minimal fiksasi yang harus digunakan adalah sekitar 12 jam. Untuk daun
yang sangat tipis atau batang yang kecil diperlukan waktu 24 jam (Khasim, 2002 dalam Imran, 2008).
Tahap selanjutnya adalah aerasi, yang digunakan khusus untuk preparat tumbuhan, karena sel pada
jaringan hewan hanya terdiri dari membrane sel dan vakuola yang kecil, sehingga udara yang tersimpan
dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan mudah keluar melalui membrane sel yang tipis saat fiksasi.
Sedangkan pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola yang besar, sehingga mengandung
banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan melalui dinding sel yang tebal waktu
fiksasi. Pada tahap aerasi digunakan vakum sampai udara dari dalam jaringan sudah keluar.
Tahap selanjutnya adalah dehidrasi yang menggunakan alkohol secara bertahap dari konsentrasi rendah
sampai tinggi, agar dapat menjaga bentuk jaringan dari perubahan secara tiba-tiba dan untuk
memaksimalkan pengeluaran air dari dalam jaringan. Penggunaan alkohol 70% sebagai stopping point
karena alkohol 70% juga dapat digunakan sebagai desinfektan. Dehidrasi berfungsi untuk membuat
preparasi permanen, sehingga ketika dipotong tidak rusak dan dapat disimpan dalam waktu yang lama.
Alkohol digunakan karena alkohol bersifat menarik air sehingga jaringan mengkerut dan mengeras
(Khasim, 2002 dalam Imran,2008). Setelah tahap ini adalah tahap infiltrasi yang digunakan untuk
menggantikan tempat alkohol di dalam jaringan dengan bahan penjernih yaitu xilol. Sebelum
menggunakan xilol, jaringan dimasukan dahulu ke dalam larutan alkohol dan xilol dengan perbandingan
1:1 agar tidak terjadi perubahan pada jaringan secara tiba-tiba dari alkohol ke dalam xilol.
Tahap selanjutnya adalah embedding, embedding adalah penanaman jaringan ke dalam kotak dengan

menggunakan parafin murni. Kotak yang dibuat dengan menggunakan adalah kertas yang berasal dari
kalender. Tahap ini dilakukan agar mempermudah proses penyayatan. Yang harus diperhatikan adalah
pada saat penanaman tidak boleh ada gelembung.
Setelah tahap embedding, baru bisa dilakukan penyayatan (sectioning). Proses penyayatan (sectioning)
adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk dengan menggunakan
mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam
mikroskop. Mikrotom yang digunakan pada praktikum ini adalah Sliding microtom atau mikrotom
sorong, dmana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju dan mundur. Setelah sayatan
jaringan telah terbentuk, sayatan tersebet ditempelkan di kaca objek (afixing) yang sebelumnya telah
dioleskan mayers albumin secara merata. Selanjutnya sayatan ditetesi oleh xilol dan dipanaskan sampai
kering atau tahap ini disebut deparafinasi. Setelah itu preparat bisa disimpan di dalam kotak sampai
akhirnya nanti dilakukan proses pewarnaan (Staining).
Tahap staining pada tumbuhan dengan menggunakan Pewarna ganda/ rangkap (double staining, karena
dengan menggunakan dua jenis zat warna, yaitu safranin-fastgreen. Tahap pewarnaan menggunakan
beberapa langkah yang dilakukan bertahap yaitu pertama yaitu preparat direndam dalam xilol:alkohol
(1:1), selanjutnya berturut-turut adalah dehidrasi dengan alkohol 100%-90%-80%-70%, pewarnaan I
(Safranin), dibersihkan dengan air, alkohol 50%-60%-70%-80%, pewarnaan II (fastgreen), alkohol 90%100% tiga kali, penjernihan dengan xilol, dan dibersihkan dengan air.
Hasil dari pewarnaan tumbuhan yaitu pada daun anggrek kalajengking (Arachis flos-aeris) adalah
nampak kurang jelas dan sebagian besar rusak ketika dilihat di mikroskop. Hal ini dimungkinkan karena
beberapa hal kemungkinan kesalahan dalam melakukan prosedur sehingga sample daun menjadi lebih
kering dan mengkerut.
Suku anggrek-anggrekan atau Orchidaceae merupakan satu suku tumbuhan berbunga dengan anggota
jenis terbanyak. Jenis-jenisnya tersebar luas dari daerah tropika basah hingga wilayah sirkumpolar,
meskipun sebagian besar anggotanya ditemukan di daerah tropika. Kebanyakan anggota suku ini hidup
sebagai epifit, terutama yang berasal dari daerah tropika. Anggrek di daerah beriklim sedang biasanya
hidup di tanah dan membentuk umbi sebagai cara beradaptasi terhadap musim dingin. Organ-organnya
yang cenderung tebal dan "berdaging" (sukulen) membuatnya tahan menghadapi tekanan ketersediaan
air. Anggrek epifit dapat hidup dari embun dan udara lembab. Daun anggrek biasanya oval memanjang
dengan tulang daun memanjang pula, khas daun monokotil. Daun dapat pula menebal dan berfungsi
sebagai penyimpan air.
Kingdom : Plantae (tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (berpembuluh)
Superdivisio : Spermatophyta (menghasilkan biji)
Divisio : Magnoliophyta (berbunga)
Kelas : Liliopsida (berkeping satu / monokotil)
Sub-kelas : Liliidae
Ordo : Orchidales
Familia : Orchidaceae (suku anggrek-anggrekan)
Genus : Arachis
Spesies : Arachis flos-aeris J.J.S

Jaringan pada daun dapat dibedakan menjadi:


1. Jaringan epidermis
Merupakan lapisan daun yang paling luar. Jaringan epidermis ada dua yaitu; epidermis atas dan
epidermis bawah. Epidermis umumnya transparan karena tidak memiliki kloroplas. Di epidermis
terdapat stomata (tunggal: stoma) yang berperan sebagai alat respirasi tumbuhan. Stomata umumnya
terletak di epidermis bawah. Pada tumbuhan air, biasanya stomata banyak terdapat di epidermis atas.
2. Jaringan mesofil
Jaringan mesofil terletak di antara epidermis atas dan epidermis bawah. Pada tumbuhan dikotil, jaringan
mesofil terdiri dari dua jaringan yaitu: jaringan palisade (jaringan tiang) dan jaringan spons (jaringan
bunga karang).
Jaringan palisade (jaringan tiang)
Sel-sel jaringan palisade berbentuk memanjang seperti tiang dan tersusun rapat. Pada jaringan palisade,
terdapat banyak kloroplas. Oleh sebab itu fotosintesis terjadi di jaringan ini.
Jaringan spons (jaringan bunga karang)
Berbeda dari jaringan palisade, jaringan spons sel-selnya tidak tersusun rapat. Karena sel-selnya tidak
tersusun rapat, jaringan spons digunakan untuk menyimpan cadangan makanan.
Pada tumbuhan monokotil, jaringan mesofil tidak terdiri atas jaringan palisade dan jaringan spons.
Fotosintesis terjadi pada jaringan mesofil.
3. Jaringan pembuluh
Jaringan pembuluh terletak pada jaringan spons. Jaringan pembuluh pada daun merupakan kelanjutan
dari jaringan pembuluh pada batang. Ada dua jenis pembuluh yaitu:
o Pembuluh kayu (xylem).
Merupakan pembuluh yang berperan untuk mengangkut air dan mineral yang diserap akar dari tanah
menuju daun.
o Pembuluh tapis (floem)
Merupakan pembuluh yang berperan untuk mengangkut hasil fotosintesis ke seluruh bagian tumbuhan.
Pada tumbuhan dikotil, terdapat kambium yang membatasi pembuluh kayu dan pembuluh tapis. Tapi
pada tumbuhan monokotil, tidak terdapat kambium yang membatasi pembuluh kayu dan pembuluh
tapis. Akibat adanya kambium, memungkinkan batang tumbuhan dikotil bertambah lebar dan
terbentuknya lingkaran tahun pada batang.
Daun terbagi menjadi 4 susunan anatomi, yaitu daun bifacial/dorsiventral (bentuk permukaan atas dan
bawah tidak sama karena palisade hanya pada permukaan atas), daun unifacial/isolateral (bentuk
permukaan atas dan bawah sama; palisade terdapat pada kedua sisi), daun rumput-rumputan pada
monokotil (mesofil hanya berupa spons), dan daun jarum pada gymnospermae (mesofil bentuk bunga,
penampang melintang bulat membulat, setengah lingkaran atau segitiga sehingga sulit ditentukan atas
dan bawahnya(Priyanti&Puji,2007).
Pada hasil dari pembuatan preparat hewan, yaitu pada hati, otak dan paru-paru hasil yang didapatkan
juga kurang bagus. Sehingga masih tidak dapat dibedakan bagian-bagiannya. Kadang preparat yang
dihasilkan kurang bagus. Jaringan kadang melipat sehiingga sulit diamati bagian-bagiannya. Hal ini

dikarenakan pada proses pengirisan kurang berhasil dimana pita menggulung dan jaringan yang melekat
pada parafin hanya sedikit. Warna jaringan yang pudar karena setelah perendaman di larutan pewarna
terlalu lama dibiarkan di udara bebas. Hal lain yang sangat mungkin adalah pewarna kualitasnya sudah
menurun atau terlalu lama. Jaringan yang teramati kadang rusak aatu terkoyak hal ini dapat dikarenakan
pita sobek sehingga jaringan ikut rusak. Proses infiltrasi dengan xilol kurang maksimal sehingga jaringan
rapuh (Affuwa, 2007).
Salah satu preparat hewan adalah hati. Hati adalah sebuah organ dalam vertebrata, termasuk manusia.
Organ ini memainkan peran penting dalam metabolisme dan memiliki beberapa fungsi dalam tubuh
termasuk penyimpanan glikogen, sintesis protein plasma, dan penetralan obat. Preparat yang lain
adalah preparat otak dan paru-paru. Pada otak sebagiannya terdiri atas sel syaraf.

PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode parafin melalui beberapa
tahapan, diantaranya adalah Fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi, penyelubungan
(embeeding), pengirisan (sectioning), penempelan (affixing), pewarnaan (staining), penutupan
(mounting). Berdasarkan hasil pembuatan preparat tumbuhan yaitu pada daun Anggrek, struktur yang
teramati tampak kurang jelas dan sebagian besar rusak. Sedangkan hasil dari preparat hewan tidak
dapat dibedakan bagian-bagiannya.
5.1 Saran
Saran yang ingin disampaikan yaitu sebaiknya untuk praktikum selanjutnya harus lebih diperhatikan
dalam melakukan setiap langkah prosedur agar hasilnya lebih baik dan maksimal.

DAFTAR PUSTAKA

Dasumiati, 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Prodi Biologi Fak.Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta
Daun. Http: http://fionaangelina.com/2008/04/01/daun/. Di akses tanggal 29 Desember 2008 jam 14.24
Imron,Tamyis Ali.2008. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan Dengan Metode Parafin. Lap.prak
mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Di akses tanggal 29 Desember
2008 jam 14.02
__________________ . Pembuatan Preparat Jaringan Hewan Dengan Metode Parafin. Lap.prak
mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Di akses tanggal 29 Desember
2008 jam 14.17
Mikroteknik. http: wikipedia.com. Di akses tanggal 29 Desember 2008 jam 14.35
Priyanti dan Puji. 2007. Penuntun Praktikum Struktur dan Perkembangan Tumbuhan (Morfologi dan
Anatomi Tumbuhan). Laboratorium Terpadu. UIN Jakarta
Diposkan oleh Miss.Biology di 01.09
http://rinaningtyasbiology.blogspot.com/2011/01/lap-mikroteknik.html