Laporan Praktikum

Struktur dan Fungsi Biomolekul

Hari,Tanggal : Jumat, 14 November 2014

PJP
: Inda Setyawati, S.TP, M.Si
Asisten
: Yuyun Hikmatul Uyun
Selvi Muliani
Gia Permasku, S.Si
Nur Hidayah HL

ASAM NUKLEAT I
Kelompok 9
Yanti Fajarwati
Siti Khodijah
Yahya Ramadhani
Melati Devina G

G84120054
G84120013
G84120050
G84120094

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PENDAHULUAN
Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA merupakan
material genetik yang tersimpan di dalam sel yang dikemas sedemikian rupa
menjadi struktur superkoil yang kompak. DNA berikatan dengan protein histon
membentuk struktur yang disebut dengan kromosom. Molekul DNA umumnya
tersusun oleh dua untai polinukleotida yang terpilin secara anti-paralel
membentuk struktur untai ganda (double helix) yang terikat oleh ikatan-ikatan
hidrogen yang terbentuk antara basa nitrogen untai yang satu dengan untai lain
yang saling berkomplementer. Tidak seperti molekul DNA, molekul RNA hanya
disusun oleh satu untai polinukleotida. Gula penyusunnya adalah ribosa,
sedangkan pada DNA adalah deoksiribosa (Sinaga 2012).
Ada tiga macam jenis RNA dalam sel, baik eukariot maupun prokariot
yaitu mRNA (RNA messenger), tRNA (RNA transfer), dan rRNA (RNA
ribosomal) yang memiliki fungsi berbeda-beda. RNA messenger (mRNA)
berfungsi sebagai pembawa pesan atau informasi genetik yang diterjemahkan dari
DNA, dan memberitahukan sel tentang struktur molekul protein yang akan dibuat.
RNA transfer (tRNA) berperan dalam membawa asam amino tertentu yang
dibutuhkan ke ribosom untuk dirangkai menjadi sebuah protein, sedangkan fungsi
rRNA merupakan bagian struktur ribosom, kompleks protein-mRNA, yang
berperan mensintesis protein sesuai dengan informasi genetik yang dibawa oleh
mRNA (Sinaga 2012).
Hampir semua sel mengandung protein, DNA, dan RNA yang jumlahnya
dalam jaringan tertentu sangat kecil. Sumber DNA yang biasanya digunakan
untuk percobaan harus mengandung kadar DNA yang cukup dan kadar DNA-ase
yang rendah. Beberapa jaringan mengandung DNA-ase yang aktivitasnya cukup
tinggi, sehingga DNA harus dipecah menjadi fragmen yang lebih kecil. DNA
mudah mengalami denaturasi, sehingga percobaan yang menggunakan DNA harus
dilakukan dengan hati-hati, agar hasil isolasinya sesuai dengan kadar sebenarnya
dalam jaringan. DNA berperan dalam semua aktivitas sel, mendorong
pengembangan biologi molekular yang bertujuan untuk menerangkan prosesproses biologis dalam hal struktur dan interaksinya antara asam nukleat dan
protein. DNA juga menyimpan dan mengekspresikan informasi genetik, sehingga
berpengaruh besar pada bidang-bidang studi lain seperti imunologi, kedokteran
(produksi insulin, interferon), tanaman transgenik, mikrobiologi, dan ilmu
forensik (Bintang 2010).
Larutan alkali menyebabkan dua untai DNA terpisah, tetapi berbeda
dengan efeknya pada RNA, alkali tidak menyebabkan pemutusan ikatan
fosfodiester DNA. Pemberian alkali digunakan untuk mengeluarkan RNA dari
DNA dan memisahkan untai DNA sebelum atau sesudah elektroforesis pada gel
poliakrilamid atau agarosa (Marks DB et al.2000). DNA dan RNA dapat diisolasi
dari sel melalui serangkaian tahap tertentu. Metode-metode isolasi ini telah
banyak dikembangkan sehingga didapatkan hasil yang terbaik dari segi kualitas
dan kuantitas. Metode-metode tersebut di antaranya adalah metode Kit, metode
CTAB, dan metode lisis termal.
Praktikum bertujuan menghitung kandungan asam deoksiribonukleat
(DNA) dan asam ribonukelat (RNA) dalam sampel.

METODE
Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum Struktur dan Fungsi Biomolekul dilakukan di Laboratorium
Pendidikan Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, IPB. Waktu praktikum yaitu hari Jumat, tanggal 14 November 2014, pukul
08.00-11.00 WIB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu tabung reaksi, pipet
Mohr, Bulp, pipet tetes, spektrofotometer, wadah berisi es, tabung sentrifus,
penangas air. Bahan yang digunakan adalah homogenat hati tikus, KOH, air,
HClO4 60%, larutan asam trikloroasetat (TCA) 100%, larutan standar RNA,
orsinol, FeCl3.6H2O, HCl, larutan standar DNA, larutan asetaldehida, difenilamin,
asam asetat, H2SO4, akuades.
Prosedur
Penentuan Konsentrasi RNA dalam homogenate hati tikus.
Homogenat dipipet sebanyak 2,5 mL ke dalam sebuah tabung sentrifus yang telah
didinginkan, kemudian ditambahkan 2,5 mL HClO4 0,6M dingin. Larutan
kemudian dikocok dan disimpan dalam es selama 10 menit. Campuran lalu
disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan kemudian
dibuang, dan pelet disuspensikan kembali dalam 4,0 mL KOH 0,3 M. Larutan
dipindahkan dalam sebuah tabung reaksi yang bersih, dan ditempatkan dalam
penangas air bersuhu 40oC selama 40 menit. Tabung didinginkan dalam es selama
5 menit, dan ditambahkan 2,5 mL HClO4 1,2 M. Larutan lalu dikocok dan
disimpan dalam es selama 10 menit. Selanjutnya, larutan dipindahkan ke dalam
sebuah tabung sentrifus dingin dan disentrifugasi kembali seperti pada tahap
sebelumnya. Selesai disentrifugasi, larutan supernatan dikumpulkan dan
dituangkan ke dalam sebuah tabung reaksi bersih dan diberi label sebagai ekstrak
RNA. Pelet disuspensikan kembali dalam 10 mL HClO4 0,2M dingin dan
dipindahkan ke dalam sebuah tabung reaksi dingin, kemudian ditempatkan dalam
tempat pembekuan (-20oC) dalam sebuah lemari es untuk penentuan kadar DNAnya. Disiapkan empat tabung reaksi yang masing-masing diisi oleh pereaksi
orsinol sebanyak 3 mL. Tabung 1 kemudian ditambahkan air suling (akuades)
sebanyak 4 mL, tabung 2 ditambahkan air suling sebanyak 3,8 mL dan larutan
RNA 0,2 mL (supernatan), tabung 3 ditambahkan 3,5 mL air suling dan 0,5 mL
larutan RNA (supernatan), sedangkan tabung 4 ditambahkan 3,5 mL air suling dan
0,5 larutan standar RNA. Standar RNA menggunakan RNA terhidrolisis sebanyak
500 g/mL dalam asam trikloroasetat 10%, dan pereaski orsinol ditambahkan
terakhir, kemudian larutan dikocok. Setelah itu, larutan didinginkan dalam wadah
berisi es, dan dibaca absorbansinya (A) pada spektrofotometer dengan panjang
gelombang 660 nm. Sebelumnya, nol-kan dengan tabung 1 (blanko). Konsentrasi
RNA dalam tabung 2 dan 3 kemudian dihitung.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Prinsip isolasi DNA dan RNA adalah pemecahan dinding sel dan yang
diikuti dengan pemisahan DNA dan RNA dari komponen-komponen lain
sehingga diperoleh DNA dan RNA murni. Penentuan RNA dapat menggunakan
cara reaksi orsinol. Prinsipnya reaksi orsinol merupakan reaksi umum untuk
pentosa, dan bergantung pada pembentukan furfuralnya apabila pentosa
dipanaskan dengan HCl pekat. Orsinol akan bereaksi dengan furfural jika ada
katalisator berupa FeCl3 dan membentuk kompleks berwarna hijau. Reaksi positif
hanya untuk nukleotida purin (adenin dan guanin). RNA stabil pada suhu 90oC,
sedangkan protein-protein lain pada suhu ini sudah mengalami denaturasi
(Bintang 2010).
Proses isolasi diawali dengan penambahan larutan HClO4 dingin yang
berfungsi untuk mengendapkan makromolekul seperti protein. Kemudian
campuran disentrifugasi sehingga diperoleh pelet yang kemudian disuspensikan
dengan larutan basa KOH, yang bertindak sebagai alkali. Penambahan larutan
alkali dan proses pemanasan pada suhu 40o C dapat mendepolimerasi RNA,
sehingga RNA akan mengendap. Proses sentrifus selanjutnya dilakukan untuk
memisahkan DNA dan RNA (Faatih 2009). Pelet yang terbentuk kemudian
disentrifus kembali sebanyak tiga kali untuk mengendapkan makromolekul yang
masih tersisa, dibantu dengan larutan HClO4 dingin. Berikut data absorban kurva
standar RNA setelah dilakukan pemisahan dari DNA.
Tabel 1 Absorban kurva standar RNA
[RNA] g/mL

Absorbansi terukur

Absorban terkoreksi

Blanko

0.102

0.000

6.25

0.420

0.318

12.5

0.669

0.567

25.0

1.143

1.041

62.5

1.418

1.316

125.0

1.436

1.334

Absorbansi

Kurva Standar RNA

2

y = 0,009x + 0,399
R = 0,664

1
0
0

50

100
[RNA] g/mL

Gambar 1 Grafik kurva standar RNA

150

Konsentrasi RNA diukur dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 660 nm. Pembuatan kurva standar sangat diperlukan dalam penentuan
kadar sampel yang menggunakan metode spektrofotometri. Tujuan pembuatan
kurva standar adalah untuk menentukan konsentrasi RNA berdasarkan absorbansi
serta untuk menentukan ketepatan hasil analisa yang sesuai dengan hukum
Lambert-Beer. Kurva standar digunakan sebagai standar eksternal. Kurva standar
dibuat melalui hubungan konsentrasi DNA dan absorbansinya (Paramita dan
Sukesi 2009).
Hasil kurva standar didapatkan persamaan garis y=0,009x + 0,399 dengan
R2=0,664. Nilai r yang didapat tidak begitu baik, karena belum mendekati 1,0
sehingga dapat disimpulkan kurva standar yang dibuat tidak diperoleh dengan
baik karena kurva yang didapat belum linier. Menurut Paramita dan Sukesi
(2009), nilai r harus terletak pada interval 0.9 1.0 yang menunjukkan bahwa
antara absorbansi dan konsentrasi memiliki korelasi yang linier. Hasil perhitungan
kurva standar akan mempengaruhi nilai konsentrasi sampel. Nilai absorbansi yang
diperoleh kemudian disubstitusi pada persamaan untuk menghitung konsentrasi
RNA terukur. Berikut data konsentrasi RNA yang terukur.
Tabel 2 Konsentrasi RNA
V larutan RNA (mL)

Absorban

[RNA] g/mL

0.2

-0.008

-45.22

0.5

0.134

-29.44

Contoh perhitungan [RNA]:

Y

= a+ bx

= 0.399+0.009x

0.134 = 0.399+0.009x
[RNA] = -29.44
R

=0.664

Menurut Ratnayani et al (2009), nilai absorbansi yang memenuhi hukum

Lambert Beer berada pada rentang 0,2 sampai dengan 1,0. Hasil percobaan yang
didapat nilai absorbansinya hanya berkisar dari -0,008 sampai 0,134. Nilai
absorbansi ini belum memenuhi hukum Lambert Beer. Konsentrasi RNA yang
diperoleh pada volume 0,2 mL sebesar -45,22 sedangkan pada volume 0,5 mL
sebesar -29,44. Hasil ini menunjukkan adanya kenaikan konsentrasi dari volume
0,2 mL ke 0,5 mL. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai absorbansi
berbanding lurus dengan konsentrasi. Semakin besar absorbansi, maka semakin
besar juga konsentrasi RNA yang terukur.

SIMPULAN
Molekul DNA dan RNA dapat dihitung konsentrasinya menggunakan
metode spektrofotometri. Nilai absorbansi yang terukur akan setara dengan
konsentrasinya. Akan tetapi sebelumnya harus dilakukan isolasi DNA dan RNA
terlebih dahulu dengan teknik sentrifugasi. Hasil pengukuran kurva standar RNA
diperoleh persamaan garis y=0,009x + 0,399 dengan R2=0,664. Kemudian dengan
memasukkan nilai absorbansi yang diperoleh pada persamaan tersebut, didapatkan
konsentrasi RNA pada volume 0,2 mL sebesar -45,22 sedangkan pada volume 0,5
mL sebesar -29,44. Hasil ini menunjukkan adanya hubungan antara nilai
absorbansi dengan konsentrasi yang terukur. Nilai absorbansi berbanding lurus
dengan konsentrasi, sehingga apabila absorbansinya meningkat, maka nilai
konsentrasi yang diperoleh juga meningkat.
DAFTAR PUSTAKA
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta(ID): Erlangga.
Faatih M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains dan
Teknologi. 10(1): 61-67.
Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah
Pendekatan Klinis. Jakarta(ID): Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Rodwell VW, Weil PA.
2014. Biokimia Harper Edisi 29. Jakarta(ID): Penerbit Buku Kedokteran
EGC.
Paramita GA, Sukesi. 2009. Produksi abon daging ikan pari (rayfish):
karakterisasi kimia daging ikan pari. Prosiding Skripsi. Surabaya(ID):
Institut Teknologi Sepuluh November.
Ratnayani K, SC Yowani, SL Syane. 2009. Amplifikasi fragmen 0, 4 kb daerah dloop DNA mitokondria lima individu suku Bali tanpa hubungan
kekerabatan dengan metode polymerase chain reaction (PCR). Journal of
Chemistry. 3(1): 14-20.
Sinaga E. 2012. Biokimia Dasar. Jakarta(ID): PT. ISFI Penerbitan.