BIOLOGIA CELULAR
ESPECTROFOTOMETRIA
AUTORES
PROFESOR
UNIVERSIDAD DE XXX
FACULTAD DE XXX
INSTRUMENTACION QUIRURGICA
AGOSTO DE XXX
TABLA DE CONTENIDO
MARCO TERICO................................................................................................................................ 4
ESPECTROFOTOMETRIA ............................................................................................................. 4
ESPECTRO ...................................................................................................................................... 4
ABSORBANCIA ................................................................................................................................ 4
ABSORBANCIA UV Y VISIBLE .............................................................................................. 4
ABSORBANCIA DE LA RADIACION INFRARROJA ...................................................... 5
TRANSMITANCIA .......................................................................................................................... 6
LEY DE BEER LAMBERT ............................................................................................................. 6
ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE Y UV ........................................................................... 7
ESPECTOMETRIA DE INFRARROJOS ................................................................................ 8
ESPECTROFOTOMETRIA CONVENCIONAL ..................................................................... 9
FICHAS DE BIOSEGURIDAD ....................................................................................................... 10
OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 11
MATERIALES, PROCEDIMIENTOS Y METODOLOGAS ................................................... 12
RESULTADOS ..................................................................................................................................... 15
CALCULOS............................................................................................................................................ 19
ANALISIS............................................................................................................................................ 21
CONCLUSIONES ...............................................................................................................................23
BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................24
MARCO TERICO
ESPECTROFOTOMETRIA
ESPECTRO
En un tomo los electrones se hallan dispuestos alrededor del ncleo en orbitas
de diferente energa; mientras los electrones permanecen en sus orbitas
particulares la energa del tomo permanece constante, pero si un electrn
cambia de orbita, cambia tambin la energa del tomo. La energa de un tomo
cambiara si absorbe o emite radiacin.
A temperaturas normales los tomos de un gas monoatmico se encuentran
mayormente en el estado de mnima energa. Si el gas se calienta fuertemente
o si se hace saltar una descarga elctrica atreves del gas, pueden excitarse
algunos electrones y moverse a orbitas de mayor energa. Estos tomos
excitados no son estables y retornan al estado fundamental emitiendo energa
en forma de radiacin electromagntica.
El espectro de absorcin se observa cuando se pasa a travs de una sustancia
una radiacin de una gama de frecuencias. Se absorben aquellas frecuencias
que son capaces de producir excitacin electrnica.
ABSORBANCIA
ABSORBANCIA UV Y VISIBLE
Proporcionar informacin cualitativa y cuantitativa sobre molculas orgnicas
inorgnicas y bioqumicas. Se puede clasificar en:
Absorcin por los compuestos orgnicos: la absorcin de la radiacin se debe a
dos tipos de electrones: los electrones compartidos por varios tomos y que
excitacin. La forma en que puede vibrar una molcula est relacionada con el
nmero de sus enlaces y por tanto, con el nmero de tomos que la componen.
TRANSMITANCIA
La transmitancia es la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en
determinada cantidad de tiempo. Existen diferentes clases de transmitancia,
pero nos centraremos en la transmitancia ptica.
Transmitancia ptica: se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo,
en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un
cuerpo traslcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra
fraccin de ese haz de luz atravesar el cuerpo, segn su transmitancia.
Esta cifra puede estar expresada tambin en porcentaje.
La reduccin de intensidad, dl, que se produce cuando la luz atraviesa una capa
de espesor dl que contiene una especie absorbente J a una concentracin molar
J es proporcional al espesor de la capa, a la concentracin de J y a la
intensidad I, incidente de la capa (pues la velocidad de absorcin es
proporcional a la intensidad)
La ley de Beer Lambert implica que la intensidad de la radiacin
electromagntica transmitida a travs de una muestra a un nmero de onda
dado, disminuye en forma exponencial en funcin del espesor de la muestra de
la concentracin molar.
Coeficiente de absorcin o extensin molar: El coeficiente de extensin molar
depende de la frecuencia de la radiacin incidente y es mayor donde la
absorcin es ms intensa. El valor mximo de del coeficiente de absorcin
molar, es un ndice de la intensidad de una transicin. Sin embargo dado que
las bandas de absorcin se esparcen sobre un intervalo de nmeros de onda, la
estimacin del coeficiente de absorcin para un nmero de onda nico no dara
un verdadero ndice de la intensidad de la transicin.
ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE Y UV
La espectroscopia de absorcin molecular en la regin UV y visible tiene su
principal aplicacin en el anlisis cuantitativo y es uno de los mtodos
preferidos en los laboratorios clnicos y qumicos. La radiacin
electromagntica que podemos percibir como luz visible oscila entre 400 y
750 nanmetros. Por debajo de esta cifra est la radiacin UV, y por encima el
infrarrojo. Una absorcin de luz UV (200 400 nm) corresponde a incrementos
de energa de 70 140 Kcal mol; estos valores son intermedios entre las
energas superiores, requeridas para la fotoionizacin de un enlace covalente
simple, y las energas menores precisas para las transiciones vibratorias y
rotatorias. La absorcin de luz en el UV prximo implica el desplazamiento de
electrones mviles.
Cuanto ms mvil sea el sistema de electrones, su desplazamiento ocurrir con
mayor facilidad, y por lo tanto se requiere menos energa para estas
transiciones electrnicas. Es decir los sistemas mviles de electrones
absorbern luz de menor frecuencia y por tanto, de mayor longitud de onda. La
FICHAS DE BIOSEGURIDAD
10
OBJETIVOS
11
12
Procedimientos:
El procedimiento consisti, en primera estancia, en determinar el punto mximo
de absorbancia de la sustancia correspondiente a cada grupo, en el caso
particular del presente grupo de informantes, fue, como antes se mencion, el
naranja de metilo (327.34 g/mol) a 100 mg/mL. Al principio de esta primer
prctica se calibr el espectrofotmetro a cero, con el Blanco (solucin con
todos los componentes de la solucin menos la sustancia trabajada, esto es, sin
el colorante, es decir, agua destilada), con una solucin de 5 mL de agua
destilada y 5 mL de naranja de metilo, luego se procede a hallar las
absorbancias a diferentes longitudes de onda, y como punto mximo de
absorbancia, en el caso particular, se obtuvo, a una longitud de onda de 460
nanmetros, una absorbancia de 0.145.
En segunda estancia, pasamos a elaborar una curva de calibracin del naranja
de metilo en diferentes concentraciones, como acto primordial a esta prctica,
se elaboraron cinco soluciones a diferentes concentraciones, luego, en el
espectrofotmetro, fueron medidas las absorbancias de cada una de ellas,
teniendo en cuenta el punto mximo de absorbancia de la prctica anterior,
entonces, como resultado, se obtuvo una tabla con valores ascendentes, de la
cual derivara una grfica concentracin versus absorbancia con una lnea
ascendente.
Por ltimo, pasamos a determinar la concentracin de una muestra problema, la
cual nos fue asignada por uno de los monitores del laboratorio, entonces,
puesto que de la solucin se desconoca su concentracin, se procedi a
averiguarla por dos medios, uno de ellos era una interpolacin, esto es, una
comparacin en la grfica elaborada a partir de la curva de calibracin. El otro
medio era por una frmula que contiene la absorbancia y la concentracin
estndares, que se tenan identificadas gracias a los puntos anteriores, y la
13
14
RESULTADOS
Para
determinar
C14H14N3NaO3S
el
400nm
0.092
420nm
0.118
440nm
0.136
460nm
0.145
480nm
0.130
500nm
0.090
520nm
0.045
540nm
0.013
560nm
0.0
espectro
de
absorcin
se
utiliz
metil-naranja
a diferentes
15
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0
200
400
600
Tubo N
SLN Colorante
Agua Destilada
Absorbancia
1
1ml
9ml
0,025
2
2ml
8ml
0,052
16
3
3ml
7ml
0,080
4
4ml
6ml
0,122
5
5ml
5ml
O,145
0,03
0.06
0,15
Concentracin (M)
17
0,09
0,12
0,01 0,03
Concentracin (M)
La extrapolacin arroja un dato alejado al clculo de: 0,0125
18
CALCULOS
2)
3)
4)
5)
0,0003 moles
1)
M=-------------------= 0,03
0,0006moles
2)
M=--------------------------=0,06
0,01l
0,01l
0,0009moles
0,0012moles
3) M=-----------------------= 0,09
4) M= -----------------------=0,12
0,01l
0,01l
19
0,0015moles
4) M=----------------------------=0,15
0,01l
20
Ae/Ce=Ap/Cp
0,145
0,134
---------------= -----------------0,15M
0,134 . 0,15M
X=------------------------= 0,138
0,145
21
ANALISIS
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CONCLUSIONES
23
BIBLIOGRAFIA
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