IBQ.
GRUPO A.
ALUMNA:
DANIELA FERNANDA MARTINEZ JARAMILLO.
PROFESOR:
EDUARDO ANDRADE ESQUIVEL.
11/11/14
RESUMEN
Con el fin de ahondar en el conocimiento de la flora
colombiana, particularmente aquella presente en
la regin de los llanos orientales, se eligi la especie Strychnos schultesiana Krukoff para profundizar en su composicin qumica y as establecer una
potencial utilidad medicinal o industrial. Para ello
se realiz un anlisis fitoqumico preliminar de tres
de sus rganos tallos, hojas y semillas, en el que
se evalu la presencia de los principales grupos de
metabolitos secundarios asociados con actividad
biolgica, a saber: alcaloides, flavonoides, taninos,
saponinas, derivados antracnicos, esteroides y/o
triterpenoides, cumarinas, glicsidos cardiotnicos y lactonas terpnicas. Se detect la presencia
de alcaloides en gran concentracin, lo cual era
de esperarse al tratarse de una especie del gnero
Strychnos, ampliamente conocida por su contenido
de alcaloides. Es notable tambin la presencia de
flavonoides en los tres rganos. Estos compuestos
son ampliamente conocidos por sus propiedades
antioxidantes, tiles en la prevencin de mltiples
enfermedades asociadas a los procesos oxidativos.
Los resultados de este trabajo son realmente ti-
ABSTRACT
In order to improve the knowledge of Colombian
flora, particularly that belonging to the llanos
orientales region, Strychnos schultesiana Krukoff
was chosen for a chemical composition indepth
study to establish a potential utility in medicinal
or industrial fields. For this analysis, a preliminary
phytochemical study of three organs of the plant
steams, seeds and leafs was made; the purpose
was to find the main secondary metabolites associated with biological activities: alkaloids, flavonoids, tannins, saponins, antracenic derivates, steroids, coumarins, cardiotonic glycosides and terpenic lactones. The main compounds were alkaloids.
This fact was expected, as this species belongs to
Ingeniera Forestal, Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas.
Correspondencia: lcarvajal@udistrital.edu.co.
Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogot. yahatau@unal.edu.co
Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogot. nsierram@unal.edu.co
Grupo Bsqueda de Principios Bioactivos, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogot. dcruedan@unal.edu.co
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Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)
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nar hasta estudios qumicos sistemticos bioguiados. Puesto que este ltimo tipo de estudio requiere
una inversin considerable de tiempo y recursos,
lo ideal es iniciar con estudios fitoqumicos preliminares que permitan hacer una discriminacin
de las plantas a estudiar en trminos de su composicin qumica, con el fin de seleccionar nicamente aquellas ms interesantes para posteriores
estudios sistemticos. El objetivo de un estudio
fitoqumico preliminar es determinar la presencia o
ausencia de los principales grupos de metabolitos
en una especie vegetal, a saber: alcaloides, antraquinonas y naftoquinonas, esteroides y triterpenos,
flavonoides, taninos, saponinas, cumarinas, lactonas terpnicas y cardiotnicos. Dado que cada uno
de estos grupos de compuestos est relacionado
con actividades biolgicas especficas, partiendo
de los resultados obtenidos en el estudio fitoqumico preliminar es posible orientar investigaciones
posteriores para determinar la actividad biolgica
de las especies en cuestin y los principios activos
involucrados.
En el caso del presente anlisis fitoqumico preliminar se parti del extracto etanlico de tres rganos hojas, semillas y tallos de Strychnos schultesiana (Loganiaceae) (Missouri Botanical Garden
2008), en los cuales se evalu la presencia de los
principales grupos de metabolitos secundarios previamente mencionados, mediante pruebas de tubo
y/o cromatografa en capa delgada que se describen de manera detallada en el siguiente apartado.
Las especies del gnero Strychnos han sido utilizadas tradicionalmente por muchas comunidades
indgenas para la preparacin de venenos conocidos como curares. Strychnos schultesiana es una
especie trepadora que presenta un comportamiento
muy favorable para su manejo y propagacin en vivero, de igual manera comienza entre los 3 y 4 aos
de edad la produccin de frutos, muy abundantes
en el sitio de recoleccin y conocidos en la poblacin con los nombres de cupat, castaa espinosa o
solita. Al no conocerse mucho de su composicin
qumica, se plante la necesidad de realizacin de
un anlisis fitoqumico preliminar para ahondar en
su conocimiento qumico.
El cupat es una planta trepadora de hojas simples,
opuestas, sin estipula ni exudado. La corteza exter-
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C.
D.
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Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)
METODOLOGA
El material vegetal de cupat fue recolectado en el
mes de junio del ao 2008, en la finca El Alcaravn, vereda Los Maracos, km 1 va al Ri Ariari,
Granada, Meta. Para realizar el anlisis fitoqumico
preliminar se utiliz la metodologa corrientemente utilizada en el Departamento de Farmacia para
tal propsito (Sanabria 1983), la cual se divide en
tres etapas: procesamiento del material vegetal,
obtencin del extracto etanlico y realizacin de
la prueba de identificacin de cada uno de los metabolitos.
Procesamiento del material vegetal: Hojas, tallos
y semillas de S. schultesiana fueron sometidos a un
proceso de secado en una estufa de aire circulante a
50 C por 48 horas, trabajando cada uno de los rganos de la planta por separado. Posteriormente, el
tamao de partcula se disminuy pasando el material seco por un molino de discos (hojas y tallos) o
un molino de cuchillas (semillas), segn el caso.
Obtencin del extracto etanlico: 100 g del material vegetal seco y molido de cada uno de lo rganos a estudiar fueron sometidos separadamente
a maceracin, en un baln de fondo plano por un
tiempo de 24 horas, utilizando como solvente de
extraccin etanol del 96% en cantidad suficiente
para cubrir el material vegetal. Posteriormente se
llev a reflujo por una hora, se dej enfriar a temperatura ambiente y se filtr y concentr para eliminar el solvente y proceder a realizar las pruebas
para cada uno de los metabolitos.
Alcaloides: La mayora de los alcaloides, con excepcin de los alcaloides de amonio cuaternario y
N-xidos de amina, son solubles en solventes orgnicos poco polares, como cloroformo y mezclas
de ste, pero pueden formar sales solubles en agua
en presencia de cidos minerales diluidos, como
el cido clorhdrico al 5% en agua. Esta propiedad
cido-base se aprovech para su purificacin a partir de extractos totales. Luego de este paso inicial
se realizaron pruebas de precipitacin en medio
cido, utilizando para ello sales de metales pesados como el ioduro de potasio (reactivo de Dragendorff), el ioduro de potasio y mercurio (reactivo de
Mayer) y la sal de Reineckato de amonio, entre
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Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)
Practicar las 4
reacciones de
precipitacin
Previo a la realizacin de la cromatografa es necesario eliminar las clorofilas del extracto, ya que
intervienen con el ensayo. Es necesario hacer lo
mismo en el caso del anlisis de cumarinas y lactonas sesquiterpnicas. Para ello el extracto etanlico
seco fue tratado con un volumen aproximadamente
igual de una solucin de acetato de plomo al 4%
que contena 0.5% de cido actico, con el fin de
precipitar las clorofilas presentes. Esta mezcla se
dej en reposo durante aproximadamente 15 min y
se filtr a presin atmosfrica. El filtrado as obtenido fue concentrado a 3/4 de su volumen en eva-
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que se aprovecha para su deteccin. Adicionalmente, puesto que todas las cumarinas poseen en
su estructura una -lactona, pueden identificarse
mediante las reacciones propias para lactonas. Por
este motivo, con el fin de determinar la presencia
de cumarinas en la muestra, se desarroll una cromatografa en capa delgada empleando gel de slice
F254 como fase estacionaria y una mezcla cloroformo-cetona 9:1 como fase mvil. Una vez eluda la
placa, se observ a la luz uv (365 y 254 nm) antes
de revelarse con la reaccin del hidroxamato frrico, especfica para lactonas. Esta reaccin consiste
en asperjar la placa con una mezcla de volmenes
iguales de clorhidrato de hidroxilamina al 2% en
etanol y naoh 2N, calentar por 5-10 min a 100 C
y, al cabo de este tiempo, dejar enfriar y asperjar
con volmenes iguales de hcl 2N y FeCl3 al 1% en
etanol. Aquellos compuestos con fluorescencia al
ultravioleta que luego de la aplicacin del reactivo
revelador exhiben coloracin anaranjada al visible
son considerados cumarinas. Una placa cromatogrfica adicional puede asperjarse con koh al 5%,
el cual acenta fuertemente la fluorescencia de estos compuestos al ser expuestos a la luz uv.
Lactonas sesquiterpnicas: Estos compuestos,
como su nombre lo indica, son terpenos con un esqueleto de 15 tomos de carbono, que tienen adems en su estructura una lactona. Para identificar
estos compuestos se hicieron dos cromatografas
en capa delgada (fase estacionaria: gel de slice
F254) eludas con una fase mvil compuesta por
cloroformo y acetona (9:1). Una de las cromatografas fue revelada para terpenos, como se indic
en el caso de los glicsidos cardiotnicos, y la otra
se derivatiz para lactonas con el reactivo de hidroxamato frrico, como se indic en el caso de
las cumarinas. Ambas pruebas deben ser positivas
para poder concluir que la muestra presenta este
tipo de metabolitos secundarios.
RESULTADOS
En la Tabla 1 se presentan los resultados obtenidos
luego de hacer el anlisis fitoqumico preliminar de
los tres rganos seleccionados de S. schultesiana.
DISCUSIN
En el presente anlisis fitoqumico preliminar de
hojas, tallos y semillas de la especie S. schultesiana se parti de extractos etanlicos puesto que este
solvente tiene la capacidad de extraer compuestos
de una amplia gama de polaridades, adems de ser
menos costoso y txico que otros solventes orgnicos. La metodologa seguida para este anlisis fue
la previamente estandarizada por Sanabria (1983),
y contempla la deteccin de los metabolitos secundarios generalmente relacionados con actividades
biolgicas.
A continuacin se presenta la discusin de los resultados consignados en la Tabla 1, en relacin a los
rganos de la especie S. schultesiana evaluados.
Con respecto a los alcaloides, fue el grupo de metabolitos secundarios ms abundante encontrado en
los tres rganos. Sin embargo, dado que la cantidad
de precipitado obtenido es proporcional a la concentracin de alcaloides en la muestra, puede inferirse que las hojas son el rgano de la planta donde
tiene lugar la mayor acumulacin de alcaloides,
aunque cabe aclarar que en tallos y semillas tambin se encuentran en concentracin apreciable.
Es conocido que las especies del gnero Strychnos
presentan una alta concentracin de alcaloides de
tipo indlico (estricnina, Yang & Yang 1993, Santos et al. 2006), los cuales son solubles principalmente en solventes de baja polaridad. Por este motivo, los extractos obtenidos con este tipo de solventes durante el proceso de purificacin (filtrados
A y B) presentaron una mayor concentracin de
alcaloides, tal como se muestra en la Tabla 1. Adems de alcaloides de tipo indlico, puede inferirse
la presencia de alcaloides de amonio cuaternario o
N-xidos de amina en las semillas y las hojas de
esta planta, puesto que se obtuvo resultado positivo
con el Reineckato de amonio, tanto en el extracto
inicial como en la fase ms polar del proceso de
purificacin, donde se encuentra concentrado este
tipo de alcaloides. Sin embargo, se deduce que
la concentracin de stos es muy baja, lo que se
evidencia en la reducida cantidad de precipitado
obtenido.
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Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)
Tabla 1. Resultados de los anlisis fotoqumicos preliminares de hojas, tallos y semillas de Strychnos schultesiana.
rgano
Metabolito
Alcaloides
Hojas
Tallos
Semillas
Filtrado A
+++
++
Filtrado B
+++
++
Filtrado C
++
Filtrado D
++
Capa acuosa 3
Capa Cloroformo
++
++
++
Flavonoides
++
++
++
Taninos
Saponinas
Glicsidos cardiotnicos
Cumarinas
Lactonas sesquiterpnicas
Nafto/Antraquinonas
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para el extracto de hojas, puede inferirse la presencia de saponinas en l, pues la prueba ms concluyente para la determinacin de saponinas es la de
hemlisis.
En cuanto a la deteccin de glicsidos cardiotnicos, ninguno de los esteroides observados tras revelar una de las placas con vainillina present coloracin violeta similar a la del patrn en la placa
revelada con la reaccin de Raymond, por lo cual
puede deducirse que la especie S. schultesiana no
contiene glicsidos cardiotnicos en hojas, tallos
ni semillas. Por su parte, el patrn de digitoxina
produjo coloraciones violetas, al ser revelado tanto
con el reactivo de vainillina en cido o-fosfrico
como con el de Raymond, tal como se esperaba.
Para la deteccin de cumarinas se emplearon tres
fases mviles, de las cuales aquella constituida por
tolueno-ter etlico (1:1), saturada con cido actico al 10%, permiti una mejor separacin de los
componentes de cada extracto, encontrndose as
una mancha fluorescente bien definida en el extracto de tallos, otra en el extracto de semillas y
cuatro en el de hojas; sin embargo, al revelar con la
reaccin del hidroxamato frrico, ninguna de ellas
present coloracin caf similar a la del patrn,
descartando as la presencia de cumarinas en los
extractos.
Para confirmar lo anterior, se asperj una de las
placas desarrolladas en acetato de etilo, con koh al
5%, con lo cual no se intensific la fluorescencia de
las manchas observadas, que incluso desapareci,
confirmando que no se trata de cumarinas sino de
otros compuestos poliinsaturados que pueden fluorescer tambin al uv.
Por otro lado, si bien los compuestos fluorescentes
presentes en semillas y hojas de S. schultesiana no
se colorearon tras revelar la placa con la reaccin
del hidroxamato frrico, los extractos de tallos y
semillas presentaron manchas de color caf que no
fluorescan al uv, lo que indica la presencia de lactonas. Sin embargo, al revelar con el reactivo de
vainillina, slo las lactonas presentes en el extracto de semillas poseen una parte terpnica que se
observa de color violeta, mientras que la mancha
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Anlisis fitoqumico preliminar de hojas, tallos y semillas de cupat (Strychnos schultesiana Krukoff)
CONCLUSIONES
Los resultados del anlisis fitoqumico preliminar
efectuado sobre la muestra de hojas de S. schultesiana Krukoff evidencian la presencia de alcaloides, taninos, flavonoides, saponinas, esteroides
y/o triterpenoides. Los tallos y las semillas de la
misma especie presentan alcaloides, flavonoides,
lactonas y esteroides. En estos rganos no se detect la presencia de saponinas ni taninos. Las semillas contienen lactonas terpnicas, mientras que
en los tallos se encuentran lactonas pero no de tipo
esteroidal. En ninguno de los rganos evaluados se
encontr la presencia de cumarinas ni glicsidos
cardiotnicos o antraquinnicos.
AGRADECIMIENTOS
A la Corporacin para el Desarrollo del rea del
Manejo Especializado la Macarena CORMACARENA, por la financiacin de este proyecto el
cual se desarroll en el marco del convenio 05 de
2001 suscrito con la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas.
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5/18/10 4:53:35 PM
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Mxico
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=61222302
Cmo citar?
Fascculo completo
Pgina de la revista
www.redalyc.org
Proyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
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RESUMEN
La especie nativa Cheilanthes glauca (Cav.) Mett., es usada en medicina popular en el
tratamiento tpico de heridas y contusiones. Un estudio del extracto metanlico total
demostr la presencia de antioxidantes en la fraccin extrada con acetato de etilo. De
esta fraccin se aisl dos flavonoides conocidos, quercetina-3-O-ramnoglucsido y
canferol-3,7-O-diramnsido. Ambos compuestos son descritos por primera vez en esta
especie. La determinacin estructural se llev a cabo mediante comparacin con
sustancias patrn, hidrlisis qumica, espectros UV, RMN-1H y 13C, COSY 1H-1H, DEPT y
MALDI-TOF MS. Slo quercetina-3-O-ramnoglucsido (rutina), demostr tener
actividad decolorante inespecfica in vitro sobre el radical DPPH.
PALABRAS CLAVES: Cheilanthes glauca,
Flavonoides, Rutina, Canferol, Antioxidantes.
RMN-1H,
RMN-13C,
MALDI-TOF
MS,
SUMMARY
Cheilanthes glauca (Cav.) Mett., is a native Chilean species used in popular medicine
for the topical treatment of wounds and contusions. A study on the total methanolic
extract showed the presence of antioxidants in the ethyl acetate fraction. From this
fraction, two known flavonol glycosides were isolated, quercetin-3-O-rhamnoglucoside
and kaempferol-3,7-O-dirhamnoside. Both substances are described for the first time
in this species. Structural elucidation was carried out by comparison with standard
substances, chemical hydrolysis, UV spectra, 1H- and 13C- NMR, COSY 1H-1H, DEPT and
MALDI-TOF MS. Only quercetin-3-O-rhamnoglucoside (rutin) showed unspecific in
vitro decolourizing activity upon DPPH radical.
KEY WORDS: Cheilanthes glauca, 1H-NMR,
Rutin, Kaempferol, Antioxidants.
13
INTRODUCCION
Cheilanthes glauca (Cav.) Mett. (Adiantaceae), es una especie nativa chilena conocida
como "Doradilla". Este helecho crece desde la cordillera central al sur del pas. En
medicina popular se emplea en forma tpica para curar heridas y en uso interno por
extractos reunidos fueron filtrados y concentrados al vaco (T < 40 C). El residuo (42
g), fue secado en capa delgada hasta una humedad de 3 % aproximadamente. Una
parte del extracto seco (15 g) se disolvi en 200 mL agua caliente y dej reposar por
12 horas en el refrigerador. El precipitado amarillo formado fue separado por
centrifugacin y posteriormente lavado varias veces con agua fra y finalmente con
ter etlico. Se obtuvo 0.93 g de polvo amarillo verdoso (CG-A). El remanente acuoso
(CG-B), fue extrado 5 veces con diclorometano. El extracto de diclorometano (EDCL)
fue secado a presin reducida (0.462 g). Se continu la extraccin con acetato de etilo
(x 5). El extracto de acetato de etilo (EAE) fue secado a presin reducida con un
rendimiento de 1.12 g y el remanente acuoso (EACUO) fue liofilizado (10.22 g).
Purificacin de la fraccin CG-A: El precipitado fue disuelto en metanol y sometido
a sucesivas separaciones en columna de Sephadex LH-20 (2,5 x 40 cm), usando
metanol como fase mvil. Como resultado se obtuvo un slo compuesto mayoritario
(CG-1), el cual fue purificado por cromatografa en capa fina preparativa (PTLC) sobre
gel de slice 60 PF254 (20 x 20 cm, 2 mm de espesor), usando acetato de etilo/cido
frmico/agua (9+1+1 v/v) como fase mvil. Finalmente la sustancia fue limpiada en
columna de Sephadex LH-20 (1 x 30 cm), usando metanol/agua 80 % como fase
mvil. Se obtuvo por cristalizacin al vaco desde metanol-agua, 452 mg de la
sustancia CG-1.
Actividad captadora de radicales libres: Para determinar la actividad captadora de
radicales libres se emple la reduccin del radical coloreado DPPH (1,1-difenil-2picrilhidrazilo). La actividad se expresa como concentracin efectiva 50 (EC 50), que es
la concentracin de la muestra requerida para disminuir la absorbancia del radical en
un 50 % comparado con una solucin blanco. Se prepar soluciones de los extractos
EDCL, EAE y EACUO desde 0,1 hasta 800 m g/mL. En la determinacin, 750 m L de las
muestras se mezclaron con 1,5 mL de la solucin de DPPH. La mezcla se dej reposar
5 minutos para luego leer la absorbancia a 517 nm. Para la obtencin de los resultados
se aplic regresin lineal a los datos entre 1 y 90 %. Como control positivo se us
quercetina (EC 50 = 5,15 g/mL).
Purificacin de EAE: EAE se disolvi en metanol y mezcl con 1 g de quitina. La
mezcla se sec a presin reducida y aplic sobre una columna de quitina (2,5 x 45 cm)
acondicionada con cloroformo. La muestra se separ por cromatografa en columna de
presin media (MPLC), usando gradiente de CHCl 3-CH3OH (0-100 % con incrementos
de 5 %). Se obtuvo dos compuestos mayoritarios que fueron purificados siguiendo el
mismo protocolo usado para la fraccin CG-A. El anlisis por CCF analtica permiti
establecer que uno de los compuestos corresponda al mismo CG-1 aislado del
precipitado CG-A, mientras que el otro se denomin CG-2(550 mg). Este ltimo fue
cristalizado al vaco, desde metanol agua (1:1).
La pureza de CG-1 y CG-2 fue controlada por HPTLC bidimensional (5 x 5 cm), usando
placas tratadas previamente con K2HPO4 0,1 M, y con la fase mvil acetato de
etilo/cido frmico/agua (9+1+1 v/v). Los cromatogramas fueron analizados a la luz
UV de 254 nm y 366 nm. Para deteccin especfica de grupos orto hidroxilados se uso
el reactivo de fluorescencia difenilboriloxietilamina (SIGMA). Adicionalmente, se
confirm la pureza por electroforesis capilar de alta eficiencia (HPCE), usando un
equipo PrinCE 450 Capillary Electrophoresis System conectado a un detector Lambda
1010 UV-Vis (Bishoff, Leonberg, Alemania). El tampn empleado fue un sistema tpico
para cromatografa micelar electrocintica (MEKC), tetraborato sdico decahidrato 10
mM y sodio dodecilsulfato 30 mM.
FIG. 1. Espectro MALDI-TOF MS de glicosilflavonoides aislados de Ch. glauca. (a) CG-1, Reflectron
Positive, potencia del lser 180 r.p.u., sin matriz. (b) CG-2. Reflectron Positive, potencia del lser
180 r.p.u., sin matriz.
En la modalidad Linear Positive, CG-1 mostr un ion molecular con m/z 630.8
generado por adicin de protn, correspondiente a [CG-1. H2O + 2H]2+. La seal
observada a m/z 323.4 correspondi al fragmento generado por adicin de un catin,
[quercetina + Na]+. La seal correspondiente a quercetina sola se encontr
a m/z301.3. En la modalidad Reflectron Positive se resolvi una seal de menor
intensidad de m/z 340.48 (354.1/1.04), que correspondi a [quercetina + K]+. Una
pico de intensidad muy dbil se apreci en la modalidad Reflectron Positive,
correspondiente al fragmento [ramnosa-glucosa]+. La sustancia fue comparada con un
patrn de rutina (Merck, Darmstadt, Germany) para el cual se obtuvo los espectros
MALDI-TOF-MS, encontrndose total coincidencia (datos no presentados).
En la modalidad Linear Positive, CG-2 mostr un ion molecular a m/z 618,7
correspondiente a [CG-2. H2O + Na]+. Una seal a m/z 596.7 correspondi a [CG-2 +
H2O]+, con un pico muy dbil a m/z 454.8 debido al fragmento [canferol-ramnosa +
Na]+. Un fragmento a m/z 329.6 se asign a la genina [canferol + 2Na]2+. El
fragmento de relacin m/z 307.1 correspondi a [canferol + Na]+ mientras que el
de m/z 285.6 a la genina. Finalmente el fragmento de m/z 164.1 correspondi a la
masa de ramnosa. No hubo indicios de un fragmento correspondiente a di-ramnosa, lo
que confirm lo indicado por los espectros de UV y RMN en DMSO-d6, que se tratara
de una sustitucin con dos residuos de ramnosa en C-3 y C-7, quedando libres los
hidroxilos en C-5 y C-4.
DISCUSION
De la fraccin ms activa de Ch. glauca se aisl dos sustancias de estructura tipo
flavonol. Se confirma que CG-1 corresponde al flavonoide rutina, uno de los
compuestos fenlicos ms corrientes en vegetales superiores. No obstante, su
presencia en Ch. glauca se desconoca hasta ahora. CG-2 fue identificado como
canferitrin (canferol 3,7-O-diramnsido), sustancia aislada por primera vez
en Indigofera arrecta (Leguminoseae). El compuesto tambin ha sido descrito en otras
leguminosas como Lespedeza cyrtobotrya, Lathyrus odoratus y Lotus corniculatus. Se
ha reportado su presencia en representantes de otras familias no relacionadas
como Tilia platyphyllos (Tiliaceae), Celastrus (Celastraceae) y Tagetes (Compositae)19).
El uso concomitante de ambos tipos de espectroscopa permite obtener mayor
informacin estructural. La RMN ha sido empleada durante muchos aos como tcnica
clave en la determinacin de las estructuras de un sinnmero de sustancias de origen
natural. MALDI, aunque conocida hace mucho tiempo, ha evolucionado rpidamente en
la ltima dcada. Esta tiene la ventaja comparativa sobre otras tcnicas indirectas, que
para obtencin de pesos moleculares no necesita derivatizacin de los glucsidos
altamente polares. Ambas tcnicas tienen la limitante de no entregar informacin
relacionada con la configuracin absoluta de la fraccin azucarada. Para dichos
estudios se requiere, si la cantidad de sustancia lo permite, la obtencin del poder
rotatorio, derivados diastereomricos, o el empleo de mtodos de correlacin como
HPLC, GC o HPCE con fases mviles o estacionarias quirales.
El ensayo posterior de ambos compuestos puros sobre DPPH mostr una actividad
importante slo para rutina. Este hecho ha sido probado en numerosos trabajos
empleando diferentes modelos de oxidacin 20). Se debe tener presente que una parte
importante de la rutina fue removida previamente en el precipitado CG-A, por lo que la
actividad de la fraccin EAE habra sido aun mayor si hubiese contenido toda la rutina.
En este ensayo, canferol 3,7-diramnsido no mostr un efecto importante. Sin
embargo, es preciso considerar que la ingestin de estas sustancias necesariamente
involucra aspectos metablicos que pueden llevar a la generacin de las geninas libres
canferol y quercetina, adems de algunos metabolitos biodisponibles. Mientras las
geninas poseen un importante efecto antioxidante in vivo, sus metabolitos
(principalmente cidos fenlicos, cinmico, fenilactico, benzoico, fenilpropanoico y
floroglucinol), poseen una actividad antioxidante atenuada e inespecfica21). La
EC50 (5,15 m g/mL) del control positivo quercetina (uno de los metabolitos de rutina),
obtenida bajo nuestras condiciones, es la ms baja de todas las muestras ensayadas.
Por lo anterior, se concluye que esta planta debe sus efectos beneficiosos, a la
presencia mayoritaria de flavonoides. Es sabido que los antioxidantes de plantas se
comportan de diferente manera dependiendo de agente oxidante que se emplee en el
ensayo22). Debido a esto, actualmente se estn realizando estudios para demostrar la
actividad antioxidante frente a otros radicales como el OH y O2 cuya produccin in
vivo es importante en diferentes procesos como el envejecimiento y la injuria celular.
Asimismo, una parte de los esfuerzos est puesta en la determinacin de la capacidad
antioxidante en sistemas ms complejos y de mayor importancia biolgica como las
lipoproteinas de baja densidad LDL. A lo anterior hay que sumar la determinacin
cuantitativa de este tipo de sustancias de la planta, la cual es necesaria para estimar si
el uso popular representa una real contribucin en la prevencin de patologas ligadas
a radicales libres.
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Artculo Cientfico
1
Instituto de Horticultura, Departamento de Fitotecnia, y 2Preparatoria Agrcola, Universidad Autnoma Chapingo. km 38.5 Carr. Mxico-Texcoco. 56230,
Chapingo, Edo. de Mxico. Tel. (01) 595 95 215 00 Ext. 5797. 3Programa de Botnica, Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo. km 36.5. Carr. MxicoTexcoco. 56230, Montecillo, Texcoco, Edo. de Mxico. 4Royal Botanical Gardens Kew. Richmond, Surrey, TW9 3AB, UK.
RESUMEN
La posible extincin de algunas especies no estudiadas como Calia
secundiflora (Ort.) Yakovlev significa la prdida del potencial que representa el conocimiento de sus metabolitos con propiedades medicinales y de inters agronmico. Los estudios fitoqumicos en C. secundiflora (Ortega) Yakovlev (Fabaceae) se han enfocado hacia los alcaloides, pero an se desconoce su perfil de flavonoides. Estos metabolitos
presentes en los vegetales se asocian con una capacidad antioxidante
natural, y que estudios epidemiolgicos han mostrado efectos benficos
para la salud humana. El objetivo de esta investigacin fue cuantificar
el contenido de compuestos fenlicos y flavonoides, as como identificar las estructuras de los flavonoides en hoja y evaluar el potencial
antioxidante de los extractos. La actividad antioxidante se evalu por
el mtodo de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) en muestras de una
zona del Estado de Hidalgo, Mxico. El anlisis por CL-EM permiti
identificar siete glicsidos en los flavonoles quercetina, isoramnetina
y kaenferol, no descritos previamente para esta especie. El contenido
de compuestos fenlicos totales (8.31 0.38 mg g-1 de MS) fue mayor al
de flavonoides (3.08 0.32 mg g-1 de MS). Estos resultados explican la
actividad antioxidante (CI50 = 88.54 0.15; 109.44 0.48 g mL-1) que
presentaron los extractos de hoja. La identificacin de estos flavonoides
puede contribuir a la quimiotaxonoma del gnero.
Palabras clave: Calia secundiflora, colorn, actividad antioxidante, flavonoides.
SUMMARY
The possible extinction of some non-studied species such as Calia
secundiflora might mean the loss of the knowledge about their metabolites with medicinal properties and agronomic interest. The phytochemical studies on C. secundiflora (Ort.) Yakovlev (Fabaceae) have
been focused on its content of alkaloids, but its profile of flavonoids
is still unknown. These plant metabolites have been associated to a
natural antioxidant capacity which are beneficial for human health
according to epidemiological studies. The objective of this research
was to quantify the contents of phenolic compounds and flavonoids,
as well as to identify the flavonoid structures in leaf and to evaluate
Recibido: 26 de Julio del 2010.
Aceptado: 14 de Marzo del 2011.
INTRODUCCIN
El cambio climtico ha producido numerosos cambios
en la distribucin y abundancia de las especies vegetales.
Los escenarios futuros predicen el riesgo de extincin de
algunas plantas (Thomas et al., 2004). Esto significa una
prdida del potencial que representa el conocimiento de
sus metabolitos con propiedades medicinales y de inters
agronmico. Por ello existe la necesidad de realizar estudios fitoqumicos y evaluar la actividad biolgica de plantas para identificar los principios activos en beneficio del
hombre, sobre todo de las especies que no han sido estudiadas. Adems, el estudio fitoqumico puede contribuir al
conocimiento taxonmico de las especies, como es el caso
de Calia secundiflora (Ort.) Yakovlev.
C. secundiflora (Ortega) Yakovlev (Fabaceae) se encuentra distribuida en frica, Amrica y Asia (Hatfiled et al.,
1977; Shulthes y Hofmann, 1982). En Mxico se localiza
en los Estados de Sonora, Chihuahua, Coahuila, Nuevo
Len, San Luis Potos, Tamaulipas, Zacatecas, Quertaro e
Hidalgo (Rzedowski, 1978; Aguilar y Zolla, 1982), donde
MATERIALES Y MTODOS
Recolecta del material vegetal
El material vegetal (hojas) se recolect aleatoriamente de
diversos ejemplares adultos en etapa de floracin (abril de
2007), de una poblacin ubicada en el transecto El CardonalSantuario, Municipio El Cardonal, Estado de Hidalgo,
Mxico. Este sitio se ubica en laderas con exposicin al SSE
y SE con pendiente de 40, en las coordenadas 20 36 LN y
99 07 LO, a 2130 msnm. La muestra (hojas) del Estado de
Quertaro tambin se recolect aleatoriamente en diversos
ejemplares adultos en etapa de floracin (mayo 2007), en
una poblacin ubicada en el transecto Vizarrn del MonteSan Joaqun, municipio de Cadereyta; este sitio se ubica a
2070 msnm, en las coordenadas 20 41 LN y 99 49 LO,
en laderas con exposicin al SE y pendientes de 45. Se
prepararon dos ejemplares de herbario que fueron identificados por el Dr. Mario Sousa del Instituto de Biologa
de la Universidad Nacional Autnoma de Mxico, con los
nmeros de registro 1155623 y 1155624. Las hojas de Calia
secundiflora se secaron a temperatura ambiente durante tres
semanas, y luego en una estufa a 45 C por 24 h; despus se
molieron en un molino Thomas-Wiley modelo 4 (PA.,
USA) con un tamiz del nmero 2.
152
Extraccin de flavonoides
El material vegetal (1 kg) se someti a un proceso de
extracciones exhaustivas (3 x 48 h) con metanol (MeOH),
seguido de una decantacin del disolvente, el cual se concentr a sequedad mediante vaco en un rotaevaporador
Bcki R-210 (Slawil, Switzerland) a 45 C. Se usaron 5 g
del extracto metanlico para hacer su particin con diclorometano: agua (5 x 5 mL). La fase acuosa se fraccion
con butanol (5 x 5 mL) y la porcin butanlica se concentr
a sequedad mediante vaco. La deteccin de flavonoides se
efectu en los extractos metanlico y butanlico por cromatografa en capa fina en gel de slice 60 F254 (Merck), y
como eluyente se utiliz una mezcla de butanol: cido actico: agua (BAW) en una proporcin de 40:10:50 % (v/v). Las
placas cromatogrficas se revelaron por aspersin sucesiva
de los reactivos NP (cido 2-amino-etil ster difenilbrico
a 1 % en metanol, p/v) y PEG (polietilenglicol 4000 a 5 %
en metanol, p/v). Las placas se visualizaron a una longitud
de onda de 365 nm. Se observ una fluorescencia de color anaranjado, caracterstica de los flavonoides (Wagner y
Bladt, 1996).
153
contenido de compuestos fenlicos corresponde a flavonoides, y que el resto podra estar constituido de procianidinas
u otros cidos fenlicos, como sucede en otras especies vegetales segn describieron Cui et al. (2006).
Entre regiones no hubo diferencias significativas en el
contenido de flavonoides en las muestras de las dos zonas,
pero s la hubo (P 0.05) en la concentracin de fenlicos,
aunque el contenido de fenlicos tendi a ser superior en
las muestras provenientes de la regin ms perturbada (Hidalgo). Al respecto, en un estudio comparativo de hbitat
de C. secundiflora en los Estados de Hidalgo y Quertaro,
Garca-Mateos et al. (2007) observaron un mayor contenido de alcaloides en las muestras de Hidalgo que en las
de Quertaro, lo cual asociaron al grado de perturbacin y
hbitat de la especie.
% DPPHrem=100 x DPPHrem/DPPHT=0
Anlisis estadstico
Se efectu un anlisis de varianza y la prueba de comparacin de medias (Tukey, 0.05) mediante el programa de
cmputo SAS Institute versin 8.0 (SAS Institute, 1999).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Cuantificacin de fenoles y flavonoides
De 1 kg de muestra seca se obtuvo un rendimiento de
10.23 % de extracto metanlico y 1.02 % de extracto butanlico. El fraccionamiento del extracto butanlico por cromatografa en capa fina preparativa permiti obtener 0.8
mg g-1 y 1.1 mg g-1 de materia seca en las fracciones 1 (Rf
= 0.26) y 2 (Rf = 0.40), respectivamente, ya que de acuerdo
con el anlisis preliminar por cromatografa en capa fina se
confirm cualitativamente la presencia de flavonoides.
C-3
C-7
1
8.53
918
i
Rha(12)[Rha-(16)]-Glc- Rha2 12.71
901
q
Rha(12)[Rha-(16)]-Glc- Rha3 14.75
885
k
Rha(12)[Rha-(16)]-Glc- Rha4 17.80
755
q
Rha(12)[Rha-(16)]-Glc-5 18.26
755
q
Rha(16)- GlcRha6 20.3
595
k
Rutinsido (Rha(16)- Glc-) -7 21.86
609
q
Rutina
-
I = isoramnetina; K = kaenferol; Q = quercetina. Rha = Ramnosa;
Glc = glucosa; Primer azcar unido al O-C3 de la aglicona que
corresponde al ltimo de cada fila.
No se encontraron estudios similares efectuados en especies de este gnero para poder realizar una comparacin.
Sin embargo, se infiere que una pequea proporcin del
154
R1
3
OH
4
R3 O
O
7
OR2
HO
Quercetina
3,3,4,5,7-pentahidroxiflavona
R1 = OH; R2 = R3 = H
Isoramnetina
3,4,5,7-tetrahidroxi-3-metoxi-flavona
R1 = OCH3; R2 = R3 = H
Kaenferol
3,4,5,7-tetrahidroxiflavona
R1 = R2 = R3 = H
La presencia de di-, tri- y tetraglicsidos de estos flavonoles no se han descrito en la C. secundiflora, especie en la que
se ha sealado la presencia de otros flavonoides. Shirataki
et al. (1997) describieron tres isoflavonoides aislados de la
raz de C. secundiflora. Por su parte, Tanaka et al. (1998)
detectaron ocho nuevos isoflavonoides en la raz de S. secundiflora, S. arizonica y S. gypsophila.
CI50
(g mL-1)
Extracto metanlico
109.443 0.482 c
Extracto butanlico
88.543 0.151 d
Fraccin 1
568.630 1.152 a
Fraccin 2
168.903 1.277 b
CI50 fue determinada como la concentracin requerida de las
muestra para inhibir en 50 % al DPPH en 30 min. Datos con la
misma letra son estadsticamente iguales (Tukey, 0.05). Despus
de cada valor se presentan el error estndar (n = 3).
Extracto
Actividad antioxidante
155
100
Extracto metanlico
Extracto butanlico
Fraccin 1
Fraccin 2
DPPH (%)
75
50
25
10
15
Tiempo (min)
20
25
30
Figura 2. Actividad antioxidante de los extractos y fracciones de C. secundiflora en relacin con la variacin de la concentracin de
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) remanente en funcin del tiempo.
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CONCLUSIONES
En las dos Estados muestreados, Hidalgo y Quertaro, el
contenido total de compuestos fenlicos en hojas de Calia
secundiflora fue mayor que el de flavonoides, aunque en las
muestras de Hidalgo tendieron a ser mayores, posiblemente
por ser una zona perturbada. Mediante el anlisis de CLEM se identificaron siete di-, tri- y tetra glicsidos descritos
por primera vez en esta especie. La presencia de glicsidos
en los flavonoles quercetina, isoramnetina y kaenferol, explican la actividad antioxidante encontrada en los extractos
y en las fracciones de flavonoides de hojas provenientes del
Estado de Hidalgo. Estos resultados pueden contribuir a la
quimiotaxonoma de C. secundiflora y al conocimiento fitoqumico de las especies mexicanas, y en la distribucin de
nuevos principios activos.
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