UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS

CARRERA DE INGENIERA BIOQUMICA
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
Profesor:
Prctica # 8
Ayudante: Sr. Juan Pablo Peafiel
Semestre:
08/08/2014

Ing.

Sptimo

Cecilia

Carpio

Bioqumica

OBTENCION DE ENZIMAS HIDROLTICAS BETA GLUCANASAS Y

QUITINANAS A PARTIR DEL HONGO Trichoderma
1. INTRODUCCIN
Las -1,3-glucanasas son protenas ampliamente distribuidas en plantas, varias
de las cuales han sido aisladas de tomate, pltano y tabaco, entre otras especies
(FUENTES Deyanira, et, al., 2006).
Los hongos pertenecientes al gnero Trichoderma secretan enzimas hidrolticas
que le permiten penetrar la pared celular de los hongos fitopatgenos. Las
glucanasas son enzimas que hidrolizan los b-glucanos de la pared celular de
fitopatgenos como Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani y Pythium sp. El objetivo
de este trabajo fue realizar la dinmica de induccin de glucanasas de diez
aislamientos de Trichoderma spp. Evaluando la actividad enzimtica especfica
de estas enzimas al primer, tercer, quinto y sptimo das, en los sobrenadantes
de los cultivos en tres medios lquidos distintos: medio basal, medio basal
suplementado con quitina al 0,5% y medio basal suplementado con gelatina al
0,2%. Los aislamientos 1, 13 y 17 alcanzaron los mayores niveles de actividad
enzimtica especfica glucanasa durante la induccin con el medio suplementado
con gelatina. El medio basal tambin result ser un buen inductor de estas
enzimas (GONZLEZ Ivonne, et, al., 2011).
2. OBJETIVOS
General
Extraer enzimas hidroliticas (-1,3-glucanasas y quitinasas) por medio de
un medio lquido que contiene hongos Trichoderma
Especficos
Utilizar el mtodo de Lowry para determinar la concentracin de las
enzimas aisladas.
Determinar que tipo de plagas y enfermedades pueden ser controladas
con este tipo de enzimas
3. MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES:
Botellas de tapa azul
Vasos de precipitacin
Varilla de agitacin
1

Papel filtro
Cepa de Trichoderma
Cmara de flujo laminar
Incubadora
Centrfuga
Autoclave

REACTIVOS
0.1% de bactopeptona
0.03% de urea
0.2% KH2PO4
MgSO4 7H2O 0.03%
CaCl2 6H2O 0.03%
1 ml de solucin de elementos traza 0,01% (Fe 2+, Mn2+, Zn2+, Co2).
0,02% de glucosa
quitina (0,5%)
Sulfato de amonio al 40%
Acetato de sodio 50 mM
Medio basal liquido (contiene extracto de levadura 1 g/L y peptona 4
g/L; medio suplementado con quitina 5 g/L y con gelatina al 0.2%).
4. PROCEDIMIENTO
Preparacin del medio liquido

Preparar 250 ml de medio liquido con:

0,1% de bactopeptona
o
0,03% de urea
o
0.2% KH2PO4
o
0,14% (NH4)2SO4
o
0,03% MgSO4 7H2O
o
0.03% CaCl2 6H2O
o
1 ml de solucin de elementos traza 0,01% (Fe 2+, Mn2+, Zn2+,
o
Co2+),0,02% de glucosa, pH 5,5; que contiene quitina (0,5%).

Induccin de -glucanasas en medio lquido

Inocular esporas de Trichoderma en los 250 ml de medio lquido antes

preparado
Incubar durante 72 horas a 28C, con agitacin (250 rpm).
Separar por filtracin a travs de papel filtro el sobrenadante del cultivo.

Purificacin de la enzima
Aadir (NH4)2SO4 al 40%
Mantener la mezcla con agitacin suave durante 15 min a 4C.
Centrifugar la suspensin 28800 rpm durante 30 min, y desechar los
sedimentos.
2

 Aadir sulfato de amonio al sobrenadante para obtener una solucin al

60%.
Agitar suavemente durante 15 min a 4C
Centrifugar.
Resuspender los sedimentos resultantes en un pequeo volumen de
acetato de sodio 50 mM a pH 5 y utilizar como preparacin de enzima
crudo.
Induccin de quitinasas en medio lquido
Para la induccin de protenas en el medio lquido utilizar compuestos con
diferente efecto inductor de las enzimas hidrolticas: medio basal lquido
que contiene extracto de levadura 1 g/L y peptona 4 g/L, medio basal
lquido suplementado con quitina 5 g/L y medio basal lquido
suplementado con gelatina al 0.2% (p/v).
Esterilizar los dos primeros medios a 120 C durante 20 min, mientras que
el medio que contiene gelatina esterilizar a 115 C durante 15 min.
Dividir los medios en frascos de 100 ml, a razn de 20 ml por frasco
Inocular con micelio de la periferia de la colonia pura de cada cepa.
Incubar en cultivo esttico a 28 C, en la oscuridad.
De cada tratamiento hacer tres replicas.
Retirar los frascos de la incubadora al primer, tercer, quinto y sptimo da
de la inoculacin.
Filtrar los sobrenadantes con papel filtro y conservar los extractos finales a
-20C.
5. RESULTADOS

Reportar en tablas el crecimiento del m.o as como fotografas.

Determinar las unidades de actividad de las b-glucanasas y/o quitinasas obtenidas.

6. DISCUSIN

Discutir los resultados comparando con bibliografa.

7. CUESTIONARIO
1.- Como actan las glucanas y quitinasas en el control biolgico
2.- Mencione algunos ejemplos de fitopatgenos que pueden ser controlados con
el uso de glucanas y quitinasas producidas por Trichoderma spp.
3.- Porque son usadas cepas de Trichoderma spp., como agentes de control
biolgico?

8. REFERENCIAS

FUENTES Deyanira, et. al., (2006). ENDO--1,3-glucanasas reconocidas

por anticuerpos tipo IgE de sueros de pacientes alrgicos. Disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/alergia/al-2006/al061d.pdf

GONZLEZ Ivonne, et, al., (2011). Caracterizacin bioqumica de

aislamientos de Trichoderma spp. promisorios como agentes de control
3

biolgico. ii. expresin de actividad glucanasa. Disponible

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S101027522011000100004.

en: