UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN

MARCOS
FACULTAD DE QUMICA E INGENIERA QUMICA
ESCUEL ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA
QUMICA

LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL

TRABAJO DE INVESTIGACION
RAYOS X Y FLUORESCENCIA
APLICACIONES

PROFESORA: ANGELICA RODRIGUEZ BEST

HORARIO: MIERCOLES
8-12 AM

FECHA DE REALIZACIN:
26/11/14

INTEGRANTES:

EDWARD VELIZ LA ROSA 12070172

ALVARO QUINTEROS SEDANO 1207019

FECHA DE ENTREGA:
27/11/14

Difraccin de rayos X. Introduccin

1. FUNDAMENTOS
1.1 Espectro electromagntico y Rayos X.
1.2 Estado cristalino.
1.3 Interaccin de los R-X con la materia. Difraccin.
1.4 Mtodos experimentales de difraccin.
2. EL DIFRACTMETRO CONVENCIONAL
2.1 Tubo de Rayos X.
2.2 Detectores.
2.3 Muestra y portamuestras.
2.4 Ventanas y monocromadores.
2.5 Cmaras de T y P variable.
3. PATRN DE DIFRACCIN DE MUESTRAS POLICRISTALINAS
3.1 Diagrama de difraccin de R-X.
3.2 Posicin de los picos de difraccin.
3.3 Intensidad de los picos de difraccin.
3.4 Perfil de los picos de difraccin.
3.5 Difraccin y sustancias amorfas.
3.6 Obtencin de datos:variables.
4. APLICACIONES DE LA DIFRACCIN DE RAYOS X.
4.1 Identificacin de fases.
4.2 Pureza de muestras.
4.3 Medida de tensiones.
4.4 Anlisis cuantitativo.
4.5 Determinacin de diagramas de fase.
4.6 Determinacin de estructuras cristalinas.
4.7 Estudio de texturas.
4.8 Difraccin de R-X a Temperatura variable.
4.9 Dispersin de rayos X a bajo ngulo.

1. FUNDAMENTOS
1.1 Espectro electromagntico y Rayos X
Los Rayos X se descubrieron en 1895 por el fsico alemn Rntgen y recibieron ese
nombre porque se desconoca su naturaleza en ese momento.
En 1912 se estableci de manera precisa la naturaleza de los rayos X. En ese ao se
descubri la difraccin de rayos x en cristales y este descubrimiento prob la naturaleza de
los rayos X y proporcion un nuevo mtodo para investigar la estructura de la materia de
manera simultnea.
Los R-X son radiacin electromagntica de la misma naturaleza que la luz pero de
longitud de onda mucho ms corta. La unidad de medida en la regin de los r-x es el
angstrom (), igual a 10-10 m y los rayos x usados en difraccin tienen longitudes de onda
en el rango 0.5-2.5 mientras que la longitud de onda de la luz visible est en el orden de
6000 .
El espectro contnuo. Los rayos X se producen cuando una partcula cargada
elctricamente con suficiente energa cintica es frenada rpidamente. Los electrones son
las partculas utilizadas habitualmente y la radiacin se obtiene en un dispositivo conocido
como tubo de rayos x

Los rayos x emitidos consisten en una mezcla de diferentes longitudes de onda y la

variacin de intensidad con depende del voltaje del tubo. La figura muestra el tipo de
curvas obtenidas. La intensidad es cero hasta cierta longitud de onda, llamada lim, aumenta
rpidamente hasta un mximo y entonces decrece sin un lmite abrupto en la parte de larga
longitud de onda. Esta radiacin se denomina radiacin continua o blanca, pues est
formada igual que ocurre con la luz blanca por muchas longitudes de onda.

El espectro caracterstico. Cuando el voltaje de un tubo de r-x supera cierto valor

crtico, aparecen picos estrechos y agudos a ciertas longitudes de onda superpuestos sobre
el espectro continuo. Dado que son picos estrechos y que la longitud de onda depende del
metal usado como blanco se denominan lneas caractersticas. Estas lneas se agrupan en
conjuntos denominados K, L, M, etc en orden de creciente y todas juntas forman el
espectro caracterstico del metal usado como blanco.
Normalmente solo las lneas K son tiles en difraccin, las de ms larga son absorbidas
con demasiada facilidad. Hay varias lneas en el conjunto K, pero slo las tres ms intensas
se observan en el trabajo de difraccin habitual: son K1, K2 y K1; para Mo las son
aproximadamente:
K1: 0.709
K2: 0.71
K1: 0.632
Las lneas de r-x caractersticas fueron sistematizadas por Moseley, ste encontr que la
longitud de onda de una lnea particular descenda conforme el n atmico del emisor
aumentaba. En concreto, encontr una relacin lineal entre la raz cuadrada de la frecuencia
y el n atmico Z:
= C(Z - )
donde C y son constantes.
Mientras que el espectro continuo tiene su origen en la deceleracin de los
electrones que inciden sobre el blanco de un tubo de r-x, el origen del espectro
caracterstico est en los tomos mismos del blanco. Para comprender este fenmeno es
suficiente considerar un tomo como un ncleo central rodeado por electrones formando
capas donde los trminos K,L,M... corresponden al n cuntico principal n=1,2,3.... Si uno
de los electrones que bombardean el blanco posee suficiente energa cintica puede arrancar
un electrn de la capa K dejando el tomo en un estado excitado de alta energa. Uno de los
electrones en niveles superiores cae inmediatamente en la vacante generada emitiendo
energa en el proceso; la energa emitida tiene una definida, es de hecho radiacin K.
1.2 Estado cristalino
Todos los materiales cristalinos adoptan una distribucin regular de tomos o iones
en el espacio. La porcin ms simple de la estructura que al repetirse mediante traslacin
reproduce todo el cristal se define como celda unidad.

Un nivel creciente de simetra origina relaciones entre los diferentes parmetros de

celda y da lugar a los 7 sistemas cristalinos.
Parmetros de celda unidad
abc
a b c = = 90 90
a b c = = = 90
a = b c = = = 90
a = b = c = = 90
a = b c = = 90 = 120
a = b = c = = = 90

Sistema cristalino
Triclnico
Monoclnico
Ortorrmbico
Tetragonal
Trigonal
Hexagonal
Cbico

La posicin de un tomo dentro de la celda unidad se describe normalmente usando

coordenadas fraccionarias. La simetra traslacional de una estructura cristalina se
caracteriza mediante la red de Bravais, existen 14 redes de Bravais diferentes. Estas redes
pueden ser:
- tipo P. Se denomina primitiva y tiene puntos de red en los vrtices de la celda.
- tipo I. Red centrada en el interior. Esta presenta puntos de red en los vrtices de la celda
y en el centro de la celda.
- tipo F. Red centrada en todas las caras. Presenta puntos de red en los centros de todas
las caras, as como en los vrtices.
- tipo C. Red centrada en la base. Una red tipo C se refiere al caso en el que la simetra
traslacional coloca puntos de red en los centros de las caras delimitados por las
direcciones a y b as como en el origen.
Adems de la simetra traslacional descrita en una red cristalina existen elementos de
simetra. Estos elementos son:
- centro de inversin
- plano de reflexin
- ejes de rotacin de orden 2, 3, 4 y 6.
- ejes de rotacin-inversin de orden 3, 4 y 6.
Los elementos de simetra anteriores pueden coexistir en una estructura cristalina dando
lugar a lo que se conoce como grupo puntual de simetra. Existen 32 grupos puntuales de
simetra y el nombre alude a que las operaciones asociadas forman un grupo matemtico y
los elementos tienen un punto en comn que no se mueve al realizar las operaciones.
Cuando se acoplan traslacin con los ejes de rotacin y planos de simetra surgen nuevos
elementos de simetra: ejes helicoidales y planos de deslizamiento.
Cuando se combinan los 32 grupos puntuales de simetra con los elementos de simetra
traslacional y las 14 redes de Bravais se obtienen los 230 grupos espaciales de simetra
posibles. Estos grupos determinan los tipos y posiciones de los elementos de simetra que
son posibles para una estructura cristalina.
Los puntos de red que muestran la simetra traslacional de una estructura pueden ser
conectados mediante los planos de red. Cada plano pertenece a un conjunto de planos
equiespaciados que contienen todos los puntos de red. Estos planos se nombran usando los
ndices de Miller. Estos ndices se designan convencionalmente h, k, y l se escriben entre

parntesis (h,k,l) y son enteros: positivos, negativos o cero. La separacin de los planos se
conoce con el trmino de espaciado dhkl. La relacin entre el espaciado d y los parmetros
de red puede determinarse geomtricamente y depende del sistema cristalino, las
expresiones son las que se presentan en la tabla, como se observa, tienen una complejidad
creciente al disminuir la simetra del sistema cristalino.

Sistema cristalino

Expresin para dhkl

Cbico

1/d2 = (h2 + k2 + l2)/a2

Tetragonal

1/d2 = (h2 + k2)/a2 + l2/c2

Ortorrmbico

1/d2 = h2/a2 + k2/b2 + l2/c2

Hexagonal

1/d2 = 4(h2 + hk + k2)/3a2 + l2/c2

Monoclnico

1/d2 = (1/sen2)(h2/a2 + k2sen2/b2 + l2/c2 2hlcos/ac)

Triclnico

Expresin compleja

1.3 Interaccin de los R-X con la materia. Difraccin.

La interaccin de los r-X con la materia esencialmente ocurre mediante dos
procesos:
a) Algunos fotones del haz incidente son desviados sin prdida de energa, constituyen la
radiacin dispersada exactamente con la misma que la radiacin incidente(es la que
origina el fenmeno de la difraccin).
b) Los fotones pueden sufrir una serie de choques inelsticos al incidir sobre un blanco y su
energa incrementa la T de la muestra o da lugar al fenmeno de fluorescencia.
Bajo qu condiciones el haz de r-x ser difractado? Un rayo difractado puede definirse
como un rayo compuesto de un gran nmero de rayos dispersados que se refuerzan
mutuamente. La difraccin es, por tanto, esencialmente un fenmeno de dispersin. Los
tomos dispersan la radiacin incidente en todas direcciones, y en algunas direcciones los
rayos dispersados estarn completamente en fase y por tanto se refuerzan mutuamente para
formar rayos difractados.

Los rayos dispersados estarn completamente en fase si esa diferencia de fase es igual a un
nmero entero n de longitudes de onda:
n = 2dsin
Esta relacin se conoce como Ley de Bragg y establece la condicin esencial que debe
cumplirse para que ocurra la difraccin; n se denomina orden de difraccin y debe ser un
nmero entero consistente con sin menor o igual que 1.
Aunque fsicamente no es un proceso de reflexin los trminos planos de reflexin y rayo
reflejado se usan con frecuencia para referirse a los planos de difraccin o rayos difractados
respectivamente.
En resumen, la difraccin es esencialmente un fenmeno de dispersin en el que cooperan
un gran nmero de tomos. Puesto que los tomos estn dispuestos peridicamente en una
red los rayos dispersados por ellos tienen unas relaciones de fase definidas entre ellos; estas
relaciones de fase son tales que en la mayora de las direcciones se produce una
interferencia destructiva pero en unas pocas direcciones se produce una interferencia
constructiva y se forman rayos difractados.
La dispersin de r-x por un tomo es la resultante de la dispersin por cada electrn. El
factor de dispersin atmico, f, de un tomo es por tanto proporcional al n de e- que posee
ese tomo. La diferencia de fase en la onda generada por 2 e- origina una interferencia
parcialmente destructiva; el efecto neto de interferencia entre los rayos dispersados por
todos los e- en el tomo origina un descenso gradual en la intensidad dispersada al aumentar
el ngulo 2.
La amplitud dispersada por una celda unidad se obtiene sumando la amplitud dispersada
por todos los tomos en la celda unidad, de nuevo la suma debe tener en cuenta la
diferencia de fase entre todas las ondas dispersadas.
1.4 Mtodos experimentales de difraccin.
Todo experimento de difraccin de r-x requiere una fuente de r-x, la muestra que se
investiga y un detector para recoger los r-x difractados. Dentro de este marco de trabajo
general las variables que caracterizan las diferentes tcnicas de r-x son:
a) radiacin, monocromtica o de variable
b) muestra: monocristal, polvo o pieza slida
c) detector: contador o pelcula fotogrfica
Las tcnicas de difraccin ms importantes son:
Longitud de onda

Muestra

Detector

Mtodo

Variable

Pieza slida

Pelcula

Laue
Rotacin
(Oscilacin)
Weissenberg
Precesin

Pelcula
Monocristal
Contador

Difractomtrico

Fija
Debye-Scherrer
Pelcula
Guinier
Polvo
Contador

Difractomtrico

Una muestra policristalina contiene una gran cantidad de pequeos cristales (de tamao entre 10-7 y
10-4 m) que adoptan aleatoriamente todas las orientaciones posibles. Algunos planos hkl en algunos de
los cristales estarn orientados, por casualidad, al ngulo de Bragg para la reflexin. Todos los planos de
un espaciado dhkl dado difractan al mismo ngulo 2 respecto al haz incidente de manera que todos los
rayos difractados se sitan en un cono de semingulo 2 respecto al haz incidente. Para cada conjunto de
planos se producir la difraccin a un ngulo de Bragg diferente dando lugar a una serie de conos de
difraccin.
El difractmetro de polvo usa un detector de r-x, tpicamente un contador Geiger o un detector
de centelleo. En la geometra Bragg-Brentano la fuente de r-x y el detector se colocan a igual distancia
y ngulo de la superficie de la muestra. El ngulo 2 se vara de forma continua.

En la figura se observa un difractograma tpico. Las intensidades se toman como alturas de los picos o
para trabajos de ms precisin las reas. Al pico ms intenso se le asigna un valor de 100 y el resto se
reescala respecto a ste.

2. EL DIFRACTMETRO CONVENCIONAL
2.1 Tubo de rayos X

Los r-x se generan en un dispositivo conocido como tubo de r-x cuyo esquema se representa en la
figura. Un generador convencional consiste de un ctodo con un filamento de W que emite e- que son
acelerados bajo vaco por un alto voltaje aplicado a lo largo del tubo(del orden de 30kV). El haz de
electrones incide sobre un blanco metlico, nodo o antictodo (habitualmente Cu o Mo y menos
frecuentemente Cr, Fe o Ag) y se emite el espectro de r-x descrito anteriormente.
ventana de Be
tubo de vidrio con vaco
Ctodo

En los generadores de nodo rotatorio, el rea donde golpean los e- se renueva continuamente porque el
nodo est rotando continuamente. En este caso se puede aplicar potencias ms altas y por tanto se pueden
obtener intensidades de r-X ms altas. Adems de los dispositivos anteriores, los rayos x como otros tipos
de radiacin electromagntica pueden generarse mediante fuentes de radiacin sincrotrn. Las ventajas
ms importantes de la radiacin sincrotrn es su amplio rango de longitudes de onda y su elevada
intensidad.
2.2 Detectores
Existen cuatro tipos de detectores: proporcionales, Geiger, de centelleo y semiconductores. Todos se
basan en la capacidad de los r-x para ionizar tomos, bien de un gas (proporcionales o Geiger) o de un
slido (centelleo o semiconductores).
Contadores proporcionales: Consisten en un cilindro metlico lleno con un gas que contiene un fino
alambre metlico (nodo) a lo largo de su eje. La mayor parte de los r-x que entra en el cilindro es
absorbida por el gas y esta absorcin va acompaada por la ionizacin del gas producindose electrones
que se mueven por la accin del campo elctrico hacia el nodo mientras que los iones positivos se
mueven hacia el ctodo obtenindose una pequea corriente elctrica.
Detectores de centelleo: En este tipo de detector la radiacin x se hace incidir sobre un material
fluorescente. El flash de luz producida pasa a un fotomultiplicador donde arranca
un nmero de electrones obtenindose al final un pulso del orden de voltios.
Detectores semiconductores: Se han utilizado tanto Si como Ge. Los r-x causan una excitacin
originando electrones libres en la banda de conduccin y huecos en la banda de valencia, manteniendo
un elevado voltaje entre las caras opuestas del cristal se crea un pequeo pulso en un circuito externo
que es amplificado hasta el orden de milivoltios.

Detector PSD: Este tipo de detector permite determinar la intensidad de varias lneas de difraccin de
manera simultnea. Es especialmente til en medidas a T variable en las que es necesario obtener el
difractograma en el menor tiempo posible.
2.3 Muestra y portamuestras. En un difractmetro convencional la muestra se mantiene en posicin
horizontal y se rota para minimizar los efectos de orientacin preferente y favorecer la orientacin de los

cristales al azar.
El portamuestras convencional tiene una profundidad de 1 mm y es adecuado para muestras del orden de
gramos. El porta de bajo fondo es un cristal de Si con una cavidad de 50 micras para pequeas
cantidades de muestra. El porta de retrocarga permite minimizar los efectos de orientacin preferente.
Tambin es posible el uso de capilares que permiten trabajar en transmisin.

El desplazamiento de la muestra respecto al eje del difractmetro es habitualmente la principal fuente

de error en la posicin de los picos de difraccin. El efecto habitual es un desplazamiento de los
picos a menor ngulo para valores de 2 bajos.
2.4 Ventanas y monocromadores
Con objeto de obtener una buena resolucin al mismo tiempo que una buena intensidad en un
difractmetro convencional se utilizan los siguientes dispositivos.
Ventana de divergencia: se coloca en el camino del haz incidente, antes de la muestra. Limitan la
divergencia del haz incidente y por tanto el rea iluminada en la muestra. Su principal funcin es
disminuir el background aunque a costa de disminuir la intensidad de los haces difractados.
Ventana de dispersin: se coloca inmediatamente despus de la muestra
Ventana del detector: se coloca antes del detector. Cuanto menor es su abertura mayor es la
resolucin obtenida pero menor la intensidad obtenida.
Ventanas Soller: consisten en un conjunto de finas placas metlicas paralelas al crculo del
difractmetro. Estas placas eliminan una gran proporcin de rayos inclinados respecto al plano
del crculo del difractmetro.
Monocromador secundario: el ms utilizado es de grafito. Consisten en un cristal orientado de
manera que la difraccin se produce nicamente para una determinada. Debe ser mecnicamente
resistente, la intensidad difractada debe ser elevada para reducir la prdida en lo posible, el carcter
de mosaico debe ser pequeo para reducir la divergencia. La superficie se curva para enfocar el haz
difractado en un rea pequea. El efecto sobre el difractograma es disminuir el background, elimina
la seal debida a la K y disminuye la anchura de los picos.

Monocromador secundario
Ventana de divergencia

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Ventana del detector

Ventanas Soller

2.5 Cmaras de T y P variables

Tambin es posible obtener datos de difraccin de r-x variando las condiciones de T y/o P. En estos casos
es especialmente importante el registro de los picos de difraccin de la manera ms rpida posible para
lo que son especialmente adecuados los detectores tipo PSD.
Entre las aplicaciones de este tipo de equipos se encuentran el estudio de reacciones qumicas, transiciones
de fase, estudio de disoluciones slidas, expansin trmica, crecimiento de grano entre otras.

3. PATRN DE DIFRACCIN DE MUESTRAS POLICRISTALINAS

3.1 Diagrama de difraccin de rayos X.
Un difractograma de r-x recoge los datos de intensidad en funcin del ngulo de difraccin
(2) obtenindose una serie de picos. Los datos ms importantes obtenidos a partir de un difractograma
son los siguientes:
- posicin de los picos expresada en valores de , 2, d q = 1/d2.
- intensidad de pico. Las intensidades se pueden tomar como alturas de los picos o para trabajos de ms
precisin las reas. Al pico ms intenso se le asigna un valor de 100 y el resto se reescala respecto a ste.
- perfil de pico. Aunque se utiliza menos que los anteriores la forma de los picos tambin proporciona
informacin til sobre la muestra analizada.
3.2 Posicin de los picos de difraccin.
Qu determina las posibles direcciones, es decir los posibles ngulos 2, en los que un cristal produce un
haz de r-x difractado? Se obtendr un haz difractado para el conjunto de planos (100), por ejemplo,
cuando el haz incidente sobre l satisfaga la Ley de Bragg. Pero la difraccin puede producirse tambin en
los planos (110), (111), etc. Es necesaria una relacin general que prediga el ngulo de difraccin para

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cualquier conjunto de planos; esta relacin se obtiene combinando la Ley de Bragg y la ecuacin para el
espaciado aplicable al cristal particular de que se trate. Por ejemplo para el sistema cbico:
1/2 = (h2 + k2 + l2)/a2
= 2dsen
sen = /2d
sen2 = (2/4a2) (h2 + k2 + l2)
Esta ecuacin predice para una longitud de onda particular y un cristal cbico particular con arista de
celda unidad a los ngulos a los que puede producirse la difraccin.
Las direcciones a las que un haz de dada es difractado dependen del sistema cristalino al que
pertenece el cristal y de sus parmetros de red. Es decir, las direcciones de difraccin estn determinadas
nicamente por la forma y tamao de la celda unidad.
3.3. Intensidad de los picos de difraccin.
La intensidad de los picos de difraccin es la segunda caracterstica fundamental de un diagrama de
difraccin.
Hay seis factores que influyen en la intensidad relativa de las lneas de difraccin:
- factor de polarizacin
- factor de estructura --- factor de multiplicidad
- factor de Lorentz
- factor de absorcin factor de Temperatura
Factor de polarizacin: Aunque los electrones dispersan los r-x en todas direcciones la intensidad del haz
dispersado depende del ngulo de dispersin, la intensidad es mxima en la direccin del haz incidente y
mnima en la direccin perpendicular a la incidente.
Factor de estructura: La dispersin de r-x por un tomo es la resultante de la dispersin por cada electrn.
El factor de dispersin atmico, f, de un tomo es por tanto proporcional al n de e- que posee ese
tomo. Adems, la amplitud dispersada por una celda unidad se obtiene sumando la amplitud dispersada
por todos los tomos en la celda unidad, de nuevo la suma debe tener en cuenta la diferencia de fase
entre todas las ondas dispersadas. La intensidad del haz difractado en la direccin que predice la Ley de
Bragg es proporcional al cuadrado del mdulo del factor de estructura.

Factor de multiplicidad: Consideremos por ejemplo la reflexin 100 de una red cbica. En una muestra
policristalina algunos de los cristales estarn orientados de manera que se produzca la difraccin 100.
Otros cristales de diferente orientacin pueden estar en una posicin tal que las difracciones 010 001
ocurran. El espaciado d100 = d010 = d001 y por tanto forman parte del mismo cono de difraccin. El factor
de multiplicidad, p, se define como el nmero de permutaciones de posicin y signo de h,k,l para
planos que tienen los mismos valores de d y F2.
Factor de Lorentz: Incluye ciertos factores trigonomtricos que influyen la intensidad del haz
difractado. En primer lugar la intensidad difractada es mxima al ngulo de Bragg exacto pero todava es
apreciable a ngulos ligeramente desviados del ngulo de Bragg.
El segundo factor geomtrico surge debido a que la intensidad integrada de una reflexin a cualquier
ngulo de Bragg depende del nmero de cristales orientados a ese ngulo. Ese nmero no es constante
aunque la orientacin de los cristales sea aleatoria.
El tercer y ltimo factor geomtrico tiene en cuenta el hecho de que para ngulos bajos o prximos a 180
se recoge una fraccin de cono mucho mayor que alrededor de 2 = 90 afectando por tanto a la intensidad
de la reflexin con un factor de 1/sen 2B.
Los tres factores anteriores se combinan para dar el llamado factor de Lorentz:
Factor de Lorentz = (1/sen 2)(cos )(1/sen 2) = cos /sen2 2 = 1/4sen2 cos
ste a su vez se combina con el factor de polarizacin para dar el factor de polarizacin- Lorentz:
Factor de polarizacin-Lorentz = (1 + cos2 2)/(sen2 cos )

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El efecto global de estos factores geomtricos es disminuir la intensidad de las reflexiones a ngulos
medios respecto a las de ngulos prximos a 0 180.
Factor de absorcin: Tiene en cuenta el efecto de la atenuacin de la intensidad conforme la radiacin
atraviesa la muestra.
Factor de Temperatura: Los tomos no ocupan posiciones fijas en la red sino que estn sometidos a una
vibracin trmica alrededor de sus posiciones de equilibrio. La agitacin trmica disminuye la intensidad
de un haz difractado ya que degrada la periodicidad de la red en la que se basa la Ley de Bragg.. Este
descenso en la intensidad es mayor a ngulos altos que a bajos y se incluye en el clculo de intensidades
mediante el factor de temperatura, e-2M. Cualitativamente, e-2M disminuye al aumentar 2.
M = B(sen /)2
Todos los factores anteriores dan lugar a la siguiente ecuacin para las intensidades relativas de las
lneas de un patrn de difraccin:
I = |F|2p{(1 + cos2 2)/( sen2 cos )}e-2M
3.4. Perfil de los picos de difraccin.
La anchura y la forma de los picos de los picos de un difractograma son el resultado de la combinacin de
factores instrumentales y de factores basados en la microestructura de la muestra.
El perfil de lnea instrumental se origina en el carcter no estrictamente monocromtico, la divergencia del
haz, la anchura de las ventanas, etc.
La contribucin de la muestra al ensanchamiento de los picos se debe fundamentalmente a dos factores:
tamao de cristal y tensiones.
3.5. Difraccin y sustancias amorfas.
Un solo tomo dispersa un haz incidente de r-x en todas las direcciones del espacio pero un gran
nmero de tomos ordenados de manera peridica en tres dimensiones formando un cristal dispersan
(difractan) los r-x nicamente en unas pocas direcciones. Lo hacen as debido a que la ordenacin
peridica de los tomos origina una interferencia destructiva de los rayos dispersados en todas direcciones
excepto en aquellas que predice la Ley de Bragg.
Los slidos amorfos tienen estructuras caracterizadas por una ausencia de periodicidad y slo se mantiene
el orden de corto alcance. El resultado es una curva de dispersin de r-x mostrando uno o dos mximos
con una anchura que puede llegar a los 10.
3.6 Obtencin de datos:variables.
En un experimento ordinario de difraccin es necesario controlar o establecer los valores de los siguientes
parmetros:
La potencia del tubo (que a su vez influir en la intensidad de difraccin) se determina mediante la
corriente de tubo, es decir el flujo de electrones del filamento al blanco, y mediante el voltaje de tubo, es
decir el voltaje aplicado a los electrones que golpean el nodo.
Tambin es necesario seleccionar la apertura de las ventanas de divergencia, dispersin y del detector.
Estas ventanas influyen en la intensidad, la resolucin y el background del difractograma.
Adems de lo anterior es necesario establecer los parmetros de medida. El intervalo de barrido se
determina mediante los ngulos inicial y final, el tamao de paso afecta principalmente a la resolucin, en
general a menor tamao de paso mayor resolucin; por ltimo el tiempo de paso influye en la relacin
intensidad/ruido.

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4. APLICACIONES DE LA DIFRACCIN DE RAYOS X.

4.1 Identificacin de fases.
Una fase cristalina dada siempre produce un patrn de difraccin caracterstico, bien est en estado puro o
como constituyente de una mezcla. Este hecho es la base para el uso de la difraccin como mtodo de
anlisis qumico. El anlisis cualitativo se realiza mediante la
identificacin del patrn de esa fase. Para la identificacin cualitativa se usa la Powder
Diffraction File, esta base de datos contiene datos de d-I adems de informacin cristalogrfica y
bibliogrfica para gran cantidad de fases crist. de materiales inorgnicos, minerales, productos
farmacuticos, etc.

4.2 Pureza de muestras.

En una mezcla de compuestos cada fase cristalina presente va a contribuir al patrn de difraccin de r-x
global. En qumica preparativa de materiales esto puede utilizarse para identificar el grado de avance de
una reaccin y la pureza del producto.
La difraccin de r-x tambin puede utilizarse para identificar impurezas, bien sean reactivos que no han
reaccionado completamente o subproductos de reaccin. Sin embargo esto tiene una limitacin: la
impureza debe ser cristalina, adems la capacidad para detectar una impureza depende de la capacidad de
sta para dispersar la radiacin y eso depende de Z.
4.3 Medida de tensiones.
Cuando un grano se somete a una tensin uniforme perpendicular a los planos de de difraccin el
espaciado se har mayor que d0 (espaciado en ausencia de tensin) y, segn se deduce de la ley de Bragg,
el pico de difraccin se desplaza a un ngulo ms bajo. Si la tensin no es uniforme hay zonas con
espaciado mayor que d0 y zonas con espaciado menor que d0 producindose un ensanchamiento del pico
de difraccin que es el resultado observado experimentalmente. En la prctica el stress se determina a
partir de la posicin
2 de una nica reflexin midiendo el espaciado a diferentes valores de (diferentes orientaciones de la
muestra).
4.4 Anlisis cuantitativo.
Los mtodos de anlisis cuantitativos basados en la difraccin de r-x pueden clasificarse en dos grandes
grupos: mtodos que emplean picos seleccionados y mtodos que utilizan todo el difractograma.
Dentro de los mtodos basados en picos seleccionados se encuentran:

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- mtodo de difraccin-absorcin: se basa en la relacin de intensidades de un pico en la fase pura y en

la mezcla. Requiere el conocimiento de los coeficientes de absorcin de la fase pura y de la mezcla, si no
se conocen es posible preparar una curva de calibrado.
X = ( Iij/Iij )(/0j) donde i hace referencia al pico y j a la fase.
- mtodo de la adicin stndard: en la mezcla debe existir una fase de referencia (i) con un
pico no solapado con ningn pico de la fase a analizar (j). La metodologa consiste en la adicin de una
cantidad conocida de fase pura j, cj.

Iij/Iii = K(cj + cj) donde Iij/Iii es la relacin entre las reas integradas de los picos
seleccionados para la fase analizada y la referencia, K es la pendiente de la recta de Iij/Iii
frente a la cantidad aadida y cj es la fraccin en peso de j inicial.
- mtodo del stndard interno: en este mtodo la intensidad integrada de un pico de la fase
analizada se compara con la intensidad de un pico de una fase aadida en proporciones conocidas.
Iij/Iis = k(cj/cs) donde s hace referencia al estndar
El material usado como estndar debe cumplir una serie de requisitos: qumicamente estable, sin
picos solapados con la fase analizada, sin orientacin preferente, etc.
La ecuacin anterior es la base del mtodo de la relacin entre reas integradas relativas
(Reference Intensity Ratio, RIR). ci =
(IiIjrelcj)/(IjIirelRIRi,j)
Los valores para el parmetro se obtienen mediante calibracin o calculados a partir de otros RIR.
Dentro de los mtodos que utilizan todo el difractograma se encuentran:
- mtodo de descomposicin del difractograma. Se basa en la separacin del difractograma en los
difractogramas individuales de cada componente de la mezcla, una vez separados se asignan las reas
integradas a cada componente y se aplican las metodologas anteriores.
- mtodo de Rietveld. En este caso se considera el difractograma total como la suma de los patrones
individuales de cada fase y se extrae la informacin sin separar en componentes. Es necesario conocer la
estructura cristalina de las fases componentes y se minimiza la diferencia entre el difractograma
experimental y el calculado:
R = wi|Yi(o) - Yi(c)|2
donde Yi(o) e Yi(c) son la intensidad observada y calculada respectivamente en el punto isimo del conjunto de datos. La informacin cuantitativa de cada fase se obtiene de los valores de los
factores de escala.
4.5 Determinacin de diagramas de fase.
La difraccin de r-x junto con el anlisis trmico y la microscopa son las tcnicas ms utilizadas para
establecer los diagramas de fase.
Consideremos por ejemplo una aleacin formada por dos metales A y B con dos soluciones slidas
terminales y ambas cbicas centradas en las caras y una fase intermedia cbica centrada en el
cuerpo. La determinacin del diagrama de fases mediante rayos-x normalmente comienza con la
determinacin de los equilibrios a T ambiente. El primer paso es preparar una serie de aleaciones de
composicin (8 en el ejemplo de la diapositiva) conocida a las que se deja alcancen el equilibrio con un
enfriamiento lento y se registra el patrn de difraccin de r-x.
Una vez determinado el diagrama a T ambiente para el estudio a elevada T se deja que la aleacin alcance
el equilibrio a esa T y se enfra rpidamente, entonces se registra el patrn de difraccin a T ambiente. En
algunos casos las fases estables a alta T no son estables al enfriar y hay que utilizar cmaras de alta T
para registrar el patrn in situ.

15

4.6 Determinacin de estructuras cristalinas

El proceso de determinacin de una estructura mediante DRX comienza con la toma de datos con
suficiente precisin en un intervalo amplio de 2. La siguiente etapa es el indexado, los programas ms
habituales para llevar a cabo el indexado son ITO, TREOR y DICVOL entre otros. La siguiente etapa,
ajuste de perfil, permite asignar intensidades, forma y anchura de picos, background; existen dos
tcnicas diferentes: el mtodo de Le Bail y el mtodo de Pawley. Una vez obtenidas las intensidades de
las reflexiones es necesario obtener una aproximacin inicial de la estructura, para ello se pueden emplear
mtodos tradicionales como los de Patterson o directos as como mtodos basados en el espacio directo.
Por ltimo se realiza el refinamiento de la estructura utilizando el mtodo de Rietveld en el que se
minimiza la diferencia entre la intensidad calculada y la medida experimentalmente.
4.7 Estudio de texturas.
Cada grano en un agregado policristalino normalmente tiene una orientacin cristalogrfica diferente de la
de sus vecinos. Considerado como un todo las orientaciones de todos los granos pueden estar
aleatoriamente distribuidas o pueden tender a agruparse, en mayor o menor grado alrededor de una o
varias orientaciones particulares. Cualquier agregado caracterizado por esta condicin se dice que posee
orientacin preferente o textura. La orientacin preferente puede tener una gran influencia sobre las
intensidades de los picos de difraccin.
La orientacin preferente es un fenmeno muy frecuente, en metales, materiales cermicos, pelculas
semiconductoras y recubrimientos en general entre otros. De hecho, la presencia de orientacin
preferente es la regla habitual, no la excepcin.
Las texturas ms frecuentes son en forma de fibras o en forma de lminas. En la textura fibrosa en la
mayora de los granos la misma direccin cristalogrfica [uvw] es paralela o casi paralela al eje del
alambre. En el caso de la textura en lminas la mayora de los granos estn orientados con cierto plano
cristalogrfico (hkl) aproximadamente paralelo a la superficie de la lmina y una direccin en ese plano
[uvw] aproximadamente paralela a la direccin en la que se aplan la lmina.
La mayora de las texturas laminares, sin embargo, slo pueden describirse mediante la suma de un
nmero de orientaciones ideales o componentes de textura; esto slo puede hacerse mediante una
descripcin grfica tal como la figura de polo.
El uso de las figuras de polo para representar texturas puede ilustrarse mediante el siguiente
ejemplo: supongamos una lmina de un metal cbico que contiene slo 10 granos y la orientacin de esos
granos es conocida. Las orientaciones de esos 10 granos pueden resumirse representando las posiciones de
los polos {100} en una nica proyeccin estereogrfica con el plano de proyeccin paralelo a la superficie
de la lmina. Puesto que cada grano posee tres polos {100} habr un total de 30 polos
representados en la proyeccin. Si los granos tienen una orientacin completamente aleatoria esos polos
aparecern uniformemente distribuidos sobre la proyeccin. Sin embargo, si existe orientacin preferente
los polos tendern a agruparse en ciertas reas de la proyeccin dejando otras vacas.

16

Para determinar experimentalmente la textura de un material se fija la posicin de tubo y detector (2)
para estudiar una reflexin (hkl) determinada. A continuacin se analiza la muestra movindola para
recoger la intensidad de toda la esfera.
4.8 Difraccin de R-X a Temperatura variable.
La DRX puede realizarse sometiendo la muestra a un programa de T controlado. De esta manera es
posible realizar estudios como los siguientes.
- Seguimiento del grado de avance de una reaccin qumica.
- Seguimiento de transiciones de fase.
- Estudio de disoluciones slidas.
- Determinacin de coeficientes de expansin trmica.
- Estudios de crecimiento de grano.
4.9 Dispersin de rayos X a bajo ngulo.
La dispersin de r-x a bajo ngulo (SAXS) es una tcnica analtica empleada para la caracterizacin
estructural de materiales en el rango de los nanmetros. La muestra es irradiada con un haz de r-x
monocromtico y a partir de la distribucin de intensidades a muy bajo ngulo es posible obtener
informacin sobre tamao o distribucin de tamaos de partculas, forma de partculas y estructura
interna.
Esta tcnica se emplea en partculas con un tamao comprendido entre 0.5 y 50 nm en materiales tales
como: cristales lquidos, pelculas de polmeros, microemulsiones, catalizadores, protenas, virus etc.

2d sin = n

or

d = n/2sin

Small angles (< 5o ) give information on large

structures 1 to 100nm

El equipo necesario para realizar este tipo de anlisis tiene diferencias notables respecto a un
difractmetro convencional. Normalmente se trabaja en transmisin. Es necesario un haz de r-x muy
fino de manera que pueda ser interceptado sin bloquear la intensidad dispersada, una mayor distancia de la
muestra al detector permite que se separe el haz dispersado del incidente y disminuye el background. Es
necesario tambin que exista vaco desde la fuente de r-x hasta el detector, adems se utiliza un detector
PSD.

17

5. APLICACIONES A LA CARACTERIZACIN DE POLMEROS

5.1. Determinacin de la estructura cristalina
Las estructuras cristalinas de polmeros se determinan empleando los mtodos usuales de rayos X, aunque
la interpretacin de los resultados experimentales es mucho ms difcil que en el caso de cristales de
molculas ms simples. Las razones de esta dificultad son varias, en primer lugar, para la mayora de los
polmeros, no pueden obtenerse grandes cristales con la suficiente perfeccin, eliminndose as la
utilizacin de un nmero de tcnicas difractomtricas modernas. En segundo lugar, debido al dbil enlace
en ciertas direcciones, la intensidad disminuye rpidamente con 2, y el anlisis debe efectuarse basndose
solamente en unas pocas reflexiones y perdiendo as precisin. Por ltimo, la localizacin exacta de los
grupos laterales, dentro de la red cristalina, tiene un efecto pequeo en las intensidades difractadas,
reduciendo la sensibilidad de la tcnica.
Debido a todas estas dificultades, lo que se hace normalmente, es disear un modelo estructural terico,
obtener por ordenador su diagrama de difraccin y compararlo con el obtenido en la muestra a estudiar.
Una vez que se consigue una semejanza razonable, se hace un refinamiento posterior, para obtener la
conformacin de la cadena y la posicin de los tomos y grupos laterales. La determinacin de la
estructura cristalina completa requiere una gran especializacin y se emplea solamente al sintetizarse un
nuevo polmero cristalino, aunque el diagrama de difraccin de una muestra puede usarse como mtodo de
identificacin del polmero del que se trate.
En algunos casos, la difraccin de rayos X se emplea para obtener informacin en ciertos sistemas
polimricos muy interesantes desde el punto de vista prctico. Por ejemplo, si tenemos una mezcla de
polmeros (blend) puede haber una separacin de fases de los dos polmeros que lo constituyen. Si uno o
ambos cristalizan, puede ser estudiado por rayos X. En mezclas de polietileno y polipropileno se pueden
detectar picos de difraccin correspondientes a cristales de ambos polmeros, indicando que existe una
separacin de fases.
Otro ejemplo de la aplicacin de rayos X al estudio de sistemas polmricos, lo constituye el caso de
muestras polimrficas, en la que el polmero puede cristalizar en varias formas cristalinas. Este hecho
se puede relacionar con las condiciones de cristalizacin, incluyendo las del procesado de un polmero
comercial, o con una posterior modificacin del material por diferentes procedimientos. Por ejemplo, el
polietileno ortorrmbico se puede transformar en su modificacin monoclnica mediante una
deformacin mecnica, y este hecho puede ser puesto de manifiesto por difraccin de rayos X. Otra
propiedad muy importante es la determinacin del grado de orientacin de los cristales en un polmero
microcristalino. Esta orientacin tiene una profunda influencia en las propiedades del material. Por
ejemplo, una buena orientacin, paralela a la direccin de aplicacin de una fuerza externa, puede generar
una alta resistencia del material a la ruptura. La gran resistencia de las fibras de nylon se puede atribuir, en
parte, a este efecto. La cristalografa de rayos X provee una forma conveniente para la estimacin de este
efecto.
5.2. Grado de cristalinidad
El grado de cristalinidad de un polmero semicristalino se puede determinar mediante el anlisis de la
intensidad de la radiacin de rayos X dispersada por la muestra. Para la medida de la intensidad es ms
conveniente utilizar un sistema detector difractomtrico que una cmara fotogrfica. En la Figura se
muestra la intensidad de la radiacin obtenida en una muestra de polietileno. Como vemos en la figura a
existen dos picos, que corresponden a las reflexiones de los planos de tomos (110) y (200), de los
cristales ortorrmbicos del polmero. Estos picos son bastante anchos y existe una gran cantidad de
radiacin a valores de alejados de los mismos. Esto es debido a la dispersin por todo el material presente,
incluyendo las zonas amorfas.

18

Figura a.- Difractograma de un polietileno de alta densidad.

Se puede suponer que la dispersin producida por un tomo es la misma, tanto si forma parte del cristal
como si se encuentra en una zona amorfa. Las intensidades debidas a los tomos del cristal se suman,
sumando una interferencia constructiva y dando lugar a un pico que satisface la condicin de Bragg. En las
zonas amorfas, la dispersin tiene lugar en todas direcciones, obtenindose interferencias constructivas
muy dbiles y dando lugar a un pico muy difuso. Por ello la figura h consta de una zona amorfa difusa y
unos picos debidos a las zonas cristalinas.
El grado de cristalinidad puede entonces relacionarse con estas dos zonas del diagrama de difraccin,
suponiendo que la relacin entre la cantidad de material cristalino y amorfo es igual a la relacin de la
intensidad total (integrada) de la parte cristalina y amorfa del diagrama. As, la fraccin de cristalinidad, c,
viene dada por la ecuacin:

donde s=(2sen/), I(s) es la intensidad total dispersada, Ic(s) es la intensidad correspondiente a las zonas
cristalinas e Ia, la de las zonas amorfas.
Debido a que la ecuacin anterior es simplemente una relacin de intensidades, no tiene dimensiones y
no es necesario conocer el factor correspondiente a la conversin de rea a intensidad de rayos X.
La mayor dificultad de este procedimiento es que, muchas veces, es difcil separar las intensidades
correspondientes a ambas zonas. Solamente cuando se conoce bien la curva de la parte amorfa es posible
obtener buenos resultados, ya que puede sustraerse de la curva total y obtener la correspondiente a las
reflexiones del cristal.
5.4. Difraccin de rayos X a ngulo bajo (SAXD)
Dentro de una muestra slida, los rayos X son dispersados primariamente por los electrones. Los efectos de
difraccin se correlacionan con la disposicin de los tomos, ya que la densidad electrnica est
ntimamente relacionada con las posiciones de los mismos. Sin embargo, puede haber variaciones en la
densidad electrnica a una escala mucho ms amplia. Si estas variaciones son peridicas, pueden dar lugar
a mximos de difraccin del mismo modo a como se dan en redes peridicas de tomos. Sin embargo,
generalmente, la periodicidad no es tan regular como la de una red cristalina y los efectos de difraccin
son menos precisos y ms difciles de interpretar cuantitativamente. Estos efectos se estudian con la
tcnica de difraccin de rayos X a ngulo bajo.
En el caso de polmeros, existen varias estructuras con variaciones de densidad electrnica de este tipo. En
primer lugar, los polmeros semicristalinos a menudo poseen estructuras de laminillas. Estas laminillas son
regiones generalmente ms densas que las regiones no cristalinas y, por lo tanto, poseen una densidad
electrnica ms alta. El grosor de estas laminillas es del orden de 10 30 nm y, al estar generalmente
apiladas, constituyen una estructura peridica si las laminillas se organizan en forma de esferulitas. Las
regiones entre las laminillas son amorfas y de ms baja densidad, dando tambin lugar a una variacin
peridica de la densidad electrnica, que corresponde al dimetro de la espferulita (del orden de 1-1000
m).

19

Otro ejemplo de estudios de este tipo son los copolimros de bloque. Estos sistemas, a veces, se separan en
dos fases, formando una de ellas estructuras ordenadas (laminillas, cilindros, esferas, etc.), dentro de una
matriz continua del otro componente. Las dos fases generalmente tienen diferente densidad
electrnica y pueden caracterizarse por SAXD.
Por ltimo, la tcnica es muy til en el estudio de defectos estructurales y superficies de ruptura de
materiales polmeros.
Utilizando la ecuacin de Bragg, es posible estimar el rango del ngulo de difraccin en estos sistemas. As
el orden de magnitud de la periodicidad de una estructura de laminillas es d = 20 nm. Si utilizamos rayos X
correspondientes a la radiacin Cu K (=1.542 ), obtenemos = 0.22. Como vemos es un ngulo muy
pequeo y por ello es necesario un sistema experimental diferente.

MTODOS DE ANLISIS POR DIFRACCIN DE RAYOS X

Mtodo del polvo cristalino
Es el mtodo ms general y sus aplicaciones son muy variadas; puede citarse por ejemplo, la identificacin
de sustancias cristalinas, as como el anlisis cuantitativo de stas, el estudio de soluciones slidas
metlicas, estudio de texturas, determinacin del tamao de los cristalitos, determinacin de coeficientes
de dilatacin trmica, estudios de compuestos y reacciones a alta y baja temperatura, etc.
Este mtodo tambin es utilizado para aplicaciones de tipo ms especficamente cristalogrficas, como
pueden ser la asignacin de ndices a las reflexiones y la determinacin de los parmetros de celda, que
en algunos casos sencillos conducen a la resolucin de la estructura cristalina.
Ya se vio el tipo ms sencillo de aparato para observar la difraccin de rayos X. Los rayos X de una
sola longitud de onda chocan con una muestra constituida por un polvo o agregado policristalino. Esta
muestra debe estar integrada por un nmero muy elevado de pequesimos fragmentos cristalinos
idealmente desorientados al azar unos respecto a otros, de forma tal que no exista ningn tipo de
correlacin en la orientacin. La muestra se sita sobre una plataforma giratoria. Se detecta la radiacin
difractada por la ionizacin que ella produce en la cmara D. Cuando se coloca la muestra a un ngulo
arbitrario con respecto al rayo X incidente, muy poca radiacin difractada alcanza el detector, ya que es
posible que a este ngulo no haya plano de la red cristalogrfica que satisfaga la condicin de Bragg, para
que haya una intensidad difractada mxima. Sin embargo, a medida que se hace rotar la muestra, algunos
grupos de planos eventualmente llegan a estar alineados a un ngulo que satisface la ecuacin de Bragg,
y una seal fuerte aparece en el detector. A medida que se va rotando la muestra, esta seal desaparece,
pero a otro ngulo puede aparecer otra seal de difraccin cuando una nueva serie de planos de la red
satisfaga la ecuacin de Bragg. Como muestra la red de la figura b, hay muchas series de planos paralelos
en una malla, y as la radiacin difractada se observa desde muchos ngulos. Sin embargo, slo los
planos de la red que contienen un gran nmero de tomos reflejarn los rayos X apreciablemente, por
lo cual en la prctica se observa solamente la difraccin de los planos reticulares ms importantes.
En la figura c se muestra el diagrama de difraccin (difractograma) de una muestra de cobre, obtenido
con un difractmetro de rayos X.

20

PARTE EXPERIMENTAL
Preparacin de muestras
Para estudios de difraccin de rayos X, la muestra cristalina se muele hasta obtener un polvo fino
homogneo. De esta manera, el enorme nmero de pequeos cristales est orientado en todas las direcciones
posibles; y por tanto, cuando un haz de rayos X atraviesa el material, se puede esperar que un nmero
significativo de partculas est orientado de tal manera que cumpla la condicin de Bragg para la reflexin
de todos los espaciados interplanares posibles. Las muestras se colocan en tubos capilares de paredes finas
de vidrio o de celofn y estos se introducen en el haz. Alternativamente, se puede mezclar la muestra con un
soporte adecuado no cristalino y moldearla dndole una forma adecuada.
Identificacin de sustancias cristalinas
La identificacin de especies a partir de su figura de difraccin de polvo cristalino se basa en la posicin
de las lneas (en trminos de o 2) y de sus intensidades relativas.
Lectura de un difractograma
Con una regla milimetrada se mide el ngulo 2 (eje de abscisas) de cada reflexin, as como su intensidad
(altura), colocando ambos valores en una tabla de 5 columnas. En la tercera columna de la tabla se colocan
los valores de espaciado dhkl obtenidos, a partir de los valores de 2, mediante la expresin de Bragg (2d sen
= n para obtener los difractogramas se ha empleado radiacin K de Cu, = 1,5405 ). En la cuarta
columna se colocan los valores de las intensidades relativas, obtenidas como porcentaje de la ms intensa.
Con los valores de espaciado de las tres reflexiones ms intensas se consultan las fichas ASTM o tablas que
se tengan a mano, viendo cual es la que ms se ajusta a nuestra sustancia problema y confirmando con el
resto de las reflexiones medidas. En general Las fichas de consulta (datos bibliogrficos, ASTM, etc.)
constan de las siguientes reas de informacin:

Una vez conocida la sustancia problema y su ficha se pueden colocar en la quinta casilla de la tabla los
valores de (hkl) de los planos que han dado lugar a los mximos de difraccin. Con los valores de espaciado
de las reflexiones ms intensas y sus valores de (hkl), se puede calcular el parmetro de celda medio
mediante la expresin (en el caso de celdas cbicas)

21

con el parmetro de celda a se calcula el volumen de la celda unidad

V = a3
asi como el factor de empaquetamiento
f.e. = (vol. tomos celda unidad) / (vol. celda unidad)
y conociendo la masa atmica o molecular del compuesto (M), su densidad
= (n at. celda unidad x M) / (vol. celda unidad x N Avogadro)
A partir de los difractogramas obtenidos para las muestras problema con el difractmetro:
a) Sustancias puras:
i) Leer el difractograma e identificar mediante las fichas ASTM adjuntas de qu sustancia se trata.
ii) Decir a qu planos cristalogrficos corresponde cada una de las reflexiones que se encuentran en el
difractograma y dibujarlos en las correspondientes celdas unidad.
iii) Calcular el volumen, el factor de empaquetamiento y la densidad de la celda unidad, una vez que se
conoce su simetra.
b) Mezclas
iv) Leer el difractograma e identificar mediante las fichas adjuntas de qu sustancias se trata.

22

LA MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA Y SU APLICACIN

EN EL DIAGNSTICO DE BACTERIAS FITOPATGENAS
INTRODUCCIN
La microscopa de fluorescencia se basa en los mismos principios de ptica de la
microscopa comn, con diferencias en el manejo y el diseo relacionadas con la generacin
y transmisin de longitudes de onda adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar,
ya sean propios de la muestra o de la coloracin utilizada. Los procesos de excitacin
generalmente requieren longitudes de onda cortas en el UV cercano (lmpara de halgenocuarzo, arcos de mercurio, etc.). El objetivo que suele utilizarse es el de inmersin en aceite,
ya que produce una mayor ampliacin. El aceite de inmersin proporciona un medio ptico
homogneo al paso de la luz entre la preparacin y el lente frontal del objetivo.
La tcnica serolgica de fluorescencia fue introducida en 1947 por Coons con el empleo de
beta-antraceno, un compuesto fluorescente, conjugado con antisuero antineumocccico.
Poco despus un grupo de cientficos emple un antisuero conjugado con fluorescena que
permita la identificacin de los complejos inmunes de forma ms eficaz. Es una tcnica
muy utilizada en el campo de la medicina para el diagnstico de una gran variedad de
padecimientos, entre los que se encuentran influenza, toxoplasma, identificacin de
anticuerpos anti-DNA y rabia, entre otros. En la dcada del ochenta del pasado siglo se
demostr su aplicabilidad en el diagnstico de las bacterias fitopatgenas, y hoy es una de
las tcnicas ms utilizadas en este campo.

23

FUNDAMENTO, VENTAJAS, VARIANTES Y USO DE LA TCNICA DE

INMUNOFLUORESCENCIA
El fundamento de la tcnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes, denominados fluorocromos, en fijarse a los anticuerpos mediante
un enlace qumico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccin
inmunolgica. Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales, como algunas
vitaminas, esteroides, porfirinas, etc. Otros compuestos que fluorescencia rodamina,
auramina, fluorescena, colorantes de acridina se utilizan en distintas tcnicas de tincin,
como la tincin de microorganismos cido-resistentes con auraminarodamina en muestras de
tejido y esputo. La inmunofluorescencia conjuga la observacin de la morfologa con la
especificidad inmunolgica, evidencia tanto los grmenes vivos como los muertos y requiere
solamente de pequeas cantidades de antgeno (Ag), lo que permite evidenciar cantidades
mnimas de Ag aun en un medio complejo de grmenes no cultivables, as como investigar
anticuerpos (Ac) con Ag difciles de preparar. Adems, empleando la tcnica se pueden
revelar Ac llamados incompletos, que no precipitan, no aglutinan y no fijan el complemento.
La inmunofluorescencia permite identificar un Ag con la ayuda de un inmunosuero conocido
e investigar y titular un Ac con la ayuda de un Ag conocido. Existen dos formas principales
de inmunofluorescencia: directa e indirecta. En la variante directa el Ag se fija directamente
a un Ac homlogo conjugado previamente con un fitocromo. Por tanto, se requieren
antisueros marcados para cada bacteria [Klement et al., 1990], lo que hace que el mtodo,
aunque es ms especfico, hoy sea menos utilizado. Con la inmunofluorescencia indirecta
(IFI) se logra poner en funcin un nico antisuero marcado, comn para cualquier Ag
bacteriano que se logra mediante la inmunizacin de una cabra u oveja, con la
inmunoglobulina de un conejo sano, de donde se obtiene un complejo inmunolgico de Ac
anti-inmunoglobulina de conejo. Este complejo se marca con fitocromo (FITC) y puede
reaccionar por tanto con cualquier Ac de conejo como si se tratase de un Ag. La observacin
al microscopio de fluorescencia puede efectuarse sobre un portaobjeto diseado
especialmente para esta tcnica o bien sobre una membrana de 0,2 m sobre la cual se ha
fijado la bacteria y que se coloca en un portaobjeto comn que sirve de soporte
[Brlansky,1990]. Tambin se conoce el mtodo de la inmunofluorescencia de tincin de
colonias para la deteccin sensible y cuantitativa de bacterias cultivables. Est basado en una
combinacin de aislamiento en placas con serologa para el reconocimiento de colonias
especficas. Los antisueros empleados por esta tcnica son marcados por lo general con
fluorocromo, lo que permite la identificacin de las colonias especficas a travs de la
observacin en un microscopio de fluorescencia. Mundialmente la inmunofluorescencia, en
su variante indirecta, es la tcnica serolgica utilizada con ms frecuencia para el
diagnstico de bacterias fitopatgenas debido a su rapidez y sensibilidad [Van Vuurde et al.,
1983; Van Vuurde, 1985; Klement et al., 1990], y ha sido estandarizada para detectar
24

diversas bacterias en semillas gmicas [Malin and Roth, 1983; Van Vuurde et al., 1983;
Trigalet and Bidaud, 1978; Van Vuurde et al., 1983] y el diagnstico de infecciones latentes
y caracterizacin serolgica de subspecies de Erwinia carotovora en tubrculos de papa
[Gorris et al., 1994; Alarcn et al., 1995], entre otros. Igualmente constituye el mtodo ms
fiable para el diagnstico de infecciones de Ralstonia solanacearum y Clavibacter
michiganensis pv. sepedonicus latentes en tubrculos de papa [De Boer y Copeman, 1980;
Miller, 1984], con lmites de deteccin de 103-104 cl./mL de precipitado de extracto de
papa [Janse Caruso et al.,1998; Seal, 1998].
APLICACIN DE LA INMUNOFLUORESCENCIA EN EL DIAGNSTICO DE
BACTERIAS FITOPATGENAS EN CUBA
La inmunofluorescencia ha adquirido una gran aceptacin para el diagnstico de un gran
nmero de bacterias. Es el mtodo serolgico ms utilizado por el servicio de cuarentena en
Cuba para la deteccin de patgenos bacterianos cuarentenados. Est incluida en los
esquemas de trabajo de la Comunidad Econmica Europea para Ralstonia solanacearum
[EPPO, 1997] y en el Protocolo del Servicio de Proteccin de Plantas de Canad para el
diagnstico de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus [De Boer y Mc Kenzie, 1996],
que forma parte del sistema diagnstico de ambas bacterias en semillas de papa importadas
en Cuba. El estudio de la tcnica aplicada a anlisis de papa a gran escala confirma su
sensibilidad para detectar alrededor de 103 a 104 ufc/mL de pellet resuspendido, con
solamente 1,52% de reacciones falso positivas que no constituyen un obstculo para el
diagnstico. La tcnica permite el anlisis de 20 muestras por da, estada que se ajusta
bastante a la exigencia de un anlisis cuarentenario confiable y rpido [Albornoz et al.,
2004]. Con anterioridad, Stefanova (1998) haba sealado que fue posible diagnosticar con
la IFI las poblaciones de R. solanacearum de 105 ufc/mL en ciento por ciento de los
tubrculos de papa contaminados. En el caso de Pseudomonas siryngae pv. tomato, bacteria
igualmente cuarentenada en Cuba, segn los datos expuestos en la estandarizacin de la IFI
para la deteccin del patgeno en semillas de tomate [Prez et al., 2004], es posible con la
tcnica diagnosticar la presencia de hasta 0,2% de infeccin en aproximadamente diez mil
semillas en 5 g de muestra. Dicho de otra forma: la IFI permite la deteccin de P.s. tomato
en lotes de semillas de tomate donde existe entre 0,2-0,1% de semillas infectadas para un
nivel de deteccin de 103-104 ufc/mL. El nivel bajo de contaminacin por esta bacteria
presente en los lotes de semillas es un problema para la deteccin por mtodos tradicionales,
como es el ensayo de crecimiento en cmara hmeda, por lo que la introduccin de esta
tcnica bajo el procedimiento establecido sin duda beneficia el anlisis en frontera. Con la
introduccin de la IFI se hace tambin posible el anlisis de las muestras de semillas de
tomate que contienen poca cantidad, y se ajustan los parmetro de acuerdos al peso de la
muestra.

25

Amat y Larrinaga (1992) pusieron a punto la IFI para Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria en semillas de tomate artificialmente infectadas, y a continuacin
demostraron su uso prctico en semillas de produccin. Con la estandarizacin de la IFI para
el diagnstico de Pseudomonas cichorii [Amat y Garca, 1997] en semillas de tomate y
pimiento se logr detectar el patgeno hasta concentraciones de 103 ufc/mL en semillas
artificialmente infectadas y muestras de produccin procedentes de campos de las provincias
de Pinar del Ro y La Habana. La eficacia de la tcnica super el recobrado de la bacteria en
el medio de cultivo KB enmendado con 300 ppm de oxacilina sdica. Los parmetros del
mtodo ajustados para Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis en semillas de
tomate [Miguel et al., 2000] sealaron la capacidad de deteccin del patgeno hasta el nivel
de 1% de infeccin en las muestras. La siembra en el medio semiselectivo KBT [Dhavantari,
1987; Chaveau, 1992] en este caso se hace necesaria como prueba complementaria del
diagnstico debido a la sensibilidad (0,1%) y el escaso crecimiento de saprfitos. Con las
estandarizaciones anteriores se completa, mediante un PNO implantado en el Laboratorio
Central de Cuarentena Vegetal, un paquete tecnolgico de diagnstico de las bacterias que
afectan al cultivo de tomate y que se transmiten por semilla. Para ello se emplea un mtodo
nico de extraccin [Prez et al., 2004]. La IFI se considera un mtodo de diagnstico
adecuado para detectar Clavibacter xyli subsp. xyli, agente causal del raquitismo de los
retoos de caa de azcar [Pazos et al., 1988]. Mediante centrifugacin a 14 000 g durante
30 min los autores lograron detectar la presencia de ese patgeno en el jugo de plantas
enfermas y estimar concentraciones de 4 x 108 cl./mL. Con resultados satisfactorios para
detectar concentraciones entre 103 y 104 cl./g de semilla de col y cebolla se recomienda la
IFI para la deteccin de X. c. pv. Campestris y X. c. pv. allicola respectivamente [Amat et
al., 1994].

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AVANCES EN LA APLICACIN DE LA MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA

En el transcurso de la ltima dcada, la microscopa de fluorescencia convencional
aprovech el aumento de la memoria y la velocidad de procesamiento de las computadoras.
Esto, junto al desarrollo de sistemas de registro digital de imgenes de alta calidad, de
fuentes de iluminacin lser potentes y estables, de sistemas pticos corregidos y de nuevas
molculas fluorescentes capaces de marcar procesos celulares especficos, ha dado lugar a
novedosas tcnicas como la Microscopa de Desconvolucin Digital (MDD), la
Microscopa Lser Confocal (MLC) y la Microscopa de Excitacin Bifotnica (M-2F).
Estos nuevos procedimientos permiten obtener imgenes tridimensionales de procesos y de
la distribucin de molculas especficas en clulas vivas por medio de la utilizacin de
tcnicas no invasivas. Otra aplicacin importante de la microscopa de fluorescencia es la
medicin de la concentracin intracelular y de los cambios que sufre como consecuencia de
estmulos de algunos iones (molculas con carga elctrica), como el calcio (Ca2+), el in
hidrgeno (H+), el cloruro (Cl-), el sodio (Na+) y el potasio (K+). Un ejemplo es el uso de
sustancias que actan como indicadores fluorescentes de la concentracin de Ca2+ (el Quin2 y el Fura-2). Ambas son capaces de unir fuertemente al in Ca2+. Cuando estn libres de
Ca2+ se excitan a longitudes de onda ligeramente ms largas que cuando se hallan unidas al
Ca2+. Al medir la proporcin de intensidad de la fluorescencia en las dos longitudes de onda
de excitacin, es posible determinar qu proporcin de la concentracin del indicador libre
corresponde al indicador que se ha unido al Ca2+. A partir de esto es posible medir con
precisin la concentracin de Ca2+ intracelular libre y de sus variaciones en funcin del
tiempo [Shotton, 1993]. La observacin de sustancias fluorescentes mediante el microscopio
ptico, junto a los avances tecnolgicos de los microscopios y de las computadoras, han
dotado a los bilogos de procedimientos que permiten estudiar cada vez con ms detalles y
precisin la distribucin en el espacio y en el tiempo de componentes celulares, lo que
complementa y ampla de modo espectacular la informacin proporcionada por los mtodos
tradicionales de microscopa ptica y electrnica. Estos avances marcan la nueva era de la
microscopa de fluorescencia [Adur et al., 2001].

Yuliet Franco Cardoza Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/
5a. B y 5a. F, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11600, c.e.: mstefanova@inisav.cu

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