Resultados Prctica 4.

Anabel Milln Leiva

PRCTICA 4: Localizacin subcelular y caracterizacin del

transportador de alta afinidad de glucosa Snf3p

La protena Snf3p, codificada por el gen SNF3 de Saccharomyces cerevisiae, es un

transportador de membrana de glucosa que se sintetiza en condiciones de baja concentracin de
glucosa, por su alta afinidad a ella. En concentraciones de glucosa altas no se precisa de la actividad
transportadora, y la transcripcin del gen es reprimida por la presencia de glucosa.
Estudiaremos la localizacin celular de la protena Snf3p. Esta protena no presenta
actividad enzimtica que permita su deteccin y cuantificacin. Para facilitar la deteccin
disponemos de genes fusin con la -galactosidasa. La secuencia ORF del gen lacZ (codifica la
-galactosidasa) se inserta contigua a la del gen SNF3 en pauta y sin codon de stop entre ellas; de
ese modo la transcripcin esta mediada por promotor del gen SNF3; se transcribir en un slo RNA
mensajero, y en la traduccin se producir una protena con las dos unidades proteicas unidas, que
presentar ambas actividades.
La -galactosidasa es una actividad no presente en clulas de levadura, por lo que no
interfiere la actividad de la clula en la medida, que podra pasar si se utilizase otro gen presente en
S. cerevisiae. La -galactosidasa es de fcil deteccin utilizando ONPG y puede ser cuantificando
por espectofotometra, midiendo la OD a 420 nm (explicado en la prctica 3).
Se dispone de 2 genes fusin con diferencia en el gen SNF3:
Fusin A (cepa C) : presenta el gen Snf3p completo (797 de los 884 aminocidos)
Fusin B (cepa 3) : Slo codifica para 3 aminocidos del gen Snf3p
Imagen 4.1: Estructura del gen SNF3 salvaje y los genes fusin en la cepa 3 y C.

Estos genes fusin se encuentran en plsmidos YEp24 y se han introducido en levaduras. La

cepa C contiene el gen fusin con SNF3 completo, y la cepa 3 con el gen delecionado.

Resultados Prctica 4.

Anabel Milln Leiva

Estudiaremos la represin de la transcripcin del gen SNF3 por parte de la glucosa, y la

localizacin celular de la protena de fusin.
Para las condiciones de represin se dejaran crecer los cultivos en alta concentracin de
glucosa (2%). Para la desrepresin, se pasaran una alcuota de entre 3 y 5 unidades de DO600 a
medio con baja concentracin de glucosa (0,1%).
Esquema de la prctica:

Estandarizaremos la concentracin de clulas de las reacciones usando unidades de

DO600 para que todos los grupos trabajen con la misma cantidad de clulas. La actividad de la galactosidasa tambin se calcula dependiendo de la DO600, para corregir la actividad en funcin de
la concentracin celular.

Resultados y conclusiones.
Medida de la densidad ptica del cultivo en represin:
- Cepa 3:

Clulas
reprimidas

OD600 = 0.156
1 unidad

Cogimos 6 mL

5 unidades

Cogimos 15 mL

1 unidad = Volumen (mL) x DO 600

Vol = 6,4 mL

0,936 unidades
Vol = 32 mL

2,34 unidades
Clulas
desreprimidas

1 unidad 6, 41 mL

Cogimos 3 mL

0,468 unidades

Resto 12 mL = 1,872 unidades

Resultados Prctica 4.
- Cepa C:
Clulas
reprimidas

Anabel Milln Leiva

OD600 = 0,658

1 unidad

Cogimos 1,5 mL

Vol = 1,6 mL

5 unidades

0,987 unidades
Vol = 7,6 mL

Clulas
desreprimidas

1 unidad 1,52 mL

Cogimos 1,5 mL 0,987 unidades

Resto 6,1 mL = 4,67 unidades

Actividad = OD420 x 1000 / OD600 x V(mL) x t (min)

Tabla 4.1: Valores de actividad de todos los grupos
2% glucosa: Clulas reprimidas
Cepa C

3,2

6,4

5,9

Cepa 3

1,5

1,6

4,75

1,62

0,1% glucosa: Clulas desreprimidas

Cepa C

44

116

55,7

47,5

60,1

72

Cepa 3

9,7

20

14,9

14,5

4,4

65,88

12,22

Los valores tachados no se han tenido en cuenta para el calculo del valor medio, ya que hay
una alta probabilidad de que sean causa de error, porqu no puede haber mayor actividad en estado
reprimido que despus de la desrepresin.
Se puede considerar los valores de actividad -galactosidasa en las clulas reprimidas causa
de la transcripcin basal, o como ruido de fondo del mtodo de anlisis. Este se debe restar a los
valores calculados para obtener el incremento de actividad para cada cepa en cada condicin.
Tabla 4.2: Valores medios de actividad corregidos.
2% glucosa: Clulas reprimidas
Cepa C

Cepa 3

0,1% glucosa: Clulas desreprimidas

Cepa C

61,13

Cepa 3

10,60

Resultados Prctica 4.

Anabel Milln Leiva

En ambas cepas se observa un aumento en la actividad cuando el cultivo se pasa a

condiciones de desrepresin. La actividad registrada en condiciones de represin del gen por
glucosa es debida a la transcripcin basal del gen, o al ruido de fondo del mtodo de anlisis. Sin
embargo, si fuera causa del mtodo experimental los valores serian similares entre las 2 cepas; y se
puede observar, que tanto en condiciones de represin como desreprimidas el nivel de transcripcin
es mayor en cepas C. La causa de esta diferencia en la expresin del gen no la conocemos.
Se mide la actividad en las muestras de clulas lisadas; las de sedimento, que se
corresponden a las membranas celulares, y las del sobrenadante, donde quedaran las protenas
solubles citoplasmticas. La rotura de las clulas por perlas de vidrio es un mecanismo de rotura
fsico que mantiene la estructura de las membranas, no como los mtodos qumicos que la
hidrolizan.
Tabla 4.3: Valores de actividad en Sedimento (membranas) y Sobrenadante (citoplasma)
Cepa C

Cepa 3

Sedimento

Sobrenadante

Sedimento

Sobrenadante

25

17

2,9

25

3,8

21

0,8

14

5,9

22

0,6

11

16

13

0,6

13

10,6

19

0,33

5,6

35

12

1,1

23

25,33

14

1,055

15,27

Hay un error en la medida de los valores de las clulas desreprimidas. Las muestras de la
cepa C presentaban color amarillo antes de introducir el reactivo ONPG. Puede ser causa de que el
tampn Z estuviera contaminado con trazas de ONPG, y la reaccin de hidrlisis del ONPG por la
-galactosidasa haya comenzado antes. Estas muestras presentaban color amarillo antes de
introducir el reactivo ONPG. El ONP, substancia con color amarillo, es soluble y en la
centrifugacin se quedara en el sobrenadante. Por ello los valores de actividad obtenidos para el
sobrenadante de la cepa C son superiores a los esperados. No obstante, en algunos grupos se puede
observar una mayor actividad en el sedimento que en sobrenadante.
* Estos valores no se corresponden con los esperados como causa del error. Estos datos no se han
tenido en cuenta para el clculo de la media en la actividad.

Resultados Prctica 4.

Anabel Milln Leiva

Grfica 4.1: Representacin del nivel de actividad -galactosidasa en membranas y sobrenadante.

En la representacin de las medias se observa una mayor actividad en el sedimento para la

cepa C y en el sobrenadante para la cepa 3. Esto significa que en la cepa C los productos de la
transcripcin del gen fusin se han localizado en las membranas, esto es consecuencia de la seales
de transporte intracelular del mRNA del gen SNF. Para los genes fusin de la cepa 3 esta seal se
ha perdido en la deleccin del gen SNF, y al carecer de seal de transporte, el producto de la
traduccin se queda en el citoplasma.