Praktikum Bioanalisis II

PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS AMITRIPTILIN

DALAM PLASMA SECARA KROMATOGRAFI GAS

KELAS

: B

KELOMPOK

: III

ANGGOTA KELOMPOK

: 1. Astri Y.Permana

(2010210033)

2. Astrialita Linuih

(2010210034)

3. Caecilia Arsi

(2010210045)

4. Denny Nicola C.

(2010210061)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PANCASILA
JAKARTA
2013

PROTOKOL

No. 001/ 2013

PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS AMITRIPTILIN DALAM

PLASMA SECARA KROMATOGRAFI GAS

Diajukan oleh:
Laboratorium Q-Lab
Fakultas Farmasi Universitas Pancasila

Disponsori oleh :
PT. Pancaindra Farma

Jakarta, Oktober 2013

Judul
PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS AMITRIPTILIN DALAM PLASMA
SECARA KROMATOGRAFI GAS

Nomor Protokol
No. 001 / 2013

Sponsor
Nama

: PT. Pancaindra Farma

Alamat

: Jl. Raya Layang no 13 ,Jakarta Selatan

Tempat Penelitian
Nama

: Laboratorium Pengujian Q- Lab Fakultas Farmasi Universitas Pancasila

Alamat

: Jl. Srengseng Sawah, Jagakarsa, Jakarta Selatan, 12640

Personil
Peneliti Utama

: Caecilia Arsi, S.Si., M.Si., Apt

Peneliti Pendamping

: Astri Y.P, S.Farm, Apt

Analis

: Denny Chilwin W, S. Farm., Apt

Dokter Penanggungjawab : dr. Astrialita Linuih

Tanggal Pelaksanaan
Oktober 2013

I.

PENDAHULUAN
Amitriptilin suatu derivate dibenzodikloheptadin merupakan antidepresan
klasik yang karena struktur kimianya disebut sebagai antidepresan trisiklik. Obat
ini banyak digunakan untuk terapi depresi dan boleh dianggap sebagai pengganti
penghambat

MAO

yang

tidak

banyak

digunakan

lagi.

Derivat

dibenzodikloheptadine telah dibuktikan dapat mengurangi keadaan depresi,

terutama depresi endogen. Perbaikan berwujud sebagai perbaikan suasana
perasaan (mood) ,bertambahnya aktifitas fisik, kewaspadaan mental, perbaikan
nafsu makan, dan pola tidur yang lebih teratur.
Golongan obat ini bekerja menghambat ambilan kembali neurotransmitor
di otak.

Amitriptilin tersedia dalam bentuk tablet 10 dan 25 mg, dan dalam bentuk larutan
suntik 100 mg/10 ml. Dosis permulaan 75 mg sehari. Dosis ini kemudiaan
ditinggikan sampai menimbulkan efek terapeutik, biasanya antara 150 mg 300
mg sehari.
Amitriptilin tersedia dalam bentuk garam amitriptilin hidroklorida yang
memiliki kelarutan mudah larut dalam air dan etanol.Amitriptilin berupa serbuk
hablur atau hablur kecil, putih atau hampir putih, tidak berbau atau hampir tidak
berbau .
Obat ini dikontraindikasikan pada pasien yang hipersensitif terhadap
derivat dibenzodikloheptadin. Pasien koma,diskrasia darah, depresi sumsum
tulang,

kerusakan

hati,

kerusakan

otak

subkortikal

dikontraindikasikan

menggunakan Amitriptilin..
Berdasarkan Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia,
Amitriptilin merupakan obat copy yang wajib untuk uji bioekuivalensi. Untuk itu
diperlukan suatu metode analisis obat yang terpercaya dalam matriks biologis
yang sesuai. Pengukuran analit dalam matriks biologis harus divalidasi. Validasi
metode bioanalisis mencakup semua prosedur yang menunjukkan bahwa metode
khusus yang digunakan untuk pengukuran kuantitatif analit yang berasal dalam

matriks biologis, seperti darah, plasma, serum, atau urin, dapat dipercaya dan
dapat dilakukan ulang (reproducible) untuk penggunaan yang diinginkan.
Metode analisisnya menggunakan peralatan yang canggih, seperti Liquid
Chromatography- Mass Spectrometer (LC-MS), UV, TLC, HPTLC and HPLC in
different pharmaceutical dosage forms. Namun penerapan metode yang telah ada
tersebut tidak selalu dapat dilakukan karena diperlukan biaya yang sangat besar
untuk menyediakan peralatan yang dibutuhkan. Salah satu cara analisis
Amitriptilin yang paling banyak digunakan adalah dengan kromatografi gas .

II.

TUJUAN PENELITIAN
a.

Untuk menghasilkan hasil analisis yang paling baik sehingga semua variabel yang

terkait dengan metode analisis harus dipertimbangkan seperti prosedur pengambilan

sampel, tahap penyiapan sampel, fase yang digunakan pada kromatografi, fase gerak,
dan sistem deteksinya.
b. Untuk memperoleh kondisi optimum untuk analisis Amitriptilin dalam plasma in
vitro secara kromatografi Gas dan melakukan validasi metode analisis Amitriptilin
dalam plasma in vitro secara kromatografi gas.
c. Untuk menilai secara kuantitatif Amitrptilin agar hasilnya dapat menjadi acuan
uji preklinik dan/atau biofarmasetik serta uji farmakologi klinik dengan menggunakan
metode analisis yang terpercaya (yang selektif dan sensitif) dalam matriks biologis
yang sesuai
d. Untuk membuktikan karakteristik kinerja metode (parameter tersebut) memenuhi
persyaratan dalam penggunaannya dan untuk melihat pengaruh dari kondisi peralatanperalatan yang digunakan, dan pereaksi dalam melakukan pemeriksaan.
III.

METODOLOGI
A. Penyiapan Larutan Baku Stok
Larutan stok dari analit disiapkan dalam metanol pada konsentrasi 100 g mL1, dihitung sebagai basis.Larutan stok clomipramine (standar internal)
yangdisiapkan dalam metanol pada konsentrasi 100 g mL-1.Larutan stok yang
stabil selama setidaknya dua bulan, ketika disimpan pada suhu -20 C. Larutan
preparasi dibuat setiap hari dari larutan stok dengan pengenceran dengan
metanol.
B. Penyiapan Sampel Biologi

Dikumpulkan plasma blanko yang digunakan untuk mendapatkan kalibrasi

Sampel diperoleh dari sukarelawan yang sehat. EDTA sampel darah (5 mL)
dikumpulkan untuk genotip danAnalisis farmakokinetik. Semua sampel
disimpan pada -20 C, yang dicairkan sebelum digunakan.
C. Preparasi Sampel
Untuk 500 uL plasma di kaca-tutup 10 mL tabung sentrifus, 50 uL larutan
kerja baku internal (2 mg mL-1), 500 uL buffer Tris pH 9,5 dan 5 mL heksana:
isopropylic alkohol (95:5, v / v) ditambahkan. Setelah pusaran pencampuran
(1 menit), campuran disentrifugasi pada 3500 g selama 10 menit dan fase
organik dipindahkan ke segelas tabung tutup yang 150 uL fosfat asam 0,1% (v
/ v) sebelumnya ditambahkan. Campuran ini divortex selama 1 menit dan
kemudian disentrifugasi pada 3500 g selama 10 menit. Lapisan organik
dibuang dan 100 uL fase berair dipindahkan pada microvial untuk autosampler
dan 50 uL disuntik.

D. Optimasi Metode
Front inlet
Split mode (dibagi rasio 20:1) dengan perpecahanow dari 23,1 mL /
menit dan total ow dari 27,2 mL / menit. Temperatur awal 300 C

dengan tekanan 12 psi.

Carier Gas
Helium.
Oven temperature
Suhu oven isokratik yang digunakan, mulai dari 240 C dan 260 C.
Analisis
untuk analit dalam etil asetat dilakukan pada suhu oven isokratik 260
C. Namun, gangguan hadir bervariasi dengan masing-masing set
sampel yang dianalisis. Oleh karena itu,digunakan suhu spesifik untuk
setiap set sampel bervariasi antara 240 C dan 260 C Pada dasarnya,
oven suhu divariasikan Untuk menjaga pemisahan dasar dari analit,

baik dari satu sama lain, dan lainnya

Column
Sebuah 30,0 m, HP-5 (5% Phenyl metil siloksan) kolom kapiler
dengan diameter

320 m lm ketebalan 0,25? M? Dan suhu maksimum 325 C. Konstan

tekanan 12 psi dan awal ow rate dari 1,2 mL / menit.

Detector
Nitrogen-fosfor detektor, dengan suhu 240 C Gas hidrogen ow dari 4,0 mL /
menit dan udara medis ow dari 60,0 mL / menit. Helium ow rate dari 15 mL /
menit.

Run time
5 menit
Relative Analyte Retention Time
Waktu retensi relatif untuk amitriptyline dan nortriptyline dihitung dalam
referensi

dengan

waktu

retensi

standar

internal,

maprotyline1

Waktu retensi relatif untuk amitriptyline yang 0,80 menit, dan retensi relatif
waktu untuk nortriptyline yang 0,82 menit.

E. Validasi Metode
Validasi metode
1. Selektivitas
Salah satu metode untuk mengevaluasi selektivitas metode kromatografi
adalah membandingkan waktu retensi puncak hadir dalam kromatogram
sampel, dengan waktu retensi, yang dihasilkan dengan metode yang sama.
Namun, metode ini hanya cocok untuk menentukan selektivitas dalam
kasus-kasus tertentu karena metode ini sangat tidak bisa diandalkan.
Biasanya masalah ini diselesaikan dengan data identitas puncak
menggunakan metode lain.

Selektivitas metode untuk amitriptyline , nortriptyline dan maprotyline

dalam matriks etil asetat ditentukan dengan menyuntikkan dan
menganalisis serangkaian solusi analit standar pada 6890 HP kromatografi
gas. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa semua puncak analit yang
tepat diselesaikan. Larutan standart adalah etil asetat kosong. Selanjutnya,
standar terpisah amitriptyline , nortriptyline dan maprotyline dianalisis
untuk menentukan waktu retensi masing-masing . Setelah waktu retensi
untuk masing-masing dari tiga senyawa ditentukan , standar campuran
yang mengandung konsentrasi yang sama amitriptyline , nortriptyline dan

maprotyline disuntikkan untuk menentukan apakah tiga obat dapat

dipisahkan yang sesuai resolusi . Sebuah kromatogram menggambarkan
baseline pemisahan tiga komponen , amitriptyline , nortriptyline dan
maprotyline adalah disajikan pada Gambar A.1 ( Lampiran A ) .
2. Akurasi
Presisi dan akurasi diperiksa dengan menambahkan sejumlah analit pada
plasma kosong, dengan akhir konsentrasi 15, 200 dan 400 ng mL-1
masing-masing analit. Sampel kontrol kualitas dianalisis dalam rangkap
tiga pada setiap 6 hari. 18 konsentrasi terukur per konsentrasi tingkat
menjadi sasaran analisis varians (ANOVA), mengingat hari sebagai
variabel pengelompokan. Akurasi dihitung dengan membandingkan ratarata dari 18 konsentrasi diukur per tingkat konsentrasi dengan konsentrasi
nominal.
3. Presisi
a. Presisi intraday
RSD (%) diperkirakan akan tinggi pada sampel yang kosong karena acak
fluktuasi. Berdasarkan penurunan cepat dalam RSD antara sampel kosong
dan 5 mg/L standar, tampak bahwa batas deteksi dan batas kuantitasi
untuk amitriptyline adalah setara dengan beberapa konsentrasi antara 0
dan 5 mg/L. Namun, konsentrasi standar memiliki RSD yang kurang dari
ambang batas 10% ditetapkan untuk semua konsentrasi lain dalam rentang
konsentrasi yang bekerja untuk analit.
b. Presisi interday
Rasio tinggi puncak untuk sembilan suntikan setiap standar kalibrasi,
seluruh periode validasi yang disusun, dan standar masing-masing relative
penyimpangan dihitung. RSD untuk 0 mg / L, 5 mg / L dan 10 mg / L
amitriptyline kalibrasi standar sangat tinggi, dan melebihi kriteria
penerimaan presisi 15% pada batas konsentrasi, dan 10% untuk semua
konsentrasi lainnya. Selain tiga standar konsentrasi yang lebih rendah ini,
RSDs untuk semua lainnya amitriptyline standar kalibrasi memenuhi
kriteria penerimaan presisi, karena masing-masing RSDs semua kurang
dari 10%.
4. Linearitas
Persyaratan linearitas untuk pekerjaan analitis cukup ketat. Menurut Sadek
(2000), koefisien korelasi dari 0.995 atau lebih diperlukan untuk kegiatan

analisis yang cukup kritis. Untuk pekerjaan kurang kritis, Koefisien

korelasi dari 0,990 atau kurang mungkin diperbolehkan (Sadek, 2000).
Linearitas kebutuhan, dalam hal koefisien korelasi, akan tergantung pada
tujuan dari metode yang diuji, dan sebagai hasilnya akan dibatasi oleh
pertimbangan keuangan dan waktu. Untuk percobaan ini, koefisien
korelasi dari 0,98 atau lebih besar yang dapat diterima untuk menyatakan
bahwa metode adalah linier selama rentang konsentrasi yang diharapkan.
Dalam situasi yang ideal, lereng dari kurva kalibrasi harus constant, dan
nilai y-intercept harus sama dengan nol. Jika kurva kalibrasi tidak berjalan
melalui titik asal, konstan kesalahan sistematis yang hadir, dan kesalahan
sistematis proporsional ada ketika lereng tidak konstan (Meyer, 1998).
Pengukuran LOD dan LLOQ
Kurva kalibrasi masih diperlukan untuk penentuan LOD dan LOQ, dan
karena itu, sampel diuji termasuk tidak hanya kosong, tetapi juga kalibrasi
standar. Sembilan standar kalibrasi dibuat dari campuran 0,1 mg / mL
amitriptyline dan 0,1 mg / mL nortriptyline larutan stok (dalam metanol).
Masing-masing dari sembilan standar kalibrasi disiapkan dalam 10 mL
volumetri bertanya.
Masing-masing standar

sembilan

kalibrasi

disiapkan

dengan

menambahkan 50 L dari 0,1 mg / ml maprotyline (standar internal), diikuti

oleh volume yang sesuai dari campuran amitriptyline dan larutan stok
nortriptyline, dan kemudian menipiskan ke tanda pada volumetric dengan
etil asetat. konsentrasi standar internal di masing-masing sembilan standar
kalibrasi adalah 0,5 mg / L. Dalam rangka untuk menentukan tingkat
kebisingan dasar, 0,5 mg / L maprotyline standar dengan tidak adanya
amitriptyline dan nortriptyline juga disiapkan. Setelah pencampuran
menyeluruh, sebuah alikuot dari setiap standar kalibrasi dipipet ke
autoinjector botol bersih dan ditutup.
Standar kalibrasi dijalankan pada HP 6890 kromatografi gas dengan
detektor nitrogen-fosfor, sesuai dengan metode yang dikembangkan
sebelumnya. Standar kalibrasi disuntik dari konsentrasi terendah (0,1 mg /
L) ke konsentrasi tertinggi (1,5 mg / L), dan seluruh rangkaian standar
kalibrasi, dari terendah ke konsentrasi tertinggi, disuntik tujuh kali
berturut-turut. Target jumlah analisis untuk setiap standar adalah sepuluh.

Namun, autoinjector jarum menjadi terpasang selama menjalankan, dan

sebagai hasilnya, hanya tujuh set lengkap. Data kalibrasi diperoleh.
Dua puluh suntikan ulangan dari L maprotyline standar 0,5 mg / dilakukan
untuk memperkirakan kebisingan dasar pada waktu retensi amitriptyline
dan nortriptyline. Selain itu, 10 suntikan ulangan dari kalibrasi standar
pelarut , etil asetat , dilakukan untuk memperkirakan kebisingan awal di
bawah maprotyline yang puncak rata-rata ( SD) dalam satuan puncak
tinggi ( pA ) , pada waktu retensi, dihitung dari 20 suntikan ulangan dari
0,5 mg / L maprotyline standar. Ini 0,5 mg / L , standar maprotyline
disebut sebagai sampel kosong sebagai mengandung tidak amitriptyline
atau nortriptyline . Seperti disebutkan sebelumnya, LOD , dihitung dengan
menggunakan metode statistik, adalah berarti puncak tinggi ( pA ) pada
setiap waktu retensi dari standar kosong , ditambah tiga standar deviasi
( SD ) . Dalam rangka untuk menentukan konsentrasi setara dengan LOD
untuk setiap analit , ketinggian puncak rata-rata yang sesuai , ditambah
tiga SD , harus dikonversi dengan rasio tinggi puncak dengan
membaginya dengan maprotyline rata ( standar internal) puncak tinggi
untuk 20 suntikan ulangan dari sampel kosong . Konsentrasi masingmasing setara dengan analit LOD kemudian dapat dihitung dengan
memasukkan rasio tinggi puncak dihitung ( y ) ke dalam persamaan untuk
kurva kalibrasi yang tepat , dan pemecahan untuk konsentrasi (x).
F. Analisis Statistik
Model ANOVA (A linear mixed-effects analysis of variance)
digunakan untuk analisa dosis normal dengan parameter AUClast, AUCinf, dan
Cmax. Model ini menggabungkan faktor-faktor untuk pengobatan, periode,
urutan, dan subjek yang dikumpulkan sebagai sukarelawan sehat dalam studi
cross-over dan pengobatan dan subjek pasien yang tidak rumit untuk studi
paralel. Residual error (error mean square/ kesalahan rata-rata kuadrat)
digunakan untuk membangun selang kepercayaan 90%. Uji non-parametrik
Wilcoxon bertanda peringkat digunakan untuk menaksirkan perbedaan
pengobatan untuk data Tmax berpasangan yang diperoleh pada studi
sukarelawan sehat. Uji A Mann-Whitney U digunakan untuk menaksirkan

perbedaan pengobatan untuk data Tmax tidak berpasangan yang diperoleh pada
studi pasien yang tidak rumit. Bioekivalensi

disimpulkan jika selang

kepercayaan 90%, AUC berada dalam rentang 80-125%. Taraf signifikan

0,05. WinNonlin Professional, Versi 5.3 (Pharsight Corporation, Mountain
View, CA, USA) digunakan untuk farmakokinetik dan

analisis statistik

parametrik. SPSS untuk Windows, Versi 16.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)
digunakan untuk analisis statistik non-parametrik.
G. Daftar Pustaka
Anderson, I. M.; Depress. Anxiety 1998, 7, 11.
Preskorn, S. H.; Jerkovich, G. D.; J. Clin. Psychopharmacol.1990, 10, 88.
Ganiswara, Sulistia G. 1995. Farmakologi dan Terapi edisi IV. Jakarta: Gaya
Baru
Tjay, Drs. Tan Hoan & Drs. Kirana Rahardja. 2002. Obat- Obat Penting.
Jakarta : IKAPI