HETEROBETAINAS

VALORACION POR HPLC DEL RENDIMIENTO DE UNA REACCIN

(05/04/01) (organizado sobre un mtodo suministrado por Ramn Alajarn).
1) RECTA DE CALIBRADO POR HPLC PARA 4-(2-CLOROFENIL)-3,5DIETOXICARBONIL-2,6-DIMETIL-1,4-DIHIDROPIRIDINA

Cl
CO2Et

EtO2C
Me

N
H

Me

P.M. 363,5

1. Se pesan aprox. 36,3 mg de DHP (1 mmol) y se diluyen hasta 25 mL con MeOH en

un matraz aforado (disolucin A, 0,04 mmol/mL). (MUESTRA)
2. Se pesan aprox. 2,40 g (0,02 mol) de cumeno (isopropilbenceno, PM 120,2) y se
diluyen hasta 25 mL con MeOH en un matraz aforado (disolucin B, 0,8
mmol/mL)).(PATRON INTERNO, puede utilizarse un patrn interno diferente,
siempre cuidando de que: a) d un solo pico por HPLC, b) ese pico no interfiera
con los de la muestra, y c) se utilice a una concentracin que sea comparable a
la obtenida para el pico principal de la muestra)
3. A continuacin se preparan las siguientes disoluciones, las cuales se diluyen hasta
10 mL con MeOH, en los correspondientes matraces aforados :
Punto 1) Disolucin 1: 1 mL A + 1 mL B
Punto 2) Disolucin 2: 2 mL A + 1 mL B
Punto 3) Disolucin 3: 3 mL A + 1 mL B
Punto 4) Disolucin 4: 4 mL A + 1 mL B
Punto 5) Disolucin 5: 5 mL A + 1 mL B

(0,04 mmol/10 mL)

(0,08 mmol/10 mL)
(0,12 mmol/10 mL)
(0,16 mmol/10 mL)
(0,20 mmol/10 mL)

4. Cada una de las disoluciones anteriormente preparadas se inyecta 3 veces en HPLC

y se mide la relacin de reas, haciendo la media de cada relacin muestra/patrn
interno. Al final se representa, en un plot la concentracin de cada muestra frente a
la relacin de reas observada.
5. Condiciones cromatogrficas:
Columna: Spherisorb S10 ODS-2 (250 x 4,6 mm)
Eluyente: MeOH/Tampn fosfato (0,01 M; pH=7): 75/25
Flujo: 1 mL/min

2) DETERMINACIN DE CONCENTRACIN DE DHP EN EL MEDIO DE

REACCIN.
2a) Si la reaccin se hace de manera que el producto final queda en disolucin en el
medio, entonces basta calcular la concentracin que el producto puede tener en el medio
(segn el rendimiento previsto o previamente observado), medir el volumen total de la
mezcla de reaccin, y tomar una cantidad 2, 3 ml- de manera que, con adicin de 1 mL
de disolucin B, y diluido a 10 ml (en un matraz aforado) con metanol, se obtenga una
concentracin prevista en el entorno de los puntos de la curva de calibracin mas bien
en los de concentracin mas baja, con el fin de que al mejorar los rendimientos, no se
salgan los puntos del entorno marcado por la curva de calibracin-.
De esta manera, se realizan tres pinchazos de la disolucin muestra 1, y con la
curva de calibracin obtenida anteriormente se determinar la concentracin de
producto en la muestra, y con ella, la cantidad de producto en la disolucin muestra y en
la mezcla de reaccin original. A partir de aqu, se prepararn disoluciones de forma
similar para todos los ensayos realizados posteriormente.
2b) Si la reaccin se realiza de manera que el producto precipita en el medio, lo mejor
es concentrar cuidadosamente la suspensin en el rotavapor (ojo, hay que operar de
manera que no quede producto slido manchando el tubo del rotavapor), pesar el
resduo obtenido, tomar una cantidad de unos 40 mg de resduo, diluir hasta 25 mL con
metanol, en un matraz aforado, y tomar de esa disolucin (disolucin madre) 1 o 2 mL,
adicionar 1 mL de la disolucin B (patrn interno) y diluir a 10 ml con metanol en un
matraz aforado. La disolucin resultante ser la disolucin muestra 1, y con ella se
realizarn tres pinchazos que permitirn conocer, a travs de la curva de calibracin, la
concentracin del producto en la disolucin muestra, en la disolucin madre, y con ello
en el resduo de la mezcla de reaccin. A partir de aqu, se prepararn disoluciones de
forma similar para todos los ensayos realizados posteriormente.