NCLEO DE SUCRE
ESCUELA DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOANLISIS
Cuman, 2013
APROBADO POR:
_____________________________
Dra. Raquel Salazar.
Asesora
_____________________________
Profa. Leida Marcano.
Jurado.
_____________________________
Profa. Mairin Lemus.
Jurado
INDICE
DEDICATORIA .................................................................................................................i
AGRADECIMIENTOS .....................................................................................................ii
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................iii
LISTA DE TABLAS ........................................................................................................iv
RESUMEN ........................................................................................................................ v
INTRODUCCIN ............................................................................................................. 1
METODOLOGA.............................................................................................................. 6
Transporte y acondicionamiento .................................................................................... 6
Bioensayos de exposicin .............................................................................................. 6
Bioensayo de depuracin ............................................................................................... 7
Obtencin de las clulas inmunocompetentes................................................................ 7
Identificacin de clulas blancas ................................................................................ 8
Mtodo de coloracin de May-Grumwald Giemsa......................................................... 8
Anlisis estadstico......................................................................................................... 8
RESULTADOS ................................................................................................................. 9
Morfologas celulares observadas en impronta de rin ceflico del pez Colossoma
macropomum.................................................................................................................. 9
Morfologas observadas en impronta de rin ceflico del pez Colossoma
macropomum expuesto a cadmio. .................................................................................. 9
Morfologas celulares observadas en impronta de rin ceflico del pez Colossoma
macropomum expuestos a cobre .................................................................................. 12
DEDICATORIA
A mis padres Francisca y Cruz Ramn, me quedo sin palabras para expresar lo
importante que son en mi vida mi ms grande amor y mi esfuerzo es de ustedes.
AGRADECIMIENTOS
A:
Dios todopoderoso, la Virgen del Valle, por estar acompandome siempre y darme
fuerzas en los momentos que pude decaer.
Mi asesora de tesis, Dra. Raquel Salazar, por ayudarme a culminar con esta meta, por
compartir conmigo sus conocimientos, por dedicarme su valioso tiempo, a usted
eternamente agradecida.
Mis hijos Hctor, Adrin y ngel, quienes han llenados mi vida de alegras, sto es para
ustedes, los amo.
Mis hermanos Sandra, Cruz y Ana siempre han estado cuando los he necesitado, gracias
ngel Vallenilla por sus palabras de apoyo cuando todo pareca estar mal, por estar
siempre a mi lado y por el sentimiento que nos une.
Ing. Nelson Ruiz, a la Dra. Luz Marina Rojas, las licdas. Zuleika, Yvis, Sandra lvarez,
Amrica Vargas, Mara Carolina, Licdo. Anibal Marcano y Luz Coronado, por haberme
ayudado de diferentes maneras para la realizacin de este trabajo.
Mis compaeras de estudio y de trabajo, Martina, Alfreisa, Eranilde y Faricar por
compartir buenos y malos momentos a lo largo de nuestro estudio.
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Impronta de rin ceflico control extrado del pez Colossoma macropomum.
Los crculos sealan los centros granulopoyticos y el cuadrado el centro eritropoytico.
A. Detalle del parsito Myxozoasp. (Flecha) y (B) Detalle de granulocitos inmaduros
(flecha delgada) y eritrocitos inmaduros (flecha gruesa) 400X....................................... 10
Figura 2. Impronta de rin ceflico extrado del pez Colossoma macropomum expuesto
a cadmio. Eritrocito con ncleo excntrico (crculo), clula granulopoytica (cuadrado),
clulas inmaduras de la lnea eritropoytico (las flechas vacas) y clulas inmadura de la
lnea granulopoytica (la flecha oscura). A. Detalle de eritrocito con ncleo excntrico.
B. Detalle de clula inmadura granulopoytica hinchada. 400X..................................... 11
Figura 3. Impronta de rin ceflico extrado del pez Colossoma macropomum expuesto
a cobre. Los crculos enteros sealan celulas de la serie granulopoyetica, el crculo
punteado seala celula de la serie granulopoyetica vacuolada, Parsitos del gnero
Myxozoa (crculo de triple linea), clulas melanomacrfagas (cuadrados punteados),
centro eritropoytico (cuadrado completo). A. Detalle sealando parsitos del gnero
Myxozoa. B. Detalle sealando clula melanomacrfaga 400X...................................... 14
iii
LISTA DE TABLAS
iv
RESUMEN
INTRODUCCIN
Las consecuencias del avance tecnolgico, aplicado en las transformaciones que realiza
el hombre buscando obtener mayores producciones en los procesos industriales, para
satisfacer las necesidades ergonmicas, de alimentacin, de salud, entre otros, han sido
desbastadoras para la naturaleza, en los suelos, la atmsfera y aguas dulces y de mares,
perjudicando as a todo tipo de especie presentes en estos ambientes, tanto vegetal como
animal. El principal rgano hematopoytico de los peces es el rin ceflico, el cual es
el sitio de diferenciacin de eritrocitos, granulocitos, linfocitos B y monocitos celulares
involucrados en el sistema inmunolgico (Ellis, 1976). Este rgano productor de
anticuerpos contiene macrfagos que fagocitan los diferentes antgenos, componentes
linfomieloides, renales y endocrinos suplementados por la sangre de las arterias y de la
vena porta caudal. Sirve como un anlogo de la mdula sea, de los ganglios y en parte
de la glndula adrenal de los vertebrados superiores (Blaxhall y Daisley, 1973).
Las clulas involucradas en la respuesta inmune son los leucocitos, que pueden
encontrarse en tejido o en sangre. La clasificacin de estas clulas en peces, al igual
que la de los leucocitos de todos los vertebrados, se ha realizado por criterios
morfolgicos segn los cuales se distinguen varios tipos: linfocitos, granulocitos,
monocitos o macrfagos (Ellis, 1977). La cantidad de leucocitos totales circulantes en
sangre de los peces es muy variable dependiendo de las especies o de las condiciones
fisiolgicas. Por ejemplo, las cifras encontradas para trucha comn se sitan entre 2000
y 63000 leucocitos/mm, mientras que en salmn coho, el promedio es de 44500
leucocitos/mm (Blaxhall y Daisley, 1973; Harbellet al., 1979).
En los telesteos, los linfocitos son los leucocitos mayoritarios y representan el 70-90%,
a nivel funcional, son responsables de la respuesta inmune especfica humoral y celular.
Los neutrfilos representan entre el 8 y 20% de las clulas leucocitarias; la liberacin de
stos a la sangre se presenta como una respuesta inespecfica ante una amplia variedad
de estmulos. Los monocitos y macrfagos, constituyen las principales clulas
fagocticas, por su capacidad de ingerir material extrao, inerte o antignico, as como
huesos y lesiones renales, anemia e hiperglucemia) son muy parecidos a los efectos del
cadmio en otros mamferos. Por otro lado, el metal cromo hexavalente es un metal
potencialmente txico para los organismos acuticos, carcinognico para los mamferos
incluyendo al ser humano (Zweiget al., 1999).
En relacin a la situacin de los metales pesados en las cuencas hidrogrficas de
Venezuela, el Ministerio del Ambiente en el Decreto n 883, Gaceta Oficial N 5.021,
1995, establece las normas para el control de calidad de los cuerpos de agua y de los
vertidos o efluentes lquidos. En tal sentido seala, para las aguas de los sub-tipo 1 y 2,
que corresponden a los ros (Orinoco, Caron, Manzanares, etc.), que las mismas no
debern exceder de los siguientes lmites: cobre; 1,0 mg/l y 0,20 mg/l; cadmio 0,01 mg/l
y 0,0005 mg/l, respectivamente. En elpas se han realizado diferentes evaluaciones en
cuencas altamente impactadas, destacando los estudios de Gamboa y Bonilla (1983), en
sedimentos de la cuenca Tuy, quienes reportaron elevadas concentraciones de Mn, Cu y
Zn en la zona costera influenciada por el ro Never. Ms recientemente, Fermn,(2002)
evalu el contenido de cobre y cadmio total en sedimento de la laguna de Unare, estado
Anzotegui, encontrando concentraciones de cobre que oscilaron entre 22,26 g/g y
48,92g/g con un promedio de 36,31 g/g y de cadmio obtuvo niveles mximos de
0,350 g/g con un promedio 0,112 g/g. Garca (2004) reportaron concentraciones de
cobre en sedimentos superficial del ro Orinoco de 0,123 g/g a 3,987 g/g. Vaquero et
al. (2004) evaluaron la concentracin de cobre y cadmio en aguas del ro Tigre, estado
Anzotegui y reportaron valores de Cu118,8 g/l, Cd 11,6 g/l y en sedimento
reportaron valores de Cu 115g/g y Cd 20g/g. Los resultados antes expuestos
demuestran que algunos ros venezolanos no cumplen con las normas establecidas por el
Ministerio del Ambiente.
Con respecto a trabajos donde se consideraron los parmetros hematolgicos e
inmunolgicos en peces expuestos a txicos ambientales, se destacan los realizados por
Barroso (1996), quien evalu las respuestas inmunolgicas y hematolgicas del
pezHypostamuswatwata inducido por exposicin a xenobiticos; el estudio de Blanco et
al. (2004), quienes evaluaron las respuestas hematolgicas e inmunolgicas en
de
muerte
bacteriana
inducida
por
polimorfonucleares
de
Colossomamacropomum expuestos a dosis sub letal de dicho metal. En esta misma lnea
de investigacin, pero en animales invertebrados, destacan los trabajos realizados por
Salazar (1993); Crdova (1995); Marcano et al. (1997); Salazar et al. (1997); Martnez
(1998); Nusettiet al. (1998); Zapata et al. (2005) relacionados con la sensibilidad de
pruebas inmunolgicas en el poliqueto Eurythoecomplanata. De igual forma, se seala
el estudio de Nusettiet al. (2004) en el cual se evaluaron las respuestas inmunolgicas y
las actividades de las enzimas antioxidantes en la ostra perla Pinctadaimbricata,
expuesta al Fuel oilN 6. TambinMarcano et al (2006) usinmunoensayo en el pez sapo
(Thalassophryne maculosa) para evaluar efectos del Fuloil N. 6.
La especie escogida para este estudio, Colossomamacropomum
(Cuvier 1818), es
Este pez se encuentra distribuido en toda Sudamrica, desde la cuenca del ro Orinoco
(Mago, 1970) hasta la cuenca del Amazonas (Eigermman, 1975). En Venezuela, est
localizado en los ros Guanare, Apure, Caron, Portuguesa y Orinoco donde forma parte
del potencial pesquero de la zona; se caracteriza por presentar un solo perodo
reproductivo al ao, sincronizado con el comienzo de la poca de lluvia y puede llegar a
alcanzar en su estado adulto casi 1 metro de largo y pesar
hasta 18 kilogramos
(Machado, 1992).
En el laboratorio de Protenas e Inmunotoxicidad de la Universidad de Oriente Ncleo
de Sucre, se desarrollan pruebas bioqumicas e inmunolgicas, con la finalidad de
elaborar un protocolo de pruebas que permitan evaluar el estado de salud del pez, ya sea
en condiciones naturales o de cultivo; de all que el conocimiento de la morfologa y
citoqumica de las clulas sanguneas ayudara a interpretar los posibles cambios que
sobre estos tipos celulares pudiesen causar los txicos a los cuales el organismo es
expuesto. Por todo lo antes planteado, resulta evidente que un aspecto que debe
continuar en estudio en la cachama es la morfologa y citoqumica de las clulas
inmunocompetentes, de las cuales no se tiene suficiente informacin en la literatura.
Este trabajo de investigacin se realiz con el fin de evaluar los cambios en la poblacin
de granulocitos, en sangre y rin ceflico de peces Colossomamacropomumexpuestos
a cadmio, a cobre y depurados.
METODOLOGA
Ejemplares juveniles de Colossomamacropomum(Curvier, 1818), cuyos ndices
biomtricos oscilaron entre 16,7 1,2 cm de longitud y 94,4 22,4 g de peso fueron
recolectados en lagunas artificiales de reproduccin capturados con red de 5 mm de
abertura de malla y en algunas ocasiones con salabardos, provistos por la piscicultura
ALMA C.A (ALMACA) ubicada en la carretera nacional Cantaura-Aguasay, Campo
Mata, Distrito Freites del estado Anzotegui, Venezuela.
Transporte y acondicionamiento
Los ejemplares fueron trasladados vivos en bolsas de polietileno con oxgeno hasta el
Laboratorio de Camarones Dulceacucola, en el Departamento de Biologa, situado en la
Universidad de Oriente, Ncleo de Sucre, mantenidos, para su aclimatacin, por un
lapso de dos semanas. Los peces, an en las bolsas, fueron colocados dentro de un
estanque por un tiempo aproximado de 30 minutos; transcurrido este tiempo, fueron
liberados de las bolsas y colocados directamente en el estanque. Para prevenir
infecciones bacterianas y fngicas se le agreg al agua una (1) cpsula de cloranfenicol
y 1 ml de solucin antifngica veterinaria comercial (Blanco et al., 2004). La
temperatura se mantuvo entre 24 2C con fotoperodos de 12/12 horas; los peces
fueron alimentados todas las maanas ad lbitum con alimento comercial cachamarina,
antes de efectuar el recambio del metal. La limpieza y recambio del agua se realiz
diariamente, eliminando los desechos por succin con mangueras y recambiando el 70%
del volumen total del agua del estanque.
Bioensayos de exposicin
Como concentraciones subletales se seleccionaron dosis de 1 mg Cd /l y 0,5 mg Cu /l
basado en el ensayo de concentracin letal media (LC50) a 96 horas, calculado
previamente por Blanco et al. (2004) y Garca (2004). Se seleccionaron 48 ejemplares de
Colossomamacropomum, distribuidos en 6 grupos de lotes homogneos de 8 ejemplares
de ambos sexos y
(control y rplica). Este grupo fue colocado bajo las mismas condiciones y distribuido
similarmente, sin estar en contacto con los metales; grupo 2, expuesto a una
concentracin de cadmio de 1 ppm y su rplica; grupo 3 expuestos a una concentracin
de 0,5 ppm Cu y su rplica. Los grupos 2 y 3 estuvieron expuestos a los metales durante
21 das. A los peces de los tres grupos experimentales se les suministr alimento
diariamente despus del recambio de agua y metales durante 21 das. La iluminacin
artificial fue reducida envolviendo los acuarios con bolsas plsticas negras para no
alterar el comportamiento de los peces.
La concentracin requerida de cloruro de cadmio pentahidratado (CdCl25H2O) se
prepar a partir de una solucin madre y, en el momento del recambio del agua, se
agreg, a los acuarios de capacidad de 60 litros, un volumen de 50 ml de CdCl25H2O
para alcanzar una concentracin final de 1mg/l del metal en el agua. La concentracin
requerida de cloruro de cobre pentahidratado (CuCl25H2O) se prepar a partir de una
solucin madre
CdCl25H2O para alcanzar una concentracin final de 0,5mg/l del metal en el agua. Los
acuarios fueron cubiertos con papel envoplast para evitar evaporacin continua del agua
y por ende un aumento en la concentracin nominal de los metales.
Bioensayo de depuracin
Finalizada la exposicin de los peces a los metales, se procedi a la depuracin del 50%
de la poblacin durante los siguientes 21 das. Para tal fin, se colocaron los peces en
acuarios limpios con agua declorada y aireacin continua y se alimentaron como se
seal arriba, igualmente la limpieza y recambio del agua se realiz como se describi
anteriormente.
Obtencin de las clulas inmunocompetentes
Las clulas inmunocompetentes fueron extradas de sangre perifrica y de rin ceflico.
Las muestras de sangre fueron tomadas haciendo uso de la tcnica de puncin caudal,
descrita por Blanco etal. (2004) y Garca (2004), utilizando para ello jeringas
desechables de 3 ml y colectadas, individualmente en tubos de ensayo rotulados y
previamente heparinizados. Seguidamente, los peces fueron disectados para obtener
RESULTADOS
Morfologas celulares observadas en impronta de rin ceflico del
pezColossomamacropomum
La impronta de rin ceflico control muestra un tejido heterogneo, en el cual se
observan grupos de clulas con caractersticas morfolgicas que sugieren que son
granulocitos en diferentes estadios de diferenciacin; estas clulas se encuentran
agregadas formando centros granulopoyticos. Igualmente se observan clulas con
caractersticas morfolgicas de precursores eritroides las cuales se encuentran agrupadas
en centros eritropoyticos definidos (figura 1). Se observ que hay predominio de
clulas inmaduras, las cuales se caracterizan por ser de tamao prominente con ncleo
laxo (figura 1A). Es de hacer notar que en las improntas de rin ceflico de los peces
evaluados tanto en controles como en los peces expuestos se observaron clulas con
ncleo lobulado, que de acuerdo a la literatura son parsitos delgneroMyxozoa, que han
sido observados en ste y otros tejidos por otros autores en esta especie (Tavares-Daset
al., 2006) (figura 1).
Morfologas observadas en impronta de rin ceflico del pez
Colossomamacropomum expuesto a cadmio.
En la impronta de rin ceflico deColossomamacropomum expuesto a cadmio, se
observ disminucin en el nmero de clulas en comparacin con lo observado en la
impronta del control. Los agregados hematopoyticos (tanto granulocticos como
eritrocticos) se observan escasos y, cuando se observan los grupos de clulas en estos
centros, se presentan con caractersticas morfolgicas que indican algn tipo de dao
celular. Las caractersticas de dao celular ms resaltantes de los precursores
granulopoyticos son vacuolizacion e hinchamiento (figura 2A). Los precursores
eritropoyticos presentan como caracterstica ms resaltante la presencia de ncleos con
bordes irregulares, excntrico y citoplasma vacuolado (figura 2B). Al igual que en los
controles se observaron parsitos del gnero Myxozoa. Cuando se cuentan estos
parsitos se observa que la cantidad de parsitos es similar a las observadas en el
control.
10
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clulas en el grupo de los expuestos y depurados (tabla 2). Las clulas maduras de la
serie roja se observaron en menor porcentaje (tabla 2).
75, 40 3,04
70,02 2,62
70,00 2,40
Maduras
24,60 2,90
29,70 2, 60
30,00 2,46
81, 00 2,60
18,80 2,60
75,80 4,10
24,40 4,36
13
73,30 4,10
26,50 4,30
Figura 3. Impronta de rin ceflico extrado del pez Colossoma macropomum expuesto
a cobre.Los crculos enteros sealan celulas de la serie granulopoyetica, el crculo
punteado seala
celula de la serie granulopoyetica vacuolada, Parsitos del
gneroMyxozoa (crculo de triple linea), clulas melanomacrfagas (cuadrados
punteados), centro eritropoytico (cuadrado completo). A. Detalle sealando parsitos
del gneroMyxozoa. B. Detalle sealando clula melanomacrfaga 400X.
14
75, 40 3,04
24,60 2,90
71,03 2,80
28,90 2,80
15
69,20 2,05
30,07 2,05
81,00 2,60
18,80 2,60
80,90 2,50
19,70 2,50
79,50 2,50
20,50 2,50
Control
Cadmio
Cobre
2353,00 48,70
1065,00 21,62
945,60 15,84
16
Control
Cadmio
Cobre
992,00 63,68
465,00 24,40
432,00 18,28
17
DISCUSIN
Las clulas hematopoyticas
encuentran
agrupadas
en
eritropoyticos
granulopoyticos
con
gnero
18
19
de combatir y evitar el dao inducido por el parsito. Esto sugiere que existen ciertos
niveles de parsitos que son tolerados por el sistema inmune del pez, pero un incremento
en su nmero activa al sistema inmune para detener la proliferacin que pueden
comprometer la vida del pez. Esta hiptesis debe ser revisada en profundidad.
Las infecciones provocadas por parsitos del gnero Myxozoa, (Myxobolidae) causan
patologas que pueden ser responsables de importantes mortandades en cultivos
intensivos y semintensivos (Dykova y Lom, 1978; Duhamelet al.,1986).Latercaet
al.(1996), observaron que las branquias de los peces Piaractus mesopotamicus y
Colossoma macropomum se encontraban fagocitadas por parsitos del gnero Myxozoa,
ocasionndoles alteraciones a nivel de stas, formando quistes, lo cual conlleva a una
congestin, edema y desprendimiento del epitelio respiratorio. Se ha demostrado que los
melanomacrfagos pueden ingerir material extrao, actuar como limpiador celular,
producir melanina y ser aplicado como biomarcador histopatolgico de contaminacin
(Loumbourdis, 2007). Se ha propuesto que estas clulas son activadas por diversos
contaminantes entre ellos metales (Mcgraw, 2003).
Aunque el cobre es un elemento esencial, est ampliamente documentado que ejerce un
efecto inmunosupresor en peces cuando sus concentraciones sobrepasan las normales, lo
cual podra incidir en el aumento a la susceptibilidad a infecciones de estos organismos;
este hecho es relevante tanto en las especies en ambientes naturales como los usados en
acuicultura (Carballo et al., 1975). El cobre es txico y potencialmente carcinognico.
Por tal motivo, la Evironmental Pollution Agency(E.P.A)establece como lmite mximo
una concentracin de 6,50g Cu/l presente en los ros, con una dureza del agua de 50
mg/l. Es ampliamente conocido que el cobre ejerce sus efectos txicos a nivel celular, en
parte, a travs de la induccin del estrs oxidativo porque produce un descenso de la
respuesta inmune humoral y celular, incluyendo el nivel de linfocitos circulantes y la
respuesta fagocticas aguda (Carballo y Muoz, 1991; Carballo et al.,1995).
El efecto inmunosupresor, tanto del cobre como del cadmio, se manifiesta en la
disminucin en el nmero de precursores granulopoyticos, este dao va a depender de
20
21
CONCLUSIONES
El efecto inmunosupresor, tanto del cobre como del cadmio en el pez Colossoma
macropomum, se manifiesta en la disminucin en el nmero de precursores
granulopoyticos.
La serie eritropoytica fue ms afectada por el cadmio que por el cobre, pudiendo
deberse a la dinmica de acumulacin de ambos metales por el organismo.
A diferencia de lo observado para los peces expuestos a cadmio, la exposicin a cobre
no disminuy los agregados granulopoyticos y eritropoyticos del rin ceflico, pero
si produjo efecto sobre la morfologa celular, observndose vacuolizacion en el
citoplasma, ncleos laxo, indicativos de dao celular.
El hecho de no restablecerse las variables medidas es indicativo de que no hubo
depuracin probablemente.
En el rin ceflico del pez Colossoma macropomum, se observaron parsitos del
gnero Myzxozoaen los controles, expuestos a cadmio y a cobre, predominando ms en
las improntas de los peces expuestos en este ltimo metal.
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HOJA DE METADATOS
Ttulo
Subttulo
Autor(es)
Apellidos y Nombres
e-mail
e-mail
28
9452531
marialvarez116@gmail.com
rea
Subrea
Ciencias
Bioanlisis
Resumen (abstract):
En este trabajo se evalo el efecto de la exposicin a cadmio y a cobre sobre rin
ceflico y sangre del pez dulceacucola Colossoma macropomum. Los organismos
fueron aclimatados durante 15 das y posteriormente expuestos a una dosis de 1 ppm de
cloruro de cadmio y 0,5 ppm de cloruro de cobre durante 21 das y fueron depurados de
los metales durante 21 das. Se realizaron frotis sanguneos a partir de muestras tomadas
de peces antes de someterlos al tratamiento, finalizado el tratamiento y despus de la
depuracin. Finalizados los 21 das de exposicin se realizaron improntas del rin
ceflico. Los resultados del estudio indican que en Colossoma macropomum el rin
ceflico es un rgano principalmente hematopoytico, presentando agregados
granulopoyticos y eritropoyticos bien definidos. Aunque ambos metales afectan tanto
a las clulas eritropoyticas como a las granulopoyticas, se evidenci que el cadmio
afecta los agregados de ambas series y produce los mayores cambios en la morfologa
de los precursores eritrocitarios; el cobre no disminuye los agregados hematopoyticos
pero si produce cambios en la morfologa de la serie granulopoytica; ambos metales
disminuyen el porcentaje de clulas inmaduras del rin ceflico. En sangre perifrica,
se observ disminucin significativa de linfocitos y granulocitos en los peces expuestos
a cadmio y a cobre. La depuracin de 21 das no fue suficiente para la recuperacin
celular de estos peces. La disminucin del contaje de las clulas leucocitarias,
observada en los peces expuestos a cadmio y a cobre est en concordancia con la
disminucin de precursores leucocitarios en el rin ceflico, rgano leucopoytico, y
corrobora lo observado en estudios previos.
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Apellidos y Nombres
ROL
CA
A
S
T
U
J
U
Raquel Salazar
5855836
rsalazarlugo50@gmail.com
CVLAC
e-mail
e-mail
ROL
CA
A
S
T
U
J
U
J
U
Mairn Lemus
6429405
mlemus88@gmail.com
CVLAC
e-mail
e-mail
ROL
CA
A
S
T
U
Amrica Vargas
8219437
leimar0501@gmail.com
CVLAC
e-mail
e-mail
Mes
2013
Da
03
13
Lenguaje: spa
30
Tipo MIME
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Espacial:
(Opcional)
Temporal:
(Opcional)
Licenciada
Bioanlisis
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