NDICE

Dedicatoria
1. DEFINICION. 2
2. MORFOLOGIA. 2
2.1 Forma de vacuola
2.2 Forma ameboidea
2.3 Forma granular
2.4 Forma qustica
3. CICLO BIOLOGICO 3
4. PATOLOGIA 3
5. SINTOMAS Y MANIFESTACIONES CLINICAS 4
6. EPIDEMIOLOGIA 5
6.1 Mundial
6.2 Nacional
7. DIAGNOSTICO.. 6
7.1 seriado de heces y cultivos
7.2 endoscopias y biopsia
7.3 tcnica de inmunofluoresencia
8. TRATAMIENTO. 7
9. PREVENCION 7
10. TEMA DE ACTUALIDAD. 10
11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS13

BLASTOCISTOSIS
1. DEFINICION
Infeccin parasitaria causado por un protozoario llamado Blastocystis hominis,
este habita en el intestino grueso del hombre y de otros animales (monos, simios,
cerdos, conejos, caballos, etc.)
La infeccin ha sido asociada principalmente a sintomatologa gastrointestinal
inespecfica, aguda o crnica, existiendo casos de presentacin asintomtica.
2. MORFOLOGIA
Existe una gran cantidad de descripciones sobre Blastocystis , los tamaos y formas
varan enormemente en los diferentes hospederos, de acuerdo a los desarrollo en
cultivos, edad de los especmenes, exposicin a oxgeno, entre otros factores.
Son anaerbicas estrictas con gran cantidad de mitocondrias y organelos en su
interior, poseen pseudpodos para su locomocin y alimentacin.
Se multiplican por fisin binaria, esquizogonia y plasmotoma.
Una caracterstica particular de este organismo es la presencia de la vacuola
central, o cuerpo central, con funciones metablicas y de almacenamiento
Son clulas esfricas de tamao variable de 4-5 um
Los quistes son la forma infectante
Son multinucleadas, con cuatro formas morfolgicas distintas: forma vacuolada,
granular, ameboidea y quiste
La forma de aparicin de este organismo es dependiente en gran medida de las
condiciones ambientales, ya que es extremadamente sensible al oxgeno. No se
conoce si todas estas formas coexisten en el intestino del husped.
2.1 FORMA VACUOLADA (tambin denominada de cuerpo central)
Mide alrededor de 8 10 um de dimetro, presenta un gran vacuola central que
ocupa del 50 al 95% de la clula, esta vacuola central est relacionada con la
multiplicacin esquizogonia.
Es la forma predominante en el tracto gastrointestinal.
2.2 FORMA AMEBOIDE:
Clula polimorfa con gran rango de tamao, presenta pseudpodos y tiene un
gran actividad fagoctica. Es la forma predominante en los cultivos y en las
muestras fecales. Esta forma es inmvil y fuertemente adhesiva
Solo cuando ya existen algunas infecciones esta forma puede ser la nica
observada en deposiciones pudindose equivocar con leucocitos fecales
(fcilmente diferenciales en algunas tinciones).

2.3 FORMA GRANULAR:

Presenta gran cantidad de mitocondrias que le otorga el aspecto granular. Se
puede observar en cultivos y muestra fecales maduros.
Tanto la forma ameboidea como granular derivan de la forma vacuola.
2.4 FORMA QUSTICA:
Presenta un gruesa pared de varias capas y, en comparacin con las otras
formas, generalmente es ms pequea. Carece de vacuola central, pero se
observan algunos ncleos, mltiples vacuolas y grnulos de reserva.
El quiste es la forma ms resistente del parsito y es capaz de sobrevivir a
condiciones muy duras debido a las mltiples capas de la pared. Los
experimentos que se han llevado a cabo han mostrado su capacidad para
soportar los cidos gstricos, no se abren cuando se colocan en agua destilada y
pueden sobrevivir a temperatura ambiente durante un mximo de 19 das
3. CICLO BIOLOGICO
Las personas infectadas con blastocistosis hominis excreta las heces al medio
ambiente en la forma infectante de este protozoo que es la fase del cuerpo central
(infectante) que a su vez contamina el agua, alimentos, manos, utensilios.
Esto posibilita que lleguen a su boca de otras personas al ser ingeridas estas formas de
parasito descienden desde la parte alta del tubo digestivo y llegan al intestino grueso.
Donde se dividen en fisin binaria en la luz del mismo o algunas de estas estructuras se
pueden transformar en la fase ameboidea al penetrar dentro de las clulas del epitelio
intestinal, dan lugar a esquizogonia.
Despus formar nuevos quistes que constituyen el estadio infectante.
4. PATOLOGIA
Ante la presencia del parasito se desarrolla un proceso inflamatorio con infiltrado
celular en la lmina de las paredes intestinales.
Se observa una reaccin inflamatoria, su habitad en el colon es donde se produce la
invasin de clulas del epitelio intestinal, con el desarrollo de pequeas ulceraciones
que acompaan los focos hemorrgicos
Por otra parte en pacientes sintomticos con B. hominisc se ha descrito algunas
posibles alteraciones endoscpicas con eritemas y friabilidad de la mucosa colonica y
del leon adems de alteraciones histolgicas que demuestran diversos grados de
inflamacin.

Figura 1 .ciclo biolgico de blastocistosis y patogenia

5. SINTOMAS Y MANIFESTACIONES CLINICAS

La sintomatologa en la blastocistosis
hominis est asociada ms a la
sintomatolgica gastrointestinal inespecfica pueden darse de forma sintomtica ya sea
aguda o crnica y en algunos casos asintomtica.
La sintomatologa gastrointestinal incluye:
Nuseas
Vmitos
Dolor abdominal
Flatulencia
Diarrea acuosa
Tenesmo
Constipacin
Prurito anal
Baja de peso
Malestar general

Anorexia
Fiebre,
Prdida de sangre en las heces.
En pocos casos, se ha demostrado eosinofilia.

La infeccin sintomtica frecuentemente es auto limitada que se puede resolver en uno

a tres das sin requerir terapia especfica, pero en algunos casos tambin han sido
asociados a diarrea crnica de varias semanas de evolucin.
Recientemente, se ha relacionado B. hominis con manifestaciones extraintestinales de
tipo cutneas (como la urticaria crnica) y sinovitis.
Al igual como otros protozoos con papel patgeno la aparicin de la enfermedad
depender de la interaccin del parasito y el hospedero.
Se ha demostrado una mayor tasa de infeccin en pacientes homosexuales, tal vez
debido a las prcticas bucoanales.
B. hominis se ha encontrado en pacientes con algn grado de inmunosupresin, pero
an no se considera como un parsito oportunista. En la mayora de estos pacientes, se
han demostrado la coinfeccin con otros patgenos que podran ser los responsables
de la sintomatologa intestinal, principalmente en los pacientes HIV-SIDA.
6. EPIDEMIOLOGIA
Su transmisin es fecal- oral, incluyendo agua y alimentos contaminados.
Las malas condiciones de saneamiento bsico, hacinamiento y malnutricin
incrementan la prevalencia de esta parasitosis.
Es un parsito cosmopolita, pero su frecuencia de infeccin varia ampliamente.
Es ms frecuente en nios que en adultos, posiblemente los pocos hbitos higinicos y
un sistema inmunitario inmaduro jueguen un papel preponderante en esta mayor
prevalencia del parsito.

6.1 MUNDIAL
En pases tropicales, alcanza prevalencia desde 20 a 50% de infeccin, solo o
asociado a otros protozoarios intestinales patgenos o comensales.
A nivel mundial es considerado el protozoo intestinal ms comn, con una
prevalencia cercana al 50% en los pases en vas de desarrollo .
En Amrica los pases con mayor prevalencia a esta parasitosis son
(Canad, Estados Unidos, Mxico, Cuba, Honduras, Venezuela, Ecuador,
Paraguay, Brasil, Per, Argentina y Chile)

Siendo chile en donde se han encontrado tasas de prevalencia que varan entre
41,3% y 62,3%.
6.2 NACIONAL
El parasitismo intestinal en el Per tiene una alta prevalencia y constituye un
problema de Salud Pblica. Dentro de las 10 principales causas de muerte se
encuentran las enfermedades de origen infeccioso y parasitario con un 7,7% y se
menciona que uno de cada tres peruanos porta una o ms especies de parsitos
en el intestino.

7. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
El diagnostico se efecta principalmente con el examen parasitolgico seriado de
deposiciones con las tcnicas de concentracin habituales, identificando principalmente
su forma vacuolada.
El diagnostico microscpico no es fcil debido a la variedad de formas y de tamao.

7.1 Seriado de Heces y Cultivos:

Realizado en un laboratorio especializado en la identificacin de las
diferentes formas de B. hominis. Se pueden realizar tinciones especiales,
como tricrmica. Es importante, anotar el nmero de B. hominis por campo
40x, con el fin de orientar al clnico en su conducta teraputica.

7.2 Endoscopia y biopsia:

En casos excepcionales, se realizan estudios endoscpicos para verificar la
presencia parasitaria en muestras de mucosa tomadas durante el estudio.

7.3 Tcnicas inmunolgicas:

Se puede realizar inmunofluorescencia en heces para identificar B. hominis
en heces.
8. TRATAMIENTO
En la mayora de los casos, la infeccin es autolimitada. El tratamiento, se reserva
para aquellos casos, en la cual, la sintomatologa clnica persiste y se han descartado
otros agentes etiolgicos.
Las drogas antiprotozoarias han sido utilizadas en el tratamiento de estos pacientes.

De primera eleccin estn metrodinazol (agente anti protozoario) en dosis de

750 mg cada 8 horas durante 5 das.
Otras alternativas de tratamiento son emetina, dehidrometina, iodoquinol (se usa
en tratamientos de ciertas infecciones parasitarias de la medicacin intestino.
Este no se recomienda para el tratamiento de la diarrea de causa desconocida)
cotrimoxazol y furazolidona.

9. PREVENCION
La prevencin de la blastocistosis debe basarse en acciones de educacin sanitaria
tanto a nivel familiar, establecimientos de enseanza, agrupaciones comunitarias y un
adecuado saneamiento ambiental.
Es un importante que se tomen polticas para una buena calidad del agua potable ya
que es fundamental para prevenir estos tipos de enfermedades.
Lavar las manos y los alimentos antes de consumirlos
Control de vectores
Control de manipulacin de alimentos
Evitar las condiciones de hacinamiento
Evitar las prcticas sexuales buco-anales
Buena disposicin de excretas.

Figura 2. Prevencin lavado de manos

10. TEMA DE ACTUALIDAD

Monday, February 3 ,2014
This Month In Blastocystis Research (JAN 2014)
Investigations into the 'biodiversity' existing in a given host is interesting for a number of
reasons. One of these reasons has to do with how microorganisms present in our
bodies may impact each other or the host. Numerous fields of research are developing
at the moment at all levels from studies of gut microbes influencing host microRNA
response to bacterial infections to epidemiological/public health studies examining
the increased morbidity or risk associated with contracting infection/developing disease
given that some infection/disease is present already. Sometimes the reverse is seen,
namely that co-infection by multiple parasites is associated with a morbidity lower than
the morbidity seen when only one of the parasites is present. For instance, a 2012
study saw that children infected by bothPlasmodium falciparum (causing malaria) and
hookworm had lower odds of anemia and iron deficiency than their counterparts infected
with P. falciparum alone. Other authors have recently reviewedwhat they see as
compelling evidence of chronic viral and helminth coinfections capable of modulating
deleterious malaria-specific immune responses. Obviously such types of information are
critical to the development of control measures against malaria and helminth infections.
A Nigerian colleague of mine is currently exploring co-infections in quite a large Nigerian
population, and investigating associations between malaria and soil-transmitted
helminths;
I'm
thankful
to
be
involved.
Along
these
lines,
a
new
paper
sees
an
inverse
association
between Blastocystis carriage and tuberculosis/Mycobacterium tuberculosis infections
(TB). Dr Franke and colleagues carried out a casecontrol study to examine
associations between parasite infection and tuberculosis (TB) in children in Lima, Peru.
Logistic regression analyses revealed that Blastocystis infection was strongly associated
with a lower risk of TB (P = 0.002). Hence, the study seems to suggest
that Blastocystis carriage may protect against TB. The authors hypothesise that a proinflammatory/Th1 response potentially elicited byBlastocystis may protect against other
infections, such as TB. While we know very little about Blastocystisinduced immunity,
little seems to suggest that Blastocystis is related to a chronic pro-inflammatory
immunological alert. At least the colonic mucosa of patients with Blastocytis appears to
be normal by endoscopy. Given the prevalence of Blastocystis that we have found in the
aforementioned Nigerian study, I'd suspect very little TB to be present in this cohort...
The authors highlight a major limitation of their finding, namely the one related to the
directionality of the association: It might as well be TB 'protecting' against Blastocystis.
Maybe the behaviour (and thereby the exposure to Blastocystis) of patients with TB is
different from the behaviour of those who do not have TB; I don't think so though.
I could have wished that a similar analysis had been performed using another common
micro-eukaryote in children that the authors did not test for, namely Dientamoeba
fragilis. It would be useful to know whether the same association could be identified, or
whether the association was specific to Blastocystis. In fact, a general analysis of the
microbiota (16S/18S) would have been in place here to learn about other factors
potentially
responsible
for
the
observations.

On a different note, there is a paper out by Dr Poirier and his colleauges who have
been publishing extensively on Blastocystis, and who were the first ever to sequence
and annotate a nuclear genome ofBlastocystis. In this new article the authors present a
new set of primers applicable to all subtypes ofBlastocystis found in humans and
targeting the DNA of the mitochondrion-like organelle (MLO). This is reminiscent of the
primers used for barcoding (18S analysis), and indeed the primers were validated using
strains
for
which
18S
data
were
available.
The paper highlights a variety of interesting topics and discusses the overall applicability
of the two methods (18S barcoding vs. subtyping using the single-copy MLO rDNA). In
both of these scenarios the authors cloned the resulting PCR products to compare intraisolate genetic variability - something which in itself is very interesting. However, cloning
of PCR products is something that is not regularly done in most labs due to time and
money constraints. Direct sequencing of barcode products reveals the predominating
strain in a mixture, given that no other causes of preferential template amplification exist
(e.g. selective primers) and hence shows the consensus sequence; sequence traces
may partially or completely fail to reflect cases of mixed infection. However, the issue of
not detecting mixed ST infections or mixtures of the same subtype is generally
recognised.
En espaol:
Lunes, 03 de febrero 2014
Este mes en la Blastocystis Investigacin (JAN 2014)
Las investigaciones sobre la "biodiversidad" que existe en un equipo dado es
interesante por varias razones. Una de estas razones tiene que ver con cmo los
microorganismos presentes en nuestro cuerpo pueden afectar el uno al otro o el
anfitrin . Numerosos campos de investigacin estn desarrollando en este momento
en todos los niveles de estudio de los microbios intestinales que influyen en la
respuesta de microARN de acogida a las infecciones bacterianas de los estudios
epidemiolgicos de salud pblica / examinan el aumento de la morbilidad o el riesgo
asociado a contraer la infeccin / enfermedad de evolucin dado que alguna infeccin /
enfermedad es presentar ya . A veces la inversa se ve , a saber, que la co-infeccin por
mltiples parsitos se asocia con una morbilidad ms baja que la morbilidad visto
cuando slo uno de los parsitos est presente . Por ejemplo, un estudio de 2012 vio
que los nios infectados por tanto Plasmodium falciparum (que causa la malaria ) y la
anquilostomiasis tenan menos probabilidades de anemia y deficiencia de hierro que
sus contrapartes infectados con P. falciparum solo. Otros autores han revisado
recientemente lo que ven como evidencia convincente de coinfecciones virales crnicas
y helmintos capaces de modular las respuestas inmunes supresoras paludismo es
especfica. Obviamente tales tipos de informacin son fundamentales para el desarrollo
de medidas de control contra las infecciones de malaria y helmintos . Un colega de
Nigeria mo est estudiando coinfecciones en una poblacin bastante grande de Nigeria
, y la investigacin de las asociaciones entre la malaria y los helmintos transmitidos por
el suelo ; Estoy agradecido de estar involucrados.

En esta lnea, un nuevo documento ve una asociacin inversa entre el carro

Blastocystis y las infecciones de tuberculosis tuberculosis / Mycobacterium (TB) . Dr.
Franke y sus colegas llevaron a cabo un estudio de casos y controles para examinar las
asociaciones entre la infeccin del parsito y la tuberculosis (TB ) en nios en Lima,
Per . Los anlisis de regresin logstica revel que la infeccin por Blastocystis
fuertemente asociada con un menor riesgo de TB ( P = 0,002). Por lo tanto , el estudio
parece sugerir que el transporte Blastocystis puede proteger contra la tuberculosis. Los
autores plantean la hiptesis de que una respuesta pro-inflammatory/Th1
potencialmente provocados por Blastocystis puede proteger contra otras infecciones ,
como la tuberculosis . Aunque sabemos muy poco acerca de la inmunidad inducida por
Blastocystis , poco parece sugerir que Blastocystis est relacionada con una alerta
inmunolgica pro-inflamatoria crnica. Al menos la mucosa del colon de pacientes con
Blastocytis parece ser normal por endoscopia . Dada la prevalencia de Blastocystis que
hemos encontrado en el estudio de Nigeria antes mencionado , me sospecho que muy
poco TB de estar presente en esta cohorte ...
Los autores ponen de relieve una importante limitacin de su hallazgo , a saber, el
relativo a la direccionalidad de la asociacin : Podra ser tambin la tuberculosis
"proteccin" contra Blastocystis . Tal vez el comportamiento ( y por tanto la exposicin a
Blastocystis ) de los pacientes con TB es diferente de la conducta de aquellos que no
tienen la tuberculosis ; Yo no lo creo , aunque.
Hubiera deseado que un anlisis similar se haba realizado utilizando otro micro eucariota comn en los nios que los autores no probaron para , a saber Dientamoeba
fragilis . Sera til saber si la misma asociacin se pudo identificar , o si la asociacin
era especfica para Blastocystis . De hecho, un anlisis general de la microbiota (
16S/18S ) hubiera estado en el lugar para obtener informacin sobre otros posibles
factores responsables de las observaciones.
10.1 NOTICIA DE ACTUALIDAD
Thursday, February 13, 2014
Announcement of The 1st International Blastocystis Symposium
It is a pleasure for me to be able to announce that Dr. Funda Dogruman-Al and I have
started
planning
'The 1st International Blastocystis Symposium'
to be held in Ankara, May 28-29 in 2015 under the auspices of Gazi University, Faculty
of
Medicine,
Ankara,
Turkey.
We have received very positive responses so far from quite a few of the leading
scientists in Blastocystisresearch expressing their interest in the symposium, and
obviously our goal is to be able to raise significant and relevant funding to cover at least
some of the expenses related to the meeting. Already, a total of 20,000 has been
raised, but we hope for a lot more. It may seem like a long time ahead, but we believe
that by starting this early, we should stand a fair chance of arranging and completing a
meeting that will enable a strengthening of global cooperative networks so as to

10

increase the sharing of ideas, data, expertise, and best practices in this field to the
mutual benefit of the researchers and organisations involved.
The past few years have seen a substantial surge in Blastocystis research in many
areas, and so the main foci of this symposium will be:
Diagnosis and molecular characterisation
Epidemiology
Evolutionary biology and advances in genomics
Intestinal ecology
Clinical significance including potential relationship to irritable bowel syndrome
(IBS)The symposium will also serve as an initial forum to address and discuss critical
questions including:
What is the evidence of Blastocystis pathogenicity?
If Blastocystis may be pathogenic, what then are the factors involved? Which
mechanisms could potentially be involved in the development of disease?
Could
specific host factors be responsible for the development of
symptomatic Blastocystisinfections, and if so, how can these be identified?
How can Blastocystis infections be controlled?
Is
there any correlation between the human intestinal microbiota
and Blastocystis carriage?
How can novel technology and multi-disciplinary approaches assist in answering
fundamental questions concerning the clinical significance of Blastocystis?
We hope that the symposium will attract not only experts on Blastocystis, but also
biologists and medical doctors in the fields of clinical microbiology, infectious diseases,
gastroenterology, evolutionary biology, and microbial ecology. Certainly, those who have
expressed interest so far cover a wide spectrum of these research areas.
En espaol:
Jueves, 13 de febrero 2014
Anuncio del 1er Simposio Internacional Blastocystis
Es un placer para m estar en condiciones de anunciar que el Dr. Funda Dogruman -Al y
yo hemos comenzado la planificacin
El 1er Simposio Internacional Blastocystis '
Se celebrar en Ankara, 28 a 29 mayo de 2015 bajo los auspicios de la Universidad de
Gazi , Facultad de Medicina , Ankara , Turqua.
Hemos recibido una respuesta muy positiva hasta ahora de un buen nmero de los
principales cientficos en la investigacin de Blastocystis que expresan su inters en el
simposio, y, obviamente, nuestro objetivo es ser capaz de recaudar fondos significativos
y relevantes para cubrir por lo menos algunos de los gastos relacionados con la
reunin. Ya, un total de 20.000 se ha planteado, pero esperamos que para mucho
ms.Puede parecer mucho tiempo por delante, pero creemos que al iniciar tan
temprano , deberamos tener una oportunidad justa de organizar y completar un
encuentro que permitir el fortalecimiento de redes de cooperacin a nivel mundial a fin
de aumentar el intercambio de ideas, datos , experiencia y las mejores prcticas en este

11

campo , en beneficio mutuo de los investigadores y las organizaciones involucradas.Los

ltimos aos han visto un aumento sustancial en la investigacin Blastocystis en
muchas reas, por lo que el foco principal de este simposio sern:
Diagnstico y caracterizacin molecular
Epidemiologa
La biologa evolutiva y los avances de la genmica
Ecologa intestinal
Significado clnico incluyendo posible relacin con el sndrome del intestino irritable (
IBS)
El simposio tambin servir como un foro inicial para abordar y debatir cuestiones
crticas, entre ellas:
Cul es la evidencia de Blastocystis patogenicidad ?
Si Blastocystis puede ser patgenas, lo que entonces son los factores involucrados?
Qu mecanismos potencialmente podran estar involucrados en el desarrollo de la
enfermedad?
Podran los factores del husped especfico responsable de la aparicin de
infecciones sintomticas Blastocystis , y si es as , cmo se pueden identificar?
Cmo se pueden controlar las infecciones por Blastocystis ?
Hay alguna relacin entre la microbiota intestinal humana y el carro Blastocystis ?
Cmo pueden ayudar la tecnologa y multidisciplinarios nuevos enfoques para
responder preguntas fundamentales sobre el significado clnico de Blastocystis ?
Esperamos que el simposio atraer no slo a expertos en Blastocystis , sino tambin a
bilogos y mdicos en los campos de la microbiologa clnica, enfermedades
infecciosas , gastroenterologa , la biologa evolutiva y la ecologa microbiana.
Ciertamente , aquellos que han expresado su inters cubren hasta ahora un amplio
espectro de estas reas de investigacin

12

11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Antonio Atias, Parasitologa mdica. FACP- ASIM facultad de medicina humana

universidad de chile, ed. Mediterrneo, (pg.161-163) Lima, Per.
2. Blastocystis hominis intestinal parasite (2010); recuperado , el 07 de mayo del
2014, http://www.blastocystishominis.org/
3. Blastocistosis.PDF;1-3 ; recuperado , el 07 de mayo del 2014, de
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_medicina/secgeohelmintiasis/gl
osario/Blastocistosis.pdf
4. Casquina, G. L. & Martnez, B.E. (2011). Prevalencia y epidemiologa del
parasitismo intestinal en escolares de nivel primario de Pucchn, Caman,
Arequipa, Per, 2006. Neotropical Helminthology, vol. 5; recuperado , el 07 de
mayo
del
2014,
de
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/neohel/v5n2/pdf/a11v5n2.pdf.pdf
5. Christen Rune Stensvold (21014, 3 de febrero); This Month In Blastocystis
Research (JAN 2014) recuperado , el 07 de mayo del 2014, de
http://www.blastocystis.net/2014/02/this-month-in-blastocytis-research-jan.html
6. Rubn Mercado (2004).Blastocistosis: enteroparasitosis ms frecuente en Chile
reviste medica de Chile, recuperado , el 07 de mayo del 2014, de
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S003498872004000800017
7. Teresa Uribarren Berrueta (2014,23 de abril). Departamento de Microbiologa y
Parasitologa, Facultad de Medicina, UNAM; recuperado , el 07 de mayo del
2014,
de
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/blastocistosis.htm

13

14