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Un homlogo Salmonella typhi del bacterifago muramidase que controla la secrecin de la toxina tifoidea
A diferencia de otros serotipos de Salmonella, que pueden infectar una amplia gama de huspedes que causan
la infeccin autolimitante por: Salmonella typhi es un patgeno exclusivamente humano que causa la fiebre
tifoidea, una enfermedad sistmica que amenaza la vida.
La toxina tifoidea es un factor de virulencia nico de Salmonella typhi, que se expresa cuando las bacterias se
encuentran dentro de las clulas de mamferos. En el artculo se muestra que un N-acetil-b-D-muramidase
similar a fago-endolisinas codificados dentro del mismo islote de patogenicidad como la toxina se requiere
para la secrecin de la toxina tifoidea.
Y el anlisis gentico y funcional de TTSA revel aminocidos nicos en su dominio de unin peptidoglicano
predicho que son esenciales para la secrecin de protenas que distingue a esta protena de otros homlogos.
Se propone que TTSA define un nuevo mecanismo de secrecin de protenas recientemente desarrollado de la
mquina que media la liberacin del fago.
INTRODUCCIN
Salmonella enterica serovar typhi (S. typhi) es la causa de la fiebre tifoidea, que mata a unas 200.000 personas cada ao.
En contraste con otros serotipos de S. enterica, S. typhi slo puede infectar a los humanos causando una enfermedad
sistmica que amenaza la vida.
Las bases moleculares de estas diferencias notables en la presentacin de la enfermedad y la gama de huspedes, son
poco conocidos aunque se cree que son el resultado de la reduccin del genoma y la adquisicin de genes nicos. Uno
de los pocos factores nicamente presentes en S. typhi virulencia es la toxina tifoidea, una toxina AB5 notable con
similitudes a la tos ferina y citoletal toxinas de distensin. Toxina tifoidea tiene una biologa nica en que slo se expresa
cuando S. typhi es dentro de las clulas husped de mamfero.
Despus de su sntesis y secrecin de las bacterias, la toxina es transportada por intermedios de soporte de la vacuola
que contiene Salmonella-al espacio extracelular, desde donde se obtiene acceso a las clulas a travs de rutas
autocrinos o paracrinos objetivo. Los mecanismos por los que la toxina es secretada por las bacterias son desconocidos.
Los tres componentes de la toxina de la fiebre tifoidea tienen seales de secrecin cannicas, lo que implica que, al igual
que otras toxinas AB5, la maquinaria SEC exporta los componentes de la toxina al periplasma donde se ensamblan en
una holotoxina.
Sin embargo, no hay informacin sobre cmo la holotoxina se sale de las bacterias antes de su embalaje en vehculos de
transporte.
Aqu, muestran que un N-acetil-B-D-muramidasa similar a endolisinas fagos codificados dentro del mismo islote de
patogenicidad ya que se requiere la toxina para la secrecin de la toxina tifoidea. Se identificaron una regin crtica en
los peptidoglicano carboxi-terminal (PG). Encuadernacin regin de esta enzima que es necesaria para llevar a cabo
funciones de secrecin de protenas. Proponemos que esta muramidasa es el resultado de la adaptacin evolutiva de
una enzima de fago para conformar un nuevo mecanismo de secrecin de la protena. Por ltimo, la bioinformtica
evidencia que sugiere que el mecanismo de secrecin de protenas descrito aqu est muy extendida en las bacterias.
RESULTADOS Y DISCUSIN
TTSA se requiere para la secrecin de la toxina tifoidea
El islote genmico que codifica la toxina tifoidea tambin contiene otros dos genes no caracterizados, sty1887
y sty1889. Como genes relacionados funcionalmente a menudo se codifican en estrecha proximidad entre s, se
investig la posible participacin de estos genes en la secrecin de la toxina tifoidea. Secrecin de la toxina tifoidea no
puede ser estudiada in vitro, ya que sus componentes no se expresan. Por lo tanto, investigaron la secrecin de la toxina
por tincin de inmunofluorescencia de CDTB, una subunidad de la toxina tifoidea, en las clulas epiteliales en cultivo
infectadas con S. Typhi. Estudios anteriores han demostrado que varias horas despus de la infeccin, la toxina de la
fiebre tifoidea pueden verse en puntos lagrimales que irradia de la vacuola S. Typhi que contiene y la difusin a travs de
toda la clula.
Por lo tanto, utilizando la aparicin de estos puntos lagrimales como un ensayo para medir la secrecin de la toxina
tifoidea de la clula bacteriana. Las clulas infectadas con una cepa mutante de S. Typhi que porta una delecin de
sty1887 mostraron un patrn de tincin que era indistinguible de la de las clulas infectadas con el tipo salvaje. En
contraste, las clulas infectadas con una cepa de S. Typhi que porta una delecin en sty1889 no mostraron tincin

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puncta CDTB, aunque los niveles de expresin CDTB en el mutante eran indistinguibles de las de tipo salvaje. La
introduccin de un plsmido que codifica sty1889 efectivamente restaurado tincin puntos lagrimales.
Expresin de la protena El macho periplsmico en intracelular S. Typhi no result en su deteccin en cualquiera de la
superficie bacteriana o en puntos lagrimales igualmente despus de tratamiento de muestras para la tincin, lo que
indica que la deteccin de CDTB de tipo salvaje en bacterias intracelulares no se debi a inespecfica fuga de protenas
periplsmicas o lisis bacteriana. Estos resultados indican que Sty1889 se requiere para la secrecin de la toxina de la
clula bacteriana, y por lo tanto renombraron TTSA (para la secrecin de la fiebre tifoidea toxina A).
Para examinar si TTSA fue co-regulado con los genes de la toxina de la fiebre tifoidea, probaron su patrn de expresin
durante la infeccin. Hemos encontrado que, al igual que la toxina tifoidea, TTSA no se detect cuando S. Typhi se
cultiv en caldo L. Sin embargo, TTSA se detect en las clulas epiteliales cultivadas a pesar de que requieren tiempos de
infeccin ligeramente ms largos que los requeridos para detectar la toxina tifoidea. Tomaron en conjunto, estos
resultados indican que TTSA se requiere para la secrecin de la toxina, y que, en consonancia con esta funcin, su
expresin correlacionada con la de la toxina tifoidea.

TTSA pertenece a una familia de muramidases bacterifagos

Stojkovic y Rothman-Denes han informado anteriormente de que el colifago N4 gp61 N-acetilmuramidasa
define una nueva familia de muramidases bacterifagos y notado la presencia de homlogos de esta familia de
protenas en S. enterica incluyendo sty1889 (que ahora hemos cambiado el nombre TTSA). Esta familia de protenas se
compone de un dominio de lisozima como amino-terminal que pertenece a la familia glucsido hidrolasa 108, y un
dominio de unin putativa PG-C-terminal. La mayora de los miembros de esta familia, incluyendo TTSA, carecen de una
seal de secrecin secdependent N-terminal identificable y se entregan al periplasma por holinas, un grupo diverso de
protenas de membrana pequeas que ms a menudo se codifican inmediatamente adyacente a las muramidases. En
una manera regulada, holinas forman un poro en la membrana interna que permite el paso de las enzimas lticas del
peptidoglicano. Curiosamente, en las proximidades de TTSA no hay genes que podran codificar una protena con
caractersticas similares a los esperados en una holina (una protena pequea con uno o dos dominios transmembrana).
A pesar de los repetidos esfuerzos, no fueron capaces de demostrar in vitro actividad muramidasa con purificada TTSA
usando zimografa estndar. Observaciones similares se han hecho con anterioridad para otros miembros de esta familia
de protenas.
Por lo tanto, se determin su actividad muramidasa putativo utilizando enfoques indirectos alternativos. Se ha
observado que, en ausencia de holinas (o en ausencia de una seal de activacin que dara lugar a su actividad), esta
familia de muramidases todava es capaz de inducir la lisis bacteriana cuando se sobreexpresa y despus de la adicin de
bajas concentraciones de cloroformo. Se cree que el cloroformo desestabiliza la membrana interna permitiendo que la
"fuga" de los muramidases citoplsmicos en el espacio periplsmico. De acuerdo con su actividad muramidasa putativo,
TTSA era capaz de inducir la lisis bacteriana en estas condiciones.
Aunque cada muramidasa ejerce su funcin junto con un holina codificada en sus inmediaciones, algunos holinas
muestran poca especificidad y de hecho son capaces de transportar muramidases no relacionados. Por lo tanto para
poner a prueba an ms la actividad muramidasa putativo de TTSA, que co-expresados con Sty0015, un holina para el
muramidasa adyacente codificado Sty0016, tanto codificados distante del locus toxina tifoidea.
Se encontr que la co-expresin de TTSA y Sty0015 condujo a una rpida lisis bacteriana. En cambio, la expresin de
TTSA solo no lo hizo. Estos resultados demuestran adems que TTSA exhibe actividad muramidasa y sugieren que TTSA
es probable que ejerza su actividad en conjuncin con una holina co-regulados codificada en otro lugar en el genoma de
S. Typhi.
Tal holina no es Sty0015 ya que encontramos la secrecin de la toxina de tipo salvaje en un mutante Dsty0015 S. Typhi.
Se ha informado anteriormente de que la actividad muramidasa de la familia de protenas TTSA se asocia con un cido
glutmico cataltico situado dentro de un motivo conservado EGGY situado cerca de su extremo N-terminal. La mutacin
en TTSA de un residuo de cido glutmico dentro de este motivo (TtsAE14A) aboli su capacidad para inducir la lisis
bacteriana ya sea en adicin de cloroformo o despus de su co-expresin con el Sty0015 holina. Estos resultados apoyan
la nocin de que es un TTSA muramidasa. Expresin inducible de un TTSA mutante que contiene una seal de DsbA seg
en su trmino N tambin condujo a la lisis bacteriana. Sin embargo, no fue posible establecer las condiciones
experimentales con las que podramos observar sistemticamente las diferencias entre los de tipo salvaje y el mutante
cataltico. Se prob entonces el requisito de la actividad predicho muramidasa TTSA para la secrecin de la toxina
tifoidea. De acuerdo con el requisito de su actividad enzimtica predicho para la secrecin de la toxina, no se detectaron
puntos lagrimales toxina tifoidea en las clulas infectadas con una cepa que expresa TtsAE14A S. Typhi.

Se tom en conjunto, estos resultados indican que TTSA es una muramidasa y que se requiere esta actividad enzimtica
para la secrecin de la toxina tifoidea o liberacin.
Especificidad funcional de la familia de protenas TTSA
Para investigar si la secuencia de aminocidos de TTSA podra ser correlacionada con su adaptacin especfica
para mediar la secrecin de la toxina tifoidea, hemos generado un rbol filogentico de homlogos TTSA que presenta al
menos 50% de identidad. Adems, usaron el fago Herramienta de bsqueda (PHAST) para analizar los loci de todos los
homlogos representados en el rbol para identificar posibles prophages.
Los diferentes muramidases agrupan en tres grandes grupos en el rbol filogentico, las que nos referimos de manera
arbitraria como grupo 1 (que alberga TTSA), 2 y 3.
Como era de esperar para esta familia de muramidases, muchos de los homlogos TTSA fueron codificados en el
contexto de genomas completos o incompletos de fagos. Sin embargo, no se detectaron genes phagerelated en la
vecindad de un nmero significativo de miembros de la familia que sugieren un conjunto mucho ms diverso de funcin
para esta familia de protenas. Aunque no se encontraron muramidases asociados con los genomas de fagos en los tres
grupos filogenticos, hubo menos muramidases fagos asociado dentro del grupo 2.
Si esta observacin sugiere se desconoce una funcin especfica asociada a este subgrupo de muramidases. Sin
embargo, TTSA, que muy probablemente no tiene una funcin de fago-asociado, no clster en este grupo, aunque
Zymomonas mobilis ZlyS, que ha sido propuesto para activar la secrecin de un levansucrasa extracelular y la invertasa,
lo hizo. De acuerdo con el mecanismo ms comn asociado con el transporte de estos muramidases citoplasmticos a
travs de la membrana interna, hemos sido capaces de identificar holinas codificados inmediatamente adyacente a la
mayora de los muramidases hemos analizado. Curiosamente, una excepcin fue TTSA, ya que no fuimos capaces de
identificar en sus inmediaciones cualquier protena que muestra las caractersticas que se esperan de un holina putativo,
lo que sugiere que podra TTSA ser transportado por un holina codificado en otras partes del cromosoma que es coexpresada con la fiebre tifoidea toxina. De nota, en varios casos, encontramos toxinas o enzimas extracelulares
predichos codificados inmediatamente adyacente a Muramidasa / pares Holn, incluyendo una quitinasa codificada en
las proximidades de la / sty0016 holina / par endolisina S. Typhi sty0015 (Fig 3 y Tabla S1 en lnea). Este hallazgo sugiere
que el mecanismo de secrecin descrito aqu podra no ser nica a la toxina tifoidea, sino ms bien generalizada en
bacterias.
En la mayora de estos casos, no se detectaron secuencias de fagos en estos loci que sugieren que, al igual que en el caso
de TTSA, la holina / pares Muramidasa han sido cooptado desde sus orgenes de fagos para llevar a cabo funciones de
secrecin de protenas.
Para obtener una perspectiva de los posibles determinantes de especificidad funcional dentro de esta familia de
protenas, hemos probado si los miembros de otros grupos filogenticos podran complementar un mutante DttsA S.
Typhi. Elegieron un miembro representante de los grupos filogenticos codificadas por S. enterica para evitar la
expresin de potencial y / o problemas de uso de codones. Encontrando que ni S. Typhi Sty0016 ni S. Enteritidis Sen1395
pertenecientes a los grupos 2 y 3, respectivamente, fueron capaces de complementar un mutante DttsA S. Typhi para la
secrecin de la toxina, a pesar del hecho de que ambas protenas es probable para ser enzimticamente activo como,
como TTSA, su sobreexpresin dio lugar a la lisis bacteriana. Estos resultados indican que a pesar de la gran similitud
estructural, estos muramidases estn adaptados para llevar a cabo funciones especficas.
El C-terminal de TTSA determina la funcin de secrecin
Para identificar los factores determinantes dentro TTSA que son importantes para llevar a cabo las funciones
de secrecin de protenas, se analiz la capacidad de una serie de quimeras entre TTSA y la complementacin no
muramidasa Sen1395 para complementar un mutante S. Typhi DttsA para la secrecin de la toxina tifoidea. Esta familia
de protenas se compone de una glicosil hidrolasa (GH) de dominio en el extremo N y un dominio de unin PG-en el C
terminal. Hemos sustituido el dominio de GH TTSA para un dominio equivalente de Sen1395. La quimera resultante, as
como otras quimeras que llevan segmentos ms pequeos de este dominio, era capaz de complementar el mutante S.
Typhi DttsA. Estos resultados indican que los factores determinantes de especificidad que permiten TTSA para llevar a
cabo su funcin especializada deben estar dentro del dominio PG vinculante. Consistente con esta hiptesis, una
quimera que consiste en el dominio de GH TTSA y el dominio de unin de PG-Sen1395 no complementar el mutante S.
Typhi DttsA a pesar del hecho de que era enzimticamente activa y exhibi de tipo salvaje los niveles de expresin de la
protena quimrica. Para delimitar la regin de especificidad, hemos construido ms quimeras con una proporcin
creciente de la terminal N de Sen1395 incluyendo partes de su dominio de unin PG-.
Han encontrado que una quimera que consiste en todos menos los ltimos 32 aminocidos de Sen1395 era capaz de
complementar el mutante S. Typhi DttsA, lo que indica que los determinantes de especificidad que confieren TTSA su

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capacidad para llevar funcin de la secrecin de la toxina tifoidea cabo deben estar dentro de sus ltimos 32
aminocidos.

Se compar la secuencia de aminocidos de esta regin de TTSA con la regin equivalente de Sen1395 y se identificaron
varios aminocidos que no se conservan entre estas dos muramidases y por lo tanto potencialmente importantes para la
funcin TTSA. Pusimos a prueba esta hiptesis mediante el cambio de estos residuos en TTSA en los residuos
equivalentes presentes en Sen1395.
Encontraron que el cambio de Q154, Q164, I174 y R179 en los aminocidos correspondientes presentes en Sen1395 no
afecta a la funcin TTSA. Sin embargo, un mutante TTSA, en la que la asparagina 166 se cambi a cido asprtico
(presente en Sen1395), fue incapaz de complementar el mutante S. Typhi DttsA para la secrecin de la toxina tifoidea.
Adems, se encontr que, sorprendentemente, simplemente cambiando el residuo de cido asprtico en Sen1395 en
asparagina (presente en TTSA en esa posicin) permiti que esta muramidasa para restaurar la secrecin de la toxina
tifoidea a un mutante S. Typhi DttsA. La sobreexpresin de TtsAN166D (incapaz de complementar el mutante DttsA para
la secrecin de la toxina tifoidea) condujo a S. Typhi lisis despus del tratamiento cloroformo, lo que indica que la
introduccin de estas mutaciones no afecta a su actividad enzimtica. Estos resultados no slo indican que la N166 es
fundamental para la funcin TTSA pero sugieren que los cambios muy de menor importancia en el dominio PG-unin de
los miembros de esta familia muramidasa pueden dar lugar a cambios significativos en su funcin y especificidad,
presumiblemente mediante la alteracin de sus mecanismos de focalizacin.
Se examinaron otros muramidases la presencia de N166 y encontramos que este aminocido est presente en muchos
miembros de la familia.
Expresaron uno de estos miembros, la Yersinia enterocolitica Ye1815, en la cepa mutante S. Typhi DttsA y descubri que
era capaz de complementar esta cepa para la secrecin de la toxina tifoidea, en consonancia con la importancia de la
N166 en conferir estos muramidases la capacidad de funcionar en la secrecin de la protena. Sin embargo, Sty0016, que
tiene el residuo N166, no fue capaz de complementar la cepa mutante S. Typhi DttsA para la secrecin de la toxina
tifoidea a pesar del hecho de que su sobreexpresin en S. Typhi indic que es enzimticamente activa. Este hallazgo
indica que, adems de N166, otros residuos deben contribuir a la especificidad TTSA. De hecho, la estructura de
modelado de esta regin predice que N166 se encuentra dentro de un bucle delimitado por dos hlices bien
organizadas. Por tanto, es posible que la configuracin general del bucle podra ser importante para la orientacin.
Curiosamente, el anlisis filogentico de los ltimos 36 aminocidos de miembros de la familia TTSA agrupado todas las
muramidases capaces de complementar la toxina tifoidea dentro del mismo grupo, indicando la presencia de
caractersticas comunes dentro de este dominio en estos homlogos de protena. Se tom en conjunto, estos resultados
indican que la informacin situada dentro de la terminal C de esta familia de enzimas determina la especificidad
funcional, tal vez por la orientacin de la actividad enzimtica con el fin de perturbar la capa de PG en las proximidades
de una piscina periplsmico de la protena o complejo de protenas (por ejemplo, la toxina tifoidea) destinado a ser
secretada por esta va.
OBSERVACIONES FINALES
Se identific una muramidasa que pertenece a una familia de protenas ampliamente distribuida que se requiere para la
secrecin de la toxina tifoidea de S. Typhi. Por lo cual propusieron que estos muramidases representan una
adaptacin reciente de enzimas de fago-asociado para llevar a cabo una funcin diferente.
De acuerdo con esta hiptesis: Sty1887, situada inmediatamente adyacente a TTSA, est previsto para codificar un
homlogo de protenas de la cola del fago.
Adems, estas enzimas definen un nuevo sistema de secrecin de protenas que es probable que sea extendido en
bacterias como hemos encontrado varios casos en que las toxinas o enzimas extracelulares predichos se codifican
inmediatamente adyacente a Holn-pares/muramidasa.
MTODOS
Las cepas bacterianas se construyeron como se describe anteriormente. Microscopa de inmunofluorescencia y ensayos de infeccin de
clulas cultivadas, y anlisis de transferencia Western se realizaron como se ha descrito anteriormente. Ensayos bacteriolticos despus
de la adicin de 0,3% CHCl3 se llevaron a cabo a lo descrito previamente con algunas modificaciones. Brevemente, las bacterias se
cultivan durante la noche se diluyeron hasta alcanzar una DO600nm de 0,1 en medio LB fresco que contena 0,2% de arabinosa.
Despus de 60 min de la induccin, 0,3% de CHCl3 se aadi a los cultivos y la lisis se control durante 60 min adicionales midiendo su
DO600 nm. Para bacteriolisis holina asistida, cultivos de una noche se diluyeron en medio LB fresco a una DO600nm de 0,1 y an ms

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cultivaron hasta alcanzar una DO600nm de 0,5. En ese momento, se aadi 0,002% de arabinosa para inducir la holina y / o endolisina
expresin, y la lisis bacteriana se control durante 280 min adicionales midiendo la DO600nm de los cultivos bacterianos. Los rboles
filogenticos se generaron utilizando ClustalW2, homlogos de Sty1889 se identificaron utilizando BLASTP y genes de fagos se
detectaron utilizando el PHAST. Una descripcin ms detallada de los mtodos aparece en los materiales suplementarios.