Anda di halaman 1dari 7

VII.

PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan isolasi protein total sel bakteri dan
elektroforesis

SDS

PAGE

(Sodium

Dodecyl

SulphatePolyacrilamide

Gel

Electrophoresis) yang menggunakan gel poliakrilamida yang dikombinasikan dengan


SDS. Penggunaan poliakrilamida mempunyai keunggulan dibandingkan dengan gel
lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matriks dengan
sampel, sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan
protein secara sempurna, gel poliakrilamida ini mempunyai daya pemisahan yang cukup
tinggi (anam, 2009),memiliki kapasitas muat yang tinggi hingga 10 mikrogram DNA dan
dapat dimuat ke dalam sumur tunggal (1 cm x 1 mm) tanpa kehilangan resolusi. metode
SDS page ini lebih mudah digunakan dan dapat mengeluarkan hasil dengan cepat dan
hasilnya tidak perlu dilihat di bawah sinar UV. Sementara itu kerugian dari metode SDS
page ini adalah mobilitas fragmen dapat dipengaruhi oleh komposisi dasar sehingga dapat
mengganggu keakuratan pita/band yang terbentuk. Penggunaan SDS berfungsi untuk
mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai deterjen yang mengakibat ikatan
dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu juga
mercaptoetanol.
Pada percobaan kali ini kita menggunakan protein kolagenase. Kolagenase ini
merupakan enzim yang umumnya dibentuk oleh bakteri Clostridium, Helicobacter pylori,
dan banyak bakteri anaerob yang merupakan enzim ekstraseluler, bersifat dapat
menghancurkan kolagen sehingga menyebabkan bakteri dapat menyebar ke jaringan.
Sebelum dielektroforesi, sampel harus disiapkan terlebih dahulu dengan
ditambahkan buffer sampel yang terdiri dari 0.6 mL trisHCl 1M pH 6,8; 5 mL gliserol 50
%; 2 mL SDS 10%; 0.5 mL 2-merkaptoetanol yang ditambahkan dengan perbandingan
sampel : buffer sampel = 1:1. Dilihat dari komposisinya buffer sampel diatas merupakan
buffer sampel reducing karena mengandung reducing agent yaitu 2-mercaptoetanol. 2Mercaptoetanol dapat memecah ikatan disulfida pada protein, baik pada struktur tertier
maupun kuarterner. Karena kemampuan untuk mengganggu struktur protein. 2Mercaptoetanol juga seringkali terlibat dalam reaksi enzimatis untuk menghambat
oksidasi sehingga dapat mempertahankan aktivitas protein. 2-Mercaptoetanol sangat
toksik, bila terhirup dapat menyebabkan iritasi saluran pernafasan, bila terkena kulit dapat
menimbulkan iritasi, bila tertelan dapat mengakibatkan muntah, luka lambung, dan

berpotensi menimbulkan kematian bila terjadi paparan hebat, sehingga pada


pengerjaannya harus memakai alat pelindung diri seperti masker dan sarung tangan
nitrile. pH yang digunakan pada pada buffer sampel yaitu 6,8. pH ini dibawah pH
isoelektrik protein yaitu pH 8, sehingga nantinya protein akan tersusun secara berjajar
pada bagian bawah dari stacking gel saat elektroforesis. Gliserol dalam buffer sampel ini
digunakan untuk menambah densitas. SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein yang
mengakibat ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam
gel. Sampel didenaturasi sesaat sebelum mengisi gel. Karena protein sampel dapat
kembali ke bentuk awal jika didenaturasi jauh sebelum loading dan dapat menghasilkan
fragmen yang tidak tentu.
Berdasarkan preparasi sampel, elektroforesis dibagi dua yaitu : (1) native atau
nondenaturing atau nondisosiasi PAGE, dan (2) denaturing atau disosiasi atau SDSPAGE. Pada sistem native atau nondenaturing PAGE (non-dissociation), protein
diseparasi pada bufer yang mempunyai pI tertentu. Ketika bergerak di dalam gel, protein
tetap berada dalam struktur tiga dimensi (native). Ukuran suatu protein ditentukan oleh
berat molekul, tingkat hidrasi dan bentuknya. Pada sistem ini, sulit memperkirakan pola
migrasi protein. Pada umumnya, sistem ini hanya dipakai untuk memisahkan sampel
dengan berat molekul yang sama berdasarkan muatannya. Sistem ini tidak cocok untuk
diterapkan pada praktikum ini, karena pada praktikum ini praktikan hanya menggunakan
satu protein dan ingin menentukan berat molekulnya sehingga lebih cocok menggunakan
sistem denaturing menggunakan SDS-PAGE. Pada sistem denaturing yaitu pada saat
preparasi sampel ditambahkan SDS seperti yang dilakukan pada praktikum ini, protein
dielektroforesis pada bufer yang juga mengandung detergen ionik SDS. SDS akan
mengikat pada bagian hidrofobik dan residu asam amino sehingga menyebabkan
perubahan struktur tiga dimensi protein (menjadi unfolding). Selain itu, SDS juga
menyebabkan seluruh rantai peptida bermuatan negatif.Dalam kondisi ini, ukuran protein
hanya tergantung pada berat molekulnya. Kompleks protein-SDS bergerak dalam gel
poliakrilamid dengan kecepatan yang tergantung pada berat molekulnya.Dengan
demikian maka, SDS-PAGE digunakan untuk menentukan berat molekul suatu crude
protein.
Pada praktikum ini dilakukan pembuatan dua jenis gel berbeda, yaitu separating gel
15 % dan stacking gel 5%. Separating gel terdiri dari bahan yang digunakan dalam
praktikum yaitu air deionisasi steril 1457,5 L digunakan sebagai pelarut polar dan

sebagai media polar untuk aliran listrik dalam gel. Air deionisasi adalah air yang tidak
mengandung garam dan mineral-mineral. Perbedannya dengan air suling adalah air suling
dibuat dengan cara mendestilasi air, sedangkan air deionisasi dibuat dengan cara menarik
garam-garam dengan resin bermuatan listrik. Air deionisasi dibuat dengan cara
mengambil air yang masih mengandung mineral dan garam-garam, lalu dimasukkan ke
sebuah resin bermuatan listrik yang dapatmenarik garam-garam dan mineral tersebut.
Sehingga nantinya pada air hanya mengandung molekul H2O, dengan hanya
terkandungnya molekul H2O menyebabkan air deionisasi bersifat lebih polar dibanding
dengan air suling., akrilamid 30% 2500 L sebagai bahan untuk membentuk pori-pori
dalam gel agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya, 1M Tris-HCl pH 8,8 937,5
L untuk menstabilkan pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah, SDS 10%
50L digunakan untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding
dan menyelubungi protein dengan muatan negatif sehingga protein berbentuk linier dan
member muatan negatif pada protein, fungsi pembentukan muatan negatif ini untuk
memudahkan separasi menuju kutub positif saat dilewatkan arus (Janson, 1998) dan
untuk mengikat protein sehingga bagian nonpolar dari SDS tersembunyi ke dalam bagian
nonpolar (hidrofobik) dari protein dan gugus sulfat dari SDS yang bermuatan negatif
berhubungan langsung atau terekspos pada pelarut, Ammonium persulfate (APS) 10%
50L digunakan sebagai mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan molekul
akrilamida yang lainnya membentuk rantai polimer yang panjang (polimerasi gel
poliakrilamid), dan TEMED (N,N,N,N tetrametilendiamin) 50L digunakan sebagai
katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat, katalisator reaksi
polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam
pemisahan protein dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir
agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur.
Larutan gel yang telah dibuat dimasukkan dalam plate untuk mencetak gel, lalu
pemberian aquades diatas separating gel yang setengah padat bertujuan untuk meratakan
permukaan separating gel, menghambat polimerisasi dan mencegah difusi O2 yang dapat
menghambat proses migrasi (Boyer 1993: 12). Setelah padat aquades diserap agar dapat
dilakukan proses selanjutnya yaitu penambahan stacking gel diatas separating gel 5%.
Bahan yang digunakan dalam pembuatan stacking gel ini yaitu, air deionisasi steril 1380
L akrilamid-bis 30% 335 L sebagai matriks penyangga, Matriks poliakrilamid
berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH bufer agar
muatan protein tidak berubah. Penggunaan konsentrasi bis acrylamid sebesar 30% akan

menyaring molekul protein sebesar 2x102,Tris-HCl pH 6,8 250 L, SDS 10% 20L ,
Ammonium persulfate (APS) 10% 150L dan TEMED (N,N,N,N tetrametilendiamin)
2,5 L. pH yang digunakan dalam separating gel yaitu 8,8 Protein merupakan molekul
amphoter karena mempunyai gugus amino positif dan gugus karboksil negatif. Dengan
demikian maka protein dapat mengion baik pada pH basa maupun pH asam. Pada pH
rendah, protein bersifat sebagai kation (bermuatan positif) yang cenderung bergerak ke
arah katoda (bermuatan negatif). Pada pH tinggi, protein bersifat sebagai anion
(bermuatan negatif) yang cenderung bergerak ke arah anoda (bermuatan positif). Nilai
diantara kedua pH tersebut dinamakan titik isoelektrik (isoelectric point atau pI) yaitu
nilai pH dimana protein menjadi tidak bermuatan. Hal ini karena pada pH tersebut jumlah
muatan negatif yang dihasilkan dari proteolisis sebanding dengan jumlah muatan positif
yang diperoleh dari penangkapan proton. Protein yang tidak bermuatan tidak dapat
bergerak pada medan listrik. Hampir semua protein mempunyai pI kurang dari 8,0. Oleh
karena itu, pH bufer elektroforesis berkisar 8 9 yang akan menyebabkan sebagian besar
protein bermuatan negatif yang akan bergerak ke anoda dan untuk mendapatkan pori-pori
yang lebih kecil sehingga protein akan terseparasi dengan baik saat running. pH stacking
gel yang dibuat yaitu 6,8 agar kondisi pH dari stacking gel berada di bawah isoelektrik
protein (pH 8) sehingga protein akan tersusun secara berjajar pada bagian bawah dari
stacking gel (Janson, 1998).
Perbandingan antara akrilamida dengan bis akrilamida dapat diatur sesuai dengan
berat molekul protein yang dipisahkan. Semakin rendah berat molekul protein yang
dipisahkan, maka semakin tinggi konsentrasi akrilamida yang digunakan agar kisikisi
yang terbentuk semakin rapat.perbedaan ph stacking gel dan separating gel ini
memungkinkan protein dalam sampel dimuat terkonsentrasi menjadi band yang ketat
selama beberapa menit pertama elektroforesis sebelum memasuki bagian pemecahan gel.
Setelah separating gel dibuat, dilanjutkan dengan membuat stacking gel,
pembuatannya hampir sama dengan separating gel, hanya saja berbeda pada konsentrasi
bahan-bahan. Hal ini dikarenakan fungsi dari stacking gel sebagai gel pengumpul,
sehingga tidak membutuhkan konsentrasi bahan yang terlalu besar dan untuk tempat
menata sampel protein sebelum proses running dimulai sementara seperating gel
berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya
(Boyer 1993: 118 & 119). Peletakan stacking gel berada diatas separating gel, kemudian
diatas stacking gel diletakkan sisir untuk membuat sumuran. Setelah semua gel

selesaidibuat, kemudian dilakukan injeksi sampel dan running. Sampel dan marker di
injeksikan kesumuran sebanyak 5 l, setelah semua sampel selesai di injeksikan, gel
dimasukkan kedalam alat elektroforesis yang diberi aquades.
Running yang dilakukan pada praktikum digunakan arus 400 mA,voltase 100V
selama 75 menit untuk mendapatkan hasil yang baik karena digunakan arus yang lebih
kecil sehingga protein dapat terseparasi dengan baik. Pada proses running ini terjadi
migrasi protein dari katoda menuju anoda. Karena protein yang digunakan bermuatan
negatif maka protein akan bergerak dari katoda menuju anoda. Running ini dilakukan
untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul yang dimilikinya. Running buffer
terdiri dari 0.3% Trisma basa; 1.44% glisin; 0.1% SDS, dan air suling ad 100%, dengan
pH 8.3. Trisma basa (Tris-base) digunakan sebagai pendapar yang dapat menstabilkan
pH, sehingga pH dapat stabil di 8.3 sehingga dapat menjaga kondisi fisiologis dari protein
dan gel agar tetap bermuatan negatif karena berada diatas titik isoelektrik, agar tetap
konstan serta menghubungkan antar elektroda sehingga proses migrasi dapat berlangsung
(Ausubel et al, 1978) dan mencegah gel agar tidak terlalu panas akibat adanya arus listrik.
Bagian atas dan bawah gel harus terendam running buffer karena sistem yang digunakan
dalam elektroforesis yaitu wet sistem dan digunakan arus listrik, jika salah satu bagiannya
tidak terendam maka arus listrik tidak dapat mengalir. Setelah running selesai, yang
selanjutnya digunakan untuk analisis hanya separating gelnya saja sedangkan stacking
gelnya dibuang karena band-band protein hanya terdapat pada separating gel saja.
Semakain tinggi konsentrasi acrylamide maka diameter pori-pori akan semakin kecil.
Apabila protein berukuran besar atau memiliki berat molekul yang besar, maka
memerlukan gel dengan konsentrasi acrylamide yang kecil. Konsentrasi acrylamide
dalam gel 30% biasanya digunakan untuk protein dengan berat molekul 2 x 102 2 x 103
dalton .
Langkah selanjutnya yaitu staining atau pewarnaan. Pewarnaan ini perlu untuk
dilakukan untuk membantu dalam pengamatan band protein yang terseparasi. Perwarnaan
atau staining pada gel juga merupakan bagian dari teknik SDS-PAGE. Pewarnaan gel
pada teknik SDS-PAGE commasie blue staining adalah pewarna tekstil trifenilmetana,
dan lebih sering digunakan di dalam teknik SDS PAGE. Commasie blue straining banyak
beberapa kelebihan yaitu harga yang relatif murah, mengikat protein secara spesifik,
bekerja cepat ( Boyer 1993: 139). Coomasie blue dapat mewarnakan hingga 5-500 ng
protein yang terdapat pada matriks gel. Namun beberapa protein dengan berat molekul

rendah terkadang tidak dapat tampak hanya dengan pewarnaa coomasie blue. Larutan
staining yang digunakan dalam praktikum ini commasie blue 1 g, 450 ml metanol, 450
mL air, 100 ml asam asetat glasial dalam 1 L, tetapi yang diambil untuk staining hanya
beberapa ml. Commasie blue berfungsi sebagai staining agent. Staining biasanya
dilakukan semalam dengan agitasi. Agitasi akan membantu sirkulasi dye, fasilitas
penetrasi dan membantu uniformity staining, untuk megoptimalkan reaksi staining yang
dilakukan oleh Comassie blue. Metanol berfungsi untuk mengendapkan protein.
Pencucian dengan aquades berfungsi untuk membilas dan menghilangkan commasie blue
yang mungkin masih tersisa pada gel. Selanjutnya dilakukan perendaman pada larutan
destaining untuk menghilangkan warga pada gel yang tidak mengandung pita protein,
larutan destaining terdiri dari 100 ml metanol, 800 ml air, 100 ml asam asetat glasial.
Pemberian kertas saring saat perendaman pada larutan destaining bertujuan untuk
memaksimalkan pembersihan larutan Commasie blue. Setelah itu dilakukan pencucian
lagi dengan aquades untuk menghilangkan sisa larutan destaining dan menghentikan
pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining. Selanjutnya gel dapat discan untuk
mendapatkan visualisasi lebih baik untuk analisis selanjutnya.
Marker protein yang digunakan adalah MW (Molecular Weight) marker. MW
marker mengandung campuran dari delapan protein recombinan yang stabil berukuran
mulai dari 20 150 kDa.

CARA PERHITUNGAN DAN ANALISIS HASIL.


Cara pembacaan hasil SDS-PAGE, menurut Rantam (2003) berat molekul antigen
dapat dicari dengan menghitung nilai Rf (Retardation Factor) dari masing-masing pita
dengan rumus:
Rf = Jarak pergerakan protein dari tempat awal
--------------------------------------------------------Jarak pergerakan warna dari tempat awal

Kemudian Rf dimasukkan ke dalam persamaaan regresi linier dengan rumus sebagai


berikut:
y=a+bx
keterangan : y = berat molekul sampel, x = Rf sampel