Anda di halaman 1dari 27

I.

JUDUL PERCOBAAN

: Penentuan Kadar Asam Amino dalam

Sampel
II.

HARI/TANGGAL PERCOBAAN

: 4 November 2014

III. TUJUAN
- Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi
kertas
IV. DASAR TEORI
1. Asam Amino
Asam amino adalah

senyawa organik yang memiliki gugus fungsional

karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali


pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C) yang sama
(disebut atom C "alfa" atau ). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus
amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik:
cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam.
Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino
termasuk golongan senyawa yang paling banyak dipelajari karena salah satu
fungsinya sangat penting dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein. Struktur
asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus
amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R,
dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan satu
asam amino dengan asam amino lainnya.
Gambar asam amino

Atom C pusat tersebut dinamai atom C ("C-alfa") sesuai dengan penamaan


senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus
karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C ini, senyawa tersebut
merupakan asam -amino.
Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping
tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam amino
bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar.

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut
organik non polar seperti pada eter, aseton dam kloroform.Sifat asam amino ini
berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan asam amino.Asam karboksilat
alifatik maupun aromatik yang terdiri atas beberapa atom karbon umunya kurang
larut dalam air tetapi larut pelarut organik (Poedjiadi, 1994).
Kecuali glisin, dengan R = H, asam amino memiliki pusat stereogenik pada
karbon . Dengan demikian, semua asam amino kecuali glisin bersifat aktif optis.

Asam amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil lebih baik digambarkan
sebagai struktur ion dipolar.

Gugus amino diprotonasi dan hadir sebagaiion amonium, sedangkan gugus


karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai ion karboksilat. Struktur dipolar ini
konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh yang
agak tinggi (bahkan yang paling sederhana, glisina, meleleh pada suhu 233C) dan
kelarutannya dalam pelarut organik relatif rendah). Asam amino bersifat amfoterik,
artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat
juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat.Perilaku ini
dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino dengan satu gugus amino
dan satu gugus karboksil (Hart, 2003).
Fungsi biologi asam amino
1. Penyusun protein, termasuk enzim.
2. Kerangka dasar sejumlah senyawa penting dalam metabolisme (terutama vitamin,
hormon dan asam nukleat).
3. Pengikat ion logam penting yang diperlukan dalam dalam reaksi enzimatik
(kofaktor).

Kegunaan dari beberapa asam amino


Asam amino esensial adalah asam amino yang tidak bisa diproduksi sendiri oleh
tubuh, sehingga harus didapat dari konsumsi makanan. Asam amino non-esensial
adalah asam amino yang bisa diprosuksi sendiri oleh tubuh, sehingga memiliki prioritas
konsumsi yang lebih rendah dibandingkan dengan asam amino esensial. Asam amino
esensial bersyarat adalah kelompok asam amino non-esensial, namun pada saat tertentu,
seperti setelah latihan beban yang keras, produksi dalam tubuh tidak secepat dan tidak
sebanyak yang diperlukan sehingga harus didapat dari makanan maupun suplemen
protein.

Jenis-jenis asam amino essensial :


1.

Leucine (BCAA = Branched-Chain Amino Acids = Asam amino dengan rantai


bercabang)

2.

Membantu mencegah penyusutan otot

Membantu pemulihan pada kulit dan tulang

Isoleucine (BCAA = Branched-Chain Amino Acids = Asam amino dengan


rantai bercabang)

3.

Membantu mencegah penyusutan otot

Membantu dalam pembentukan sel darah merah

Valine (BCAA = Branched-Chain Amino Acids = Asam amino dengan rantai


bercabang)

Tidak diproses di organ hati, dan lebih langsung diserap oleh otot

Membantu dalam mengirimkan asam amino lain (tryptophan,


phenylalanine, tyrosine) ke otak

4.

Lycine

Kekurangan lycine akan mempengaruhi pembuatan protein pada otot


dan jaringan penghubugn lainnya

Bersama dengan Vitamin C membentuk L-Carnitine

Membantu dalam pembentukan kolagen maupun jaringan penghubung


tubuh lainnya (cartilage dan persendian)

5.

Tyyptophan

Pemicu serotonin (hormon yang memiliki efek relaksasi)

Merangsang pelepasan hormon pertumbuhan

6.

Methionine

Prekusor dari cysteine dan creatine

Menurunkan kadar kolestrol darah

Membantu membuang zat racun pada organ hati dan membantuk


regenerasi jaringan baru pada hati dan ginjal

7.

8.

Threonine

Salah satu asam amino yang membantu detoksifikasi

Membantu pencegahan penumpukan lemak pada organ hati

Komponen penting dari kolagen

Biasanya kekurangannya diderita oleh vegetarian

Phenylalanine

Prekursor untuk tyrosine

Meningkatkan daya ingat, mood, fokus mental

Digunakan dalam terapi depresi

Membantuk menekan nafsu makan

Jenis-jenis asam amino non-essensial :


1.

2.

Aspartic Acid

Membantu mengubah karbohidrat menjadi energy

Membangun daya tahan tubuh melalui immunoglobulin dan antibody

Meredakan tingkat ammonia dalam darah setelah latihan

Glyicine

Membantu tubuh membentuk asam amino lain

Merupakan bagian dari sel darah merah dan cytochrome (enzim yang
terlibat dalam produksi energi)

3.

Memproduksi glucagon yang mengaktifkan glikogen

Berpotensi menghambat keinginan akan gula

Alanine

Membantu tubuh mengembangkan daya tahan

Merupakan salah satu kunci dari siklus glukosa alanine yang


memungkinkan otot dan jaringan lain untuk mendapatkan energi dari
asam amino

4.

Serine

Diperlukan untuk memproduksi energi pada tingkat sel

Membantuk dalam fungsi otak (daya ingat) dan syaraf

2. Kromatografi Lapis Tipis


Kromatografi lapis tipis adalah metode analisis kualitatif dan kuantitatif yang
didasarkan pada distribusi diferensial komponen sampel diantara dua fasa, fasa diam
dan fasa bergerak.
a.

Fasa dian KLT


Fasa diam KLT terbuat dari serbuk halus dengan ukuran 5 sampai 50 m.
Serbuk halus ini dapat berupa suatu adsorben, suatu penukar ion , suatu
pengayak molekul, atau dapat merupakan penyagga yang dilapisi suatu cairan.
Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel alumina, dan
serbuk selulosa. (Soebagio, 2003)

b. Fasa gerak KLT


Fasa gerak dalam kromatografi lapis tipis adalah eluen.dalam kromatografi
ini, pengelusi eluen naik sejalan dengan polaritasnya. Eluen pengembang dapat
berupa pelarut tunggal dan campuran pelarut dengan susunan tertentu. Pelarutpelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Terdapatnya
sejumlah kecil air atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatografi
yang tidak diharapkan. (Soebagio, 2003)
3.

Analisis Asam Amino


Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik
menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran
bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino
maupunkuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara
asam-asam amino tersebut.
Analisis asam amino dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa metode,
salah satu diantaranya kromatografi lapis tipis. Pemisahan asam amino dengan
metode inididasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam
suatu campuran pelarut tertentu pada fase stationer, dimana suatu zat terlarut yang

terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama dan tidak saling
bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut didalam kedua pelarut
seimbang (Patong, 2007).Asam amino yang diperoleh dari larutan hidrolisis protein
adalah asam amino . Artinya, gugus amino berada pada atom karbon , yaitu
disebelah gugus karboksil.
Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan
senyawa-senyawa organik dan senyawa anorganik.Metode ini berguna untuk
fraksionasi campuran kompleks dan pemisahan suatu senyawa-senyawa yang
sejenis.Pada tahun 1941, Martin dan Synge mengembangkan kromatografi partisi,
sedangkan Gordon menemukan kromatografi kertas. Kromatografi partisi terutama
dilakukan pada kromatografi kertas (Khopkar, 1984).
Dalam semua teknik kromatografi, zat terlarut yang akan dipisahkan
bermigrasi sepanjang suatu kolom (atau sepanjang seperti dalam kromatografi kertas
atau lapisan tipis, padanan fisika dari suatu kolom), dan tentu saja dasar pemisahan
terletak dalam berbeda-bedanya laju dari migrasi untuk zat terlarut yang berlainan.
Kita dapat membayangkan migrasi dari zat yang terlarut sebagai suatu resultan dua
faktor, satu cenderung untuk menggerakkan zat terlarut, dan yang lain untuk
menghambatnya (Day dan Underwood. 2002).
Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan fisik, dimanakomponenkomponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salahsatu fasa tersebut
adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas,yang lainnya sebagai
fluida yang mengalir lembut sepanjang landasan stasioner. Fase stasioner dapat
berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase bergerak dapat berupa cairan
maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan
bermigrasi sepanjang kolom, dan tentu saja laju pemisahan terlatak dalam laju
perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda.
Zat terlarut di dalam suatu fasa gerak mengalir pada suatu fasa diam. Zat
terlarut yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak yang lebih besar akan
tertahanlebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap
fasagerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan

demikiansenyawa-senyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat


perbedaanmigrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam.
Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat
seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Fasa diam
berupa padatan/cair yang dilapiskan pada padatan/gel. Pada pemisahan ini senyawasenyawa yang akan dipisahkan ditempatkan dalam sistem yang bergerak mengalir
melalui suatu sistem yang diam, dan selama pengaliran fasa gerak akan terjadi
pelarutan, adsorpsi, dan penguapan. Pada prinsipnya semua cara pemisahan
kromatografi mengalami proses yang sama yaitu adanya distribusi komponenkomponen dalam fasa diam dan fasa gerak dengan memanfaatkan perbedaanperbedaan sifat-sifat fisik komponen yang akan dipisahkan.
Perbedaaan sifat tersebut diantaranya :
Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut
Sifat untuk bertaut (adsorpsi) yang berbeda satu sama lain dengan suatu serbuk
bahan padat
Sifat dapat menguap pada temperatur yang berbeda satu sama lain.

Pelarut akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawasenyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut
tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauhdaripada yang
sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat
dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya diudara. Dengan proses
ini, asam-asam amino akan terpisah satu dengan yang lain,dan dengan
menyemprotkan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebutakan tampak
noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang terpisah itu.

Reaksi ninhidrin yang digunakan untuk mendeteksi dan menduga asam amino
secara kuantitatif dalam jumlah kecil. Pemanasan dengan ninhidrin berlebih
menghasilkan produk berwarna ungu pada semua asam amino yang mempunyai
gugus amino bebas, sedangkan produk yang dihasilkan oleh protein berwarna
kuning, karena pada molekul ini terjadi substitusi gugus amino.Pada kondisi yang
sesuai intensits warna yang dihasilkan dapat dipergunakan untuk mengukur asam
amino secara kolorimetrik.Metode ini amat sensitif bagi pengukuran konsentrasi
asam amino (Lehninger, 1982).
Asam-asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk
yang disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak
untuk mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi.
Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :

+
ninhidrin

anion ungu
+ RCHO + CO2 + 3H2O + H+

Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakandua


fase pelarut, misalnya pasangan fenol air, n-butanol air atau dengan tigafase
pelarut, misalnya n-butanol asam asetat air, dimana setiap jenis asam amino
mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Pada
kromatografi partisi, kertas digunakan sebagai pendukung air (fase stasioner).
Campuran komponen-komponen

yang

akan

dipisahkan ditempatkan pada

fasestasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fasa mobile (zat cair),
makafasa mobile akan melalui fasa stasioner, sambil membawa komponenkomponen tersebut, dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan
kecepatan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk mengidentifikasi
komponen-komponen yang dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini disingkat
dengan Rf.
=

Nilai Rf asam amino :


Asam amino

Rf

Alanin

0,38

Arginin

0,20

Asparagin

0,5

Asam aspartat

0,24

Sistein

0,4

Glutamin

0,13

Asam glutamat

0,30

Glisin

0,26

Histidin

0,11

Isoleusin

0,72

Leusin

0,73

Lisin

0,14

Metionin

0,55

Fenilalanin

0,68

Prolin

0,43

Serin

0,27

Treonin

0,35

Tirosin

0,45

Tripsin

0,66

Valin

0,61

V.

Alat dan Bahan


Alat
-

Kertas kromatografi ukuran 4x10cm

(1 buah)

Pipa kapiler

(1 buah)

Bejana / gelas kimia besar

(1 buah)

Botol semprot (Ninhidrin)

(1 buah)

Oven

(1 buah)

larutan sampel

(2 tetes pipa kapiler)

asam asetat glacial

(6 mL)

n-butanol

(25 mL)

akuades

(25 mL)

larutan asam amino

HCl pekat

VI. Alur Percobaan


1. Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak)

25 mL n-butanol + 6 mL asam
asetat glasial + 25 mL aquades
- Dicampurkan sambil dikocok
- Larutan tersebut ditempatkan dalam lemari
kromatografi dan dijenuhkan dengan uapnya
Hasil

2. Penentuan komponen asam amino


Kertas kromatografi
- Diteteskan 4 macam larutan (A,B,C, dan sampel) berdampingan
dengan jarak 1 cm, larutan ujung 0,5 cm dari pinggir kertas
- Tiap tiap tetesan dikeringkan sebelum tetesan berikutnya
diletakkan diatasnya
- Besar noda tidak lebih dari 0,4 cm
Kertas kromatografi bernoda
- Kertas digantungkan di dalam lemari kromatografi untuk penjenuhan
- Setelah penjenuhan tercapai baru digunakan elusi. Dimana dapat
dipakai kromatografi menurun atau kromatografi mendaki
Kertas kromatografi setelah dielusi

- Setelah elusi berjalan baik, kertas dikeluarkan, batas larutan ditandai


dengan pensil, kertas disemprot dengan ninhidrin
- Dikeringkan pada 105 110 oC selama 5 menit, noda asam amino
akan terlihat
- Hitung nilai Rf lalu ditetapkan komponen asam amino dengan
membandingkan harga Rf pada asam amino standar
Hasil

VII. Hasil Pengamatan


Perlakuan

Hasil Pengamatan

Dugaan atau Reaksi

Kesimpulan

1. Pembuatan Larutan Pengelmusi (Fasa


n-butanol : tidak berwarna

Gerak)
25 mL n-butanol + 6 mL CH3COOH
glasial + 25 mL aquades

CH3COOH glasial: tidak

Eluen yang digunakan


terdiri dari n-butanol,

berwarna
+

Aquades : tak berwarna


- Dicampurkan sambil dikocok
- Larutan tersebut ditempatkan
dalam lemari kromatografi dan
dijenuhkan dengan uapnya

Setelah dicampurkan : tidak

dan air dengan


perbandingan

berwarna dan keruh

25 : 6 : 25

Eluen : tidak berwarna

Hasil

CH3COOH glasial,

2.Menentukan Komponen Asam Amino


Kertas kromatografi
- Diteteskan 4 macam larutan (A,B,C, dan
sampel) berdampingan dengan jarak 1 cm,
larutan ujung 0,5 cm dari pinggir kertas
- Tiap tiap tetesan dikeringkan sebelum
tetesan berikutnya diletakkan diatasnya
- Besar noda tidak lebih dari 0,4 cm
Kertas kromatografi bernoda
- Kertas digantungkan di dalam lemari
kromatografi untuk penjenuhan
- Setelah penjenuhan tercapai baru
digunakan elusi. Dimana dapat dipakai
kromatografi menurun atau kromatografi
mendaki
Kertas kromatografi setelah dielusi

Larutan A : tidak berwarna


Larutan B : tidak berwarna

adalah 0,3116, artinya


Setelah disemprotkan ninhidrin timbul

sampel merupakan

Larutan Sampel : tidak

noda ungu karena asam amino bereaksi

larutan yang

dengan ninhidrin.

mengandung asam

berwarna

glutamat.

Kertas kromatografi : perak

Ninhidrin : larutan tidak


berwarna

Larutan ditotolkan di kertas


kromatografi setelah kering
totolannya tidak berbekas

Setelah dioven 105o-110oC


terbentuk noda berwarna

Nilai Rf :
A : (2,9 cm / 7,7 cm) = 0,3766
B : (2,7 cm / 7,7 cm) = 0,3506
C : (2,4 cm / 7,7 cm) = 0,3116
Sampel : (2,4cm / 7,7 cm) =

Hasil

Nilai Rf dari sampel

Larutan C : tidak berwarna

ungu
- Setelah elusi berjalan baik, kertas
dikeluarkan, batas larutan ditandai dengan
pensil, kertas disemprot dengan ninhidrin
- Dikeringkan pada 105 110 oC selama 5
menit, noda asam amino akan terlihat
- Hitung nilai Rf lalu ditetapkan komponen
asam amino dengan membandingkan
harga Rf pada asam amino standar

Ninhidrin : Sebagai penampak noda

Reaksi :

0,3116
Artinya :
Larutan A : Alanin
Larutan B : treonin
Larutan C : Asam glutamat
Larutan Sampel : Asam glutamat

VIII. Pembahasan
Pada percobaan penentuan kadar asam amino dalam sampel ini tujuannya
adalah untuk menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan
kromatografi kertas. Kromatografi sendiri adalah cara pemisahan campuran yang
didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua
fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase gerak (mobile). Pada percobaan ini dilakukan
identifikasi asam amino pada suatu sampel dengan metode kromatografi lapis tipis
(KLT), dan dilakukan perhitungan nilai Rf tiga asam amino yang digunakan dan asam
amino sampel yang akan diidentifikasi. Percobaan ini dilakukan dengan dua tahap, yaitu
pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak), dan menentukan komponen asam amino.
Pada pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak), hal pertama yang dilakukan
adalah membuat eluen dari bahan 25 mL n-butanol, 6 mL asam asetat glasial dan 25 mL
aquades. Ketiga bahan tersebut dicampur dan dikocok. Kemudian ditempatkan di dalam
lemari kromatografi. Setelah itu, larutan pengemulsi dijenuhkan dengan uapnya.
Penjenuhan lemari kromatografi ini bertujuan untuk menghilangkan uap air atau gas
lain yang mengisi fase penyerap (adsorben) yang akan menghalangi laju eluen, dengan
kata lain kondisi lemari kromatografi supaya jenuh untuk memudahkan eluen bergerak.
Larutan pengemulsi yang dihasilkan terdiri dari campuran antara larutan n-butanol,
asam asetat glasial, dan air dengan perbandingan 25 : 6 : 25. Pemilihan pengemulsi ini
karena ketiga komponen larutannya memiliki kepolaran yang berbeda. Urutan
kepolarannya adalah kepolaran air > n-butanol > asam asetat glasial. Adanya perbedaan
kepolaran inilah yang digunakan sebagai dasar dalam pemisahan asam amino, karena
asam amino tertentu memiliki kemampuan larut pada pelarut dengan kepolaran yang
berbeda-beda. Ketika dicampur, ketiga larutan tersebut tidak menimbulkan perubahan
warna, karena ketiga komponen pelarut tersebut tidak dapat saling bercampur karena
memiliki kepolaran yang berbeda sehingga tetap jernih (tidak berwarna), karena
masing-masing dari ketiga larutan itu (tidak berwarna). Reaksi yang terjadi pada tahap
ini adalah reaksi esterifikasi yang ditunjukkan sebagai berikut :

Pada percobaan penentuan komponen asam amino, yang dilakukan adalah


menyiapkan kertas kromatografi dengan ukuran 4x10 cm yang dioven selama 10 menit.
Hal ini bertujuan untuk mengurangi kadar air pada kertas kromatografi dan untuk
mengaktifkan daya serap kertas kromatografi terhadap eluen. Dalam hal ini, absorben
selulosa diaktifkan dengan pemanasan sehingga air yang diserap dapat dikeluarkan, dan
kertas kromatografi tersebut dapat mengikat molekul lain sehingga noda yang
didapatkan tampak jelas. Kertas kromatografi tersebut kemudian diberi batas atas dan
batas

bawah

menggunakan

pensil

untuk

membatasi

totolan

dan

naiknya

eluen/pengemulsi sehingga dapat ditentukan nilai Rfnya. Batas atasnya sebesar 0,5 cm
dari ujung atas kertas dan batas bawahnya 1 cm dari ujung bawah kertas. Setelah itu,
kertas kromatografi diberi tanda dengan pensil sebagai tempat penotolan untuk 4
macam larutan yang diberi label A, B, C dan S yang berjarak 1 cm tiap totolan.
Kemudian empat macam larutan (A, B, C, dan Sampel) yang masing-masing tidak
berwarna dan belum diketahui jenis asam amino nya, diteteskan menggunakan pipa
kapiler pada kertas kromatografi tadi secara berdampingan dengan jarak 1cm dan
larutan ujung ada pada 0,5cm dari pinggir kertas. Tiap-tiap tetesan harus dikeringkan
dahulu sebelum tetesan berikutnya diletakkan di atasnya. Setiap macam larutan,
diteteskan sebanyak dua kali. Noda yang diteteskan hendaknya memiliki diameter tidak
melebihi 0,4cm. Selanjutnya, kertas kromatografi dimasukkan ke dalam lemari
kromatrografi yang telah dijenuhkan dengan uap pengemulsi dan ditutup dengan kaca.
Setelah itu ditunggu sampai larutan pengemulsi bergerak sampai batas atas pada kertas
kromatografi.
Dalam proses kromatografi ini, fase diam adalah kertas kromatografi yaitu
kertas saring dimana abdsorbennya adalah selulosa. Sedangkan fasa geraknya adalah
larutan pengemulsi/eluennya. Prinsip dasar pemisahan dengan kromatografi kertas
adalah perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan
komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Saat larutan bergerak ke atas
pada kertas kromatografi secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam
amino antara fase gerak dan fase diam yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung

berulang-ulang. Saat larutan bergerak ke atas, asam amino akan terbawa oleh
pergerakan eluen. Perbedaan kelarutan asam-asam amino dalam eluen akan
mengakibatkan kecepatan pergerakan asam-asam amino yang berbeda pada kertas
kromatografi tersebut. Asam amino yang lebih larut dalam eluen akan bergerak lebih
cepat karena hanya tertahan kecil dalam fasa diamnya. Sedangkan asam amino yang
lebih susah larut dalam eluen akan lebih lama tertahan pada fase diamnya, sehingga laju
geraknya lebih lambat. Dengan adanya perbedaan pergerakan ini, asam amino-asam
amino dapat dipisahkan.
Pergerakan eluen tersebut dilakukan hingga eluen mencapai batas atas pada
kertas kromatografi. Kelarutan asam amino dalam eluen tergantung dari sifat
kepolarannya. Eluen yang digunakan dalam percobaan ini terdiri dari larutan n-butanol,
asam asetat glacial, dan air dengan perbandingan 25:6:25. Dari pelarut-pelarut tersebut
larutan yang bersifat paling polar adalah air, sedangkan kedua pelarut lainnya lebih
bersifat non polar. Dari perbandingannya, eluen yang dipakai tersebut lebih bersifat non
polar. Dalam proses kromatografi ini, partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks
selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah
dijenuhkan dengan pengemulsi atau eluen. Asam amino yang bersifat nonpolar akan
susah larut dalam molekul air yang bersifat polar yang ada pada eluen dan lebih sulit
tertahan oleh kompleks selulosa-air pada fase diam. Oleh karenya, asam amino yan
bersifat non polar tersebut akan mudah larut pada fase gerak yang bersifat non polar
juga. Akibatnya asam amino yang bersifat non polar tersebut akan bergerak cepat
bersama dengan fase gerak. Dengan demikian, sampel yang pergerakannya paling atas
merupakan sampel yang paling larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling non
polar dibandingkan sampel asam amino lainnya, sehingga nilai Rf nya relatif tinggi.
Sebaliknya, asam amino polar akan mudah larut dalam molekul air yang ada pada eluen
dan kurang larut pada pelarut non polar lainnya. Sehingga asam amino tersebut akan
lebih tertahan pada fase diam dan kompleks selulose-air. Akibatnya, pergerakannya
lambat dan nilai Rf nya rendah. Dengan demikian, sampel yang pergerakannya hanya
sampai bagian bawah kertas kromatografi merupakan sampel yang kurang dapat larut
dalam pelarut yang artinya bersifat paling polar dibandingkan sampel asam amino
lainnya. Ketika pelarut mencapai batas atas kertas proses dihentikan. Setiap asam
amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai Rf masing-masing
asam amino diidentifikasi.

Setelah eluen telah sampai pada tanda atas atas, kertas kromatografi
dikeluarkan dan dikeringkan pada suhu 105o-110oC selama 5 menit. Setelah
pemanasan, noda asam amino tidak terlihat karena asam amino tidak berwarna. Oleh
karena itu, digunakan ninhidrin agar noda yang muncul tampak pada kertas. Ninhidrin
bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna khas ungu.
Terbentuknya noda berwarna ungu ini disebabkan karena terjadinya reaksi antara hidrat
dari triketon siklik (ninhidrin) dengan asam amino. Reaksi yang terjadi adalah sebagai
berikut :

Noda yang nampak dihitung jarak tempuhnya. Ternyata, masing-masing noda memiliki
jarak tempuh sebagai berikut:

Larutan

Jarak tempuh noda

Larutan A

2,9 cm

Larutan B

2,7 cm

Larutan C

2,4 cm

Larutan Sampel

2,4 cm

Setelah dihitung jarak tempuh noda, dihitung pula nilai Rf nya dengan cara:
=

Dengan cara tersebut, didapatkan nilai Rf dari masing-masing larutan (A,B , C,


dan Sampel) sebagai berikut:
Larutan

Rf

Jenis Asam Amino

Larutan A

0,3766

Alanin

Larutan B

0,3506

Treonin

Larutan C

0,3116

Asam glutamat

Larutan Sampel

0,3116

Asam glutamat

Berdasarkan data di atas, masing-masing larutan yang memiliki Rf tersebut


mengandung A = alanin, B= treonin, dan C= asam glutamat. Nilai Rf larutan sampel
berkisar pada nilai Rf larutan C, hal ini berarti asam amino yang terkandung pada
sampel sama dengan asam amino yang terkandung pada larutan C, yaitu asam amino
asam glutamat. Struktur asam amino tersebut dapat dilihat pada gambar di bawah ini:

Pada data tabel diatas diketahui harga Rf alanin> Rf treonin > Rf asam
glutamat. Hal ini dikarenakan alanin merupakan asam amino non-polar sehingga tidak
menyukai air atau bersifat hidrofobik. Asam amino yang bersifat nonpolar (hidrofobik)
ini akan susah larut dalam molekul air yang bersifat polar yang ada pada eluen dan
lebih sulit tertahan oleh kompleks selulosa-air pada fase diam. Oleh karena itu, asam
amino yan bersifat non polar tersebut akan mudah larut pada fase gerak yang bersifat
non polar juga. Akibatnya asam amino yang bersifat non polar tersebut akan bergerak
cepat bersama dengan fase gerak. Dengan demikian, sampel yang pergerakannya paling
atas merupakan sampel yang paling larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling non
polar dibandingkan sampel asam amino lainnya, sehingga nilai Rf alanin paling tinggi
dibandingkan dengan yang lainnya.
Pada larutan B yang mengandung treonin memiliki nilai Rf yang lebih besar
jika dibandingkan dengan asam glutamat. Hal ini dikarenakan treonin merupakan asam
amino polar yang tidak bermuatan sedangkan asam glutamat merupakan asam amino
bermuatan negatif. Bila dilihat dari kepolarannya, asam amino yang bermuatan negatif
akan lebih bersifat polar jika dibandigkan dengan asam amino yang tidak bermuatan.
Hal ini bisa dilihat pada nilai Rf dari asam amino treonin dan asam glutamat. Asam
amino treonin memiliki nilai Rf yang lebih besar dari pada asam glutamat. Hal ini
berarti asam amino treonin bersifat lebih non-polar dari pada asam glutamat karena
asam amino treonin yang bersifat non polar ini akan mudah larut pada fase gerak yang
bersifat non polar juga. Akibatnya treonin yang bersifat non polar tersebut akan
bergerak cepat bersama dengan fase gerak. Dengan demikian, treonin memiliki nilai Rf
lebih besar dari pada asam glutamat.
Begitu pula sebaliknya, larutan C dan Sampel yang mengandung asam
glutamat memiliki nilai Rf yang paling kecil bila dibandingkan dengan asam amino

yang lain. Hal ini dikarenakan asam glutamat memiliki sifat paling polar dibandingkan
asam amino treonin dan alanin. Asam amino glutamat yang bersifat polar ini berarti dia
lebih menyukai air atau yang biasa disebut sbeagai hidrofilik. Semakin polar suatu
asam amino, maka akan semakin tinggi nilai Rf nya karena asam amino polar akan
mudah larut dalam molekul air yang ada pada eluen dan kurang larut pada pelarut non
polar lainnya. Sehingga asam amino tersebut akan lebih tertahan pada fase diam dan
kompleks selulose-air. Akibatnya, pergerakannya lambat dan nilai Rf nya rendah.
Dengan demikian, sampel yang pergerakannya paling lambat dan jaraknya paling kecil
dengan batas bawah kertas kromatografi merupakan sampel yang kurang dapat larut
dalam pelarut yang artinya bersifat paling polar dibandingkan sampel asam amino
lainnya. Oleh karena itu, asam glutamat memiliki nilai Rf yang paling kecil diantara
asam amino lainnya, yaitu alanin dan treonin.

IX. Kesimpulan

1. Didapatkan Nilai Rf sebagai berikut :


Rf noda A

= 0,3766 cm

Rf noda B

= 0,3506 cm

Rf noda C

= 0,3116 cm

Rf noda Sampel = 0,3116 cm

2. Larutan sampel mengandung asam amino asam glutamat karena nilai Rf noda sampel
= Rf noda C, yaitu bernilai 0,3116 yang berarti larutan sampel mengandung asam
amino (asam glutamat).

Jawaban Pertanyaan
1. Apakah keuntungan dan kerugian dari metode pemisahan dengan kromatografi
kertas?
Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat
seragam.Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Keuntungan :

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah


pemisahan substansi yang memiliki nilai R f yang sangat serupa.
Kerugian :
Pelarut yang digunakan harus sesuai dengan sampel yang akan digunakan.
Misalnya ketika menggunakan pelarut polar, molekul-molekul polar akan memiliki
atraksi yang tinggi untuk molekul-molekul air dan kurang untuk pelarut yang non
polar. Dan karenanya, cenderung untuk larut dalam lapisan tipis air sekitar serat
lebih besar daripada pelarut yang bergerak. Karena molekul-molekul ini
menghabiskan waktu untuk larut dalam fase diam dan kurang dalam fase gerak,
molekul-molekul tidak akan bergerak sangat cepat pada kertas.

2. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif?


Y a , kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif.Kareana
pada prinsipnyakromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari
substansinya menjadi komponen-komponennya.Seluruh bentuk kromatografi
memiliki fase diam (berupa padatan ataucairan yang didukung pada padatan)
dan fase gerak (cairan atau gas).Jadi, jenis kromatografi ini banyak di gunakan
untuk identifikasi kualitatif maupun analisa kuantitatif.

3. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?


Rf merupakan nilai dari jarak relative pada pelarut. Harga Rf dihitung sebagai
jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen ( fase
gerak )untuk setiap senyawa. Faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah jenis kertas
dan komposisi pelarut yang tepat. Karena jarak tempuh relative pada pelarut adalah
konstan untuk senyawa tertentu.

DAFTAR PUSTAKA
Fessenden. 1992. Kimia Organik jilid 2. Jakarta : Erlangga
Lehninger. 1982. Dasar dasar Biokimia. Surabaya : Erlangga
Mahabbah.2011. PERCOBAAN III kromatografi kertas pada asam asam
amino.http://id.scribd.com/doc/53670991/PERCOBAAN-III-Biokimia-Kromatografi
.(8 November 2014)
Soebagio, dkk. 2003. COMMON TEXTBOOK KIMIA ANALITIK II. Malang : Jurusan Kimia
Universitas Negeri Malang
Tama. 2011. Asam amino. http://northma-tama.blogspot.com/2011/07/asam-amino.html
(Diakses 8 November 2014)
Taufik.2011. Rumus struktur asam amino. (8 November 2014)
TIM. 2012. PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I. Surabaya : Unesa Press

LAMPIRAN PERHITUNGAN
Perhitungan

Rf =

2,9

Rf A = 5,5 = 0,3766
2,9

Rf B = 5,5 = 0,3506
2,4

Rf C = 5,5 = 0,3116 cm
2,4

Rf Sampel = 5,5 = 0,3116

LAMPIRAN FOTO

Larutan A, B, C, dan
Sampel (masing-masing
tidak berwarna) yang
akan ditotolkan pada
plat KLT

Plat KLT dioven terlebih dahulu selama


10 menit untuk mengurangi kadar air
yang terkandung di dalamnya

Plat KLT diberi tanda batas


atas dan batas bawah serta
diberi titik-titik untuk tempat
penotolaan larutan A, B, C,
dan Sampel

Penotolan Larutan A, B, C, dan


Sampel pada plat KLT

Plat KLT yang telah


ditotoli larutan dan
sampel diletakkan dalam
chamber yang telah
berisi eluen

Noda asam amino nampak


setelah disemprot dengan
ninhidrin

Anda mungkin juga menyukai