Anda di halaman 1dari 57

ANALIZA HPLC A MICOTOXINELOR

Mucegaiurile de depozit sursa de contaminare cu


micotoxine
Mucegaiurile sunt larg raspandite n natura, fiind mai numeroase nsa, n
mediile bogate n glucide de origine vegetala, intervenind ntotdeauna n
procesele de putrefactie a substantelor vegetale. Se raspndesc cu mare
usurinta n natura, n special prin spori, care spre deosebire de cei bacterieni
sunt o forma de nmultire si nu de rezistenta. Efectele favorabile ale unor
categorii de fungi se folosesc n industria alimentara pentru fermentarea unor
produse lactate proaspete, prepararea unor branzeturi (Roquefort, Bucegi,
Homorod) si produse de carne (salam tip Sibiu). Efectele daunatoare se
manifesta prin producerea de toxine nocive pentru om si animale, genernd
diverse

toxiinfectii

alimentare.

Din

punct

de

vedere

morfologic,

mucegaiurile sunt formate din mai multe cellule eucariote care formeaza
miceliul, avand la randul lui o portiune aeriana si una situata n mediul n
care se dezvolta. Din punct de vedere fiziologic, o parte din miceliu este
reprezentata de aparatul vegetativ (hife tubular septate sau neseptate), iar o
alta parte de aparatul reproducator (hife pe care se dezvolta sporii).
Din punct de vedere metabolic, mucegaiurile au cteva caracteristici si
anume: cele mai multe sunt saprofite, dezvoltndu-se pe substraturi
organice; folosesc pentru hranire surse de carbon; prefer atmosfera umeda si
temperatura de dezvoltare ntre 20-300C; sunt n general aerobe si acidofile,
dezvoltndu-se la un pH cuprins ntre 3-7.
Identificarea mucegaiurilor se face cu ajutorul unor chei dicotomice, pe baza

caracterelor culturale si morfologice. Materia prima alimentara si produsele


finite pot fi contaminate cu sporiu sau fragmente de miceliu din mediul
nconjurator, contaminarea putnd avea loc n diferite stadii de productie.
Prezenta unui numar mare de spori sau fragmente de miceliu n produse care
nu sunt vizibil mucegaitepoate indica pe de o parte o contaminare generala a
mediului nconjurator sau o prelucrare de materie prima mucegaita.
Dezvoltarea unei anumite specii de ciuperci pe un produs alimentar are si
aspecte necunoscute, dar cu siguranta, ea este corelata cu calitatea specie
micetice si cu proprietatile produsului alimentar. De asemenea dominatia
unei specii se poate datora unei contaminari puternice din nise ecologice
unde s-a dezvoltat mucegaiul.
Principalele specii de fungii de depozit si micotoxinele care le produc sunt:
1.Aspergillus flavus, A.parasiticus, A.nomius, Penicillium puberulum, P.
citrinum, Rizopus produc Aflatoxine B1, B2, G1, G2, M1, M2;
2. Penicillium verucosum, P. viridicatum, P.commmune, Aspergillus
alutaceus, A. ochraceus, A.melleus produc Ochratoxina A
3. Penicillium expansum, Byssoclamys nivea, Aspergillus clavatus
Patulina Mucegaiul Aspergillus sp. infesteaza un numar mare de furaje dar
mai ales pe cele de natura vegetala si animala. Creste foarte bine n sroturile
de arahide si nutreturile combinate. Infesteaza n mare masura si asternutul
din adaposturi precum si plantele furajere smulse cu radacini. Aerul din
imediata apropiere a acestor focare este puternic ncarcat cu spori de
Aspergillus. Din numeroasele tulpini ale mucegaiului Aspergillus, mai
frecvente si daunatoare animalelor s-au dovedit a fi : A. flavus, A.
fumigatum, A. nidulans, A.candidus, A. clavatus, A. niger, A. glaucus, A.
amstelodanii, A. parasiticus, A. giganteus si A. claviforme Aspergillus sp.
contine mai multi principii toxici dintre care cei mai importanti sunt

aflatoxinele care deriva de la a-Aspergillus si fla- flavus, prima tulpina


din acest mucegai n care sau pus n evidenta astfel de micotoxine.
Aflatoxinele sunt produse n cantitati variabile n directa concordanta cu
prezenta unor numerosi factori favorizanti. Dintre aflatoxinele studiate pna
n prezent cele mai daunatoare sunt aflatoxinele B1, B2, G1, G2, care se
regasesc n laptele animalelor hranite cu furaje contaminate sub forma
M1,M2. Pe lnga aflatoxine n sursele furajere sau n asternutul
adaposturilor se mai pot gasi si alte micotoxine ntruct mucegaiul
Aspergillus creste de obicei mpreuna cu Mucor, Penicillium, Rhizopus,
Alternaria. Totodata este bine stabilit ca nutretul infestat cu Aspergillus
contine si alte toxine, ca acidul oxalic care tulbura absorbtia calciului din
tubul digestiv, ncetineste cresterea si scade calcemia. Acidul oxalic rezulta
din degradarea de catre acest mucegai a hidratilor de carbon din substratul
infestat. Acidul cojic( 2 hydroximetyl-5-hydroxi-8-pyrone) este o toxina
neurotropa, cardiotoxica, leucocitotoxica, antibiotica. Se face responsabil de
miscarile necontrolate, exoftalmie si convulsii tetaniforme. Alt derivat toxic
este acidul betanitopropionic, care produce vasodilatatie si ca urmare
insuficienta circulatiei cerebrale precum si transformarea hemoglobinei n
methemoglobina, deci stare de anoxemie. Acidul aspergilic si compusii
nruditi (acid hidroxiaspergilic, acid dezoxiaspergilic) au efect antibiotic.
Alaturi de aflatoxine mai apare si substante tremorgene (generatoare de
frisoane) care se elaboreaza odata cu aflatoxinele, flavalcoolul sau
flavonolul, acidul galic, etc. Totodata ciuperca contine si o endotoxina care
este puternic nefrotoxica, hemoaglutinanta, hemolitica, dermonecrotica; la
iepure aceasta produce hemoragii, necroze renale, degenerescenta grasa
hepatica. Se constata ca toate speciile de mamifere, pasari, pesti si albine pot
face aflatoxicoza. La doze mari de aflatoxina sau mucegai manifestarea

clinica va fi acuta sau subacuta, iar la doze mici, patrunse n organism ntr-o
perioada de timp ndelungata manifestarea clinica va avea o evolutie cronica.
Morbiditatea si mortalitatea cuprind adesea un numar mare de animale mai
cu seama cnd factorii care favorizeaza dezvoltarea mucegaiului persista.
Micozootoxicoza apare n special n conditii de supraaglomerari, umiditate
ridicata, suprancalzire, etc., factorii principali fiind tot nutretul infestat si
aerul contaminat cu spori. Sporii de Aspergillus pot patrunde si prin porii
cojii n oua unde pot creste omornd embrionul sau producndu-i leziunile
caracteristice aspergilotoxicozei chiar n faza embrionara. n tara noastra sau diagnosticat numeroase cazuri de aspergilotoxicoza la majoritatea
speciilor de mamifere (bovine, ovine, porcine, cabaline, iepuri) si pasari
furajate cu nutreturi infestate cu mucegaiul Aspergillus flavus, A. fumigatus,
A. nidulans, etc. Incidenta maxima s-a nregistrat la tineretul aviar (boboci
de rata si gsca, pui de gaina, curca) precum si la pesti si albine.

Micotoxinele - O problema de siguranta alimentaraAspecte generale


Micotoxinele sunt metaboliti toxici produsi de miceti pe diferite substraturi,
n special alimente si furaje, capabili sa produca mbolnavirea celor care le
consuma (om sau animal). Se gasesc n sporii si talul micetilor sau ca
produsi de secretie ai acestora n substraturile unde se dezvolta. Acesti
metaboliti apar n diferite stadii ale productiei de cereale (unele n perioada
de dezvoltare a cerealelor, altele in timpul depozitarii acestora). Cele trei
genuri de fungi producatori de micotoxine, importante din punct de vedere
economic, sunt Aspergillus, Penicillium si Fusarium. Micotoxinele prezente
n mod natural n diversele produse alimentare constituie o problema

serioasa de siguranta alimentara, mai ales n anumite regiuni ale globului n


care conditiile climatice sau standardele din agricultura sunt precare.
Organizatia pentru Alimente si Agricultura (FAO) estimeaza ca pe plan
mondial pna la 25% din culturile alimentare sunt semnificativ contaminate
cu micotoxine. In literatura sunt citate date conform carora n natura ar
exista un mare numar de micotoxine, din care au fost identificate peste 200
de specii. Practic, nu se cunosc zone pe glob indemne si se apreciaza ca 2560% din cerealele lumii sunt contaminate cu micotoxine cunoscute, produse
mai ales de fungi din genurile Aspergillus, Fusarium, Penicillium, amintite
anterior. Raspndirea diferitelor specii de fungi, precum si concentratia n
micotoxine a hranei este influentata de conditiile pedo-climatice. O situatie
precisa a distributiei geografice a micotoxinelor a fost facuta ntr-un studiu
prezentat n 1977, la prima conferinta despre micotoxine a Organizatiei
pentru Alimentatie si Agricultura (FAO), Organizatiei pentru Sanatate
Mondiala (WHO) si Programului Natiunilor Unite pentru Mediu (UNEP).
Aceasta a aratat ca n alimentele si nutreturile contaminate natural cu fungi
se gasesc n concentratii mari doar sapte micotoxine: aflatoxina, ochratoxina
A, patulina, zearalenona, tricotecenele, citrinina si acidul penicilic.
Distributia micotoxinelor n diferite zone ale globului se caracterizeaza prin
urmatoarele:
_ n regiunile reci (Canada, nordul SUA si majoritatea tarilor europene)
domina aflatoxinele (exceptie fac produsele de import provenite din tarile
calde) dar foarte importante sunt: vomitoxina, zearalenona, ochratoxina,
DAS, toxina T-2 si toxina HT-2;
_ n sudul si centrul Europei, unde se cultiva porumb (Suedia, Austria,
Ungaria), domina fusariotoxinele (vomitoxina, zearelona, toxina T- 2);

_ n nordul Europei (Danemarca, Polonia) pe primul loc se afla ochratoxina


A;n regiunile calde si umede din America Latina, Asia, Africa si anumite
zone din Australia, mai raspndite sunt aflatoxinele.
Micotoxinele contamineaza produsele agricole nainte sau dupa recoltare. n
general umiditatea si temperaturile nalte favorizeaza nmultirea ciupercilor
si producerea de micotoxine. Conditiile proaste n timpul recoltarii,
depozitarii, transportului si comercializarii contribuie si ele la nmultirea
mucegaiurilor si la cresterea riscului de producere a micotoxinelor.
Principalii factori care influenteaza biosinteza micotoxinelor sunt nsusirile
genetice ale fungilor (micetii de camp ca Fusarium, Cladosporium,
Alternaria si Claviceps invadeaza plantele n dezvoltare; micetii de deposit
ca Aspergillus si Penicillium se dezvolta de obicei pe seminte; micetii
alterarii avansate ca Fusarium graminearum), substratul (bogat n glucide,
Zn, Fe, Mn), umiditatea (minim de 13%) si pH-ul acestuia (peste 4),
temperatura (-50 si 600C, idela n medie 250C), luminozitatea si compozitia
atmosferei (areobioza) n care acestia se dezvolta.
Produsele de origine vegatala reprezinta substraturi convenabile dezvoltarii
micetilor si elaborarii micotoxinelor. n timpul depozitarii, acestea devin
substraturi favorabile daca au un grad mare de umiditate, peste 80%, si o
temperatura de peste 200C. Numeroase dintre produsele alimentare sau
furajere de origine vegetala, cum sunt faina de gru, secara sau porumb,
sroturile de arahide, diferite fructe s.a. pe care s-au dezvoltat fungi toxigeni,
n urma prelucrarilor suferite nu mai contin dect micotoxine care au rezistat
acestor procese, n timp ce fungii care le-au produs au fost omorati. n cazul
unor produse alimentare de origine animala, cum sunt carnea si laptele
animalelor de ferma, contaminarea lor cu micotoxine se face prin hranirea cu
furaje mucegaite si n care s-au elaborate micotoxinele. Dupa ingerarea unor

asemenea furaje, la nivelul tubului digestive se absorb n organismul care lea consumat numai micotoxinele, iar fungii nu trec bariera intestinala si se
elimina cu fecalele.

Aceste micotoxine ajung pe calea circulatiei sanguine n tesuturile


organismului sau n unele produse de secretie si excretie cum este laptele si

urina. n tesuturi, micotoxinele pot ramane ca atare timp ndelungat sau


sufera unele transformari sau simplificari n compusi, de cele mai multe ori,
cu toxicitate foarte ridicata. n carne si lapte, prezenta micotoxinelor este
deci consecinta hranirii animalelor cu furaje mucegaite. Micotoxinele mai
des ntalnite n carne sunt ochratoxinele, care se acumuleaza de obicei n
rinichi. Laptele vacilor hranite cu furaje cu continut mare de aflatoxine,
contine metabolitul M1 toxic. Micotoxicozele, bolile produse de micotoxine,
reprezinta o problema reala pentru sanatatea animalelor, desi evaluarea
acesteia este departe de a fi rezolvata, ca si anumite mecanisme de actiune a
multor micotoxine. Micotoxinele au efecte nefavorabile extreme de
complexe asupra organismului animal, uman precum si asupra celorlalte
sisteme biologice. Aceste efecte se reflecta asupra cresterii, starii de sanatate
si capacitatii imunogene a organismelor. Micotoxinele afecteaza procesele
vitale fundamentale prin interferarea metabolismului principalelor grupe de
substante nutritive ca lipidele si glucidele, dar si metabolismul vitaminelor A
si D. Micotoxinele din nutreturi produc la animale tulburari cu manifestari
diverse, de la reducerea consumului si a bioconversiei hranei la imbolnaviri
de gravitate variabila, pna la moarte, simptomatologia fiind mai mult sau
mai putin caracteristica. Astfel, mucegaiul roz al stiuletelui de porumb
produce vomitoxina denumita si factorul de refuz al hranei, la care sunt
sensibile mai ales porcinele, zearalenona duce la tulburari de reproductie la
vacile de lapte si la porci (mamite, atrofie ovariana), ochratoxina induce
leziuni renale, iar fumonisina determina tulburari nervoase la cal, toxina T-2
provoaca leziuni bucale la pasari, iar alcaloizii din Secale cornutum
determina modificari ale sistemului nervos si necroza extremitatilor.
Micotoxinele din nutreturi sau metabolitii lor se transfera n carnea, laptele,

ouale si alte produse ale organismului animal, existnd un important


potential de actiune asupra sanatatii umane. Consecintele consumului de
alimente contaminate cu micotoxine asupra sanatatii omului sunt estimate
indirect pe baza efectului observat la animale. Ingestia n timp scurt a unei
cantitati mari de aflatoxine duce la aparitia intoxicatiei acute. Organul tinta
care sufera leziuni grave n astfel de cazuri este ficatul. Aflatoxicoza acuta se
poate manifesta prin hemoragii, insuficienta hepatica acuta si chiar moarte.
Doza mortala difera de la animal la animal si depinde de multi factori cum ar
fi cantitatea de aflatoxina ingerata, vrsta animalului, starea de sanatate si
starea de nutritie. Consumul unei cantitati mai mici, dar timp mai ndelungat
duce la aparitia intoxicatiei cronice. Efectele si simptomele sunt n general
greu de pus n evidenta att din cauza intensitatii reduse dar mai ales din
cauza caracterului lor nespecific. Aflatoxicoza cronica trebuie suspectata
cnd n lipsa altor cauze evidente, animalele au tulburari digestive
persistente nsotite de crestere anevoioasa n greutate. Consumul de alimente
contaminate cu micotoxine poate avea urmari severe, cum ar fi ciroza si
carcinomul hepatic o forma particulara de boala canceroasa a ficatului.
Studiile epidemiologice efectuate n India si n unele tari din Africa au aratat
o asociere ntre consumul de alimente contaminate cu aflatoxine si cresterea
incidentei cancerului de ficat. Susceptibilitatea omului la aflatoxina nu este
foarte bine cunoscuta datorita raritatii cazurilor. Date estimative cu privire la
doza de risc pentru oameni au fost obtinute cu ocazia unor intoxicatii
colective izbucnite, una n India n 1974 n cursul careia au fost afectate
aproape 400 de persoane din care o treime au murit, si alta n Kenia n 1982,
unde au fost spitalizate 20 de persoane dintre care au decedat 12.
Investigatiile din aceste focare de aflatoxicoza au dus la concluzia ca ele sau datorat ingestiei repetate a unei cantitati de 38-55 micrograme de

aflatoxina / kg corp, mai multe zile la rnd. Cercetarile din UK au aratat ca


cei mai multi oameni consuma mici cantitati de micotoxine n dieta fara nici
un efect negativ evident. Un nivel ridicat de micotoxine sau ingerari
frecvente pe o perioada mai mare de timp poate conduce la serioase
probleme de sanatate. Cteva micotoxine sunt suspectate a cauza cancer sau
tumori, n timp ce altele pot afecta ficatul, rinichii, sistemul de reproducere
sau sistemul nervos. n acest context reglementarile europene actuale au
apropiat foarte mult standardele de productie a nutreturilor de cele din
industria alimentara. Potrivit acestora, intreprinderile producatoare de
nutreturi trebuie sa se asemene n proportie tot mai ridicata cu ntreprinderile
care produc alimente iar nutreturile trebuie sa fie libere de factorii nocivi si
sa corespunda celor mai performante conditii nutritionale si igienice. Deci,
intr-o Europa dezvoltata, lantul de nutreturi trebuie sa devina un lant
alimentar care se bucura de ncrederea consumatorilor.
n Comunitatea Europeana, Directiva 89/397/EEc de Control Oficial al
Produselor Alimentare (Official Control of Foodstuffs, OFC) stabileste
cadrul legal privind analiza contaminantilor din alimente. OFC are aceleasi
drepturi ca si Codex Alimentarius cu care colaboreaza. Standardizarea
analizelor se realizeaza de catre European Organisation for Standardisation
(CEN), al carui Comitet Tehnic are grupe de lucru special pentru aditivi si
contaminanti, printre care si micotoxinele. n programul CEN TC 275,
grupul de lucru 5 se ocupa cu standardizarea metodelor de analiza a
biotoxinelor (cu teme pentru a analiza aflatoxinele, ochratoxina, patulina,
fumonisina etc.). Directiva 89/397 a fost completata de Directiva 93/99 din
1993 privind masurile aditionale pentru elaborarea de criterii practice de
urmarire, control si inspectie. n 1989, Comitetul European pentru
standardizare a elaborat EN45002 si 45003 referitoare la criteriile de

evaluare a laboratoarelor pentru testarea alimentelor, respectiv pentru


acreditarea acestora. Ulterior, metodele de analiza au fost aliniate la
recomandarile Codex Alimentarius Commission privind metodele de analiza
si prelevare a probelor,
ALINORM 97/23 si 37 (FAO, 1997) si ISO/IEC 17025 din 1999.

Reglementri europene referitoare la nivelul maxim admis de


micotoxine din cereale i produse cerealiere
REGLEMENTRI EUROPENE: Nr. 1881/2006 i Nr. 1126/2007

Ochratoxina A
Cereale neprocesate 5 g/kg
Cereale neprocesate, destinate direct consumului uman 3 g/kg
Cereale procesate pentru copii 0,5 g/kg
Deoxinivalenol
Cereale neprocesate, altele dect gru dur, ovz i porumb 1250 g/kg
Gru dur, porumb i ovz neprocesate 1750 g/kg
Cereale i produse de mcini destinate direct consumului uman 750
g/kg
Paste finoase 750 g/kg
Pine, biscuii, snacks 500 g/kg
Cereale procesate pentru copii 200 g/kg
Produse de la mciniul porumbului cu particule > 500 m 750 g/kg
Produse de la mciniul porumbului cu particule 500 m 1250 g/kg
Zearalenon
Cereale neprocesate, altele porumb 100 g/kg
Porumb neprocesat 200 g/kg

Cereale destinate direct consumului uman 75 g/kg


Pine, biscuii, snacks 50 g/kg
Cereale procesate pentru copii 20 g/kg
Porumb neprocesat, cu excepia celui destinat procesrii umede 350
g/kg
Porumb destinat direct consumului uman, mlai 100 g/kg
Produse de la mciniul porumbului cu particule > 500 m 200 g/kg
Produse de la mciniul porumbului cu particule 500 m 300 g/kg
Aflatoxine
Cereale, produse cerealiere B1 2 g/kg;
B1+B2+G1+G2 4 g/kg
Porumb dup tratamente fizice B1 5 g/kg;
B1+B2+G1+G2 10 g/kg
Cereale procesate pentru copii B1 0,1 g/kg
Fumonisine
Porumb neprocesat, cu excepia celui destinat
procesrii umede 4000 g/kg
Porumb destinat direct consumului
uman 1000 g/kg
Produse pentru mic dejun, snacks-uri
din porumb 800 g/kg
Produse pe baz de porumb
pentru copii 200 g/kg
Mlai, germeni 1000 g/kg
Produse de la mciniul porumbului
cu particule > 500 m 1400 g/kg
Produse de la mciniul porumbului

cu particule 500 m 2000 g/kg

Tehnici rapide de determinare a micotoxinelor


Creterea complexitii analitice n industria alimentar impune rezultate
rapide pentru fiecare contaminant individual. n acest context metodele
rapide pentru analiza micotoxinelor au nceput s capete o importan din ce
n ce mai mare. Sunt uor de aplicat i pot fi extrem de utile n msurarea
siguranei alimentelor, n stabilirea conformitii legale i n schimburile
comerciale. Multe metode rapide furnizeaz rezultate cantitative sau
semicantitative i sunt recomandate pentru sceening-ul probelor.

ANALIZA
IMUNOLOGICA
ELISA

IMUNO
DETERMINARI
BAZATE PE
MEMBRANE

TEHNOLOGIA
LUMINEX xMAP

TEHNOLOGIA
MICROARRAY

ANALIZA
FLUORIMETRICA

MICOTOXINE

POLIMERI CU
RECUNOASTERE
MOLECULARA

METODA
FLUOROMETRICA
TEHNOLOGIA
UNDELOR
EVANESCENTE

Monitorizarea coninutului de micotoxine (DON, ZEA, OTA) din gru i


pine cu coninut ridicat de fibre se va realiza folosind metoda imunologica
ELISA.
Testul ELISA se bazeaz pe reacia antigen-anticorp. Avantajul tehnicii
deriv din caracterul extrem de selectiv al reaciei antigen anticorp ca i
din posibilitatea de a folosi o mare varietate de marcatori fapt ce permite
sensibilizarea teoretic nelimitat a determinrii.
Principiul tehnicii ELISA pentru determinarea micotoxinelor:
a) amestecare prob cu micotoxin-enzim;
b) amestecare coninut cu anticorpii de fixare din godeu;
c) legarea micotoxinelor de anticorpi;
d) ndeprtarea prin splare a materialului nelegat;

e) adugare substrat pentru developarea culorii;


f) adugare soluie pentru stoparea reaciei.

CLASIFICAREA TEHNICILOR
CROMATOGRAFICE
S-au

realizat

numeroase

variante

ale

metodei

cromatografice, diferind unele de altele n primul rnd prin


natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se
distinge:
a. cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobila este un
lichid in
cadrul careia se distinge:
-cromatografia de lichide pe coloana deschisa;
-cromatografia de lichide pe coloana inchisa;
b. cromatografia de gaze (GC) cnd faza mobila este un
gaz;
c. cromatografia cu fluide supracritice la care faza
mobila este un
lichid aflat peste temperatura critica.
A. n cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai
multe variante, n functie de mecanismele de separare:
1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea
substantelor organice cu molecule de dimensiuni mici si
medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina, folosindu-se, ca
faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici.
2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece
pe o faza

stationara solida, poroasa, formata din materiale specifice schimbatorii de ioni


- substante cu o retea solida afnata, de natura organica sau
anorganica. Cele mai raspndite sunt rasinile schimbatoare
de ioni.
3. Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe
faze
stationare poroase dar cu porozitatea selectionata astfel
nct

sa

corespunda

dimensiunilor

moleculelor

supuse

separarii. O parte dintre molecule intra prin pori, iar altele


sunt excluse deplasndu-se practic neretinute odata cu faza
mobila. Tehnica se mai ntlneste si sub denumirea de
filtrare prin geluri sau permeatie prin geluri n functie de
natura apoasa sau organica a fazei mobile.
4.

Cromatografia

lichid-lichid

(LLC),

care

faza

stationara este o
faza lichida, nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un
suport solid, ntr-o coloana. Aici suportul solid este inert fata
de componentele din proba. Acesta tehnica este cea mai
raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografia de
lichide.
5.

Cromatografia

pe

coloana

deschisa

sau

cromatografia planara
(PC) faza mobila circula printr-un material poros dispus ntrun plan si formnd un strat relativ subtire, dar de compozitie

asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe


coloana. Se disting:
Cromatogafia pe hrtie, tehnica n care faza stationara
este o hrtie poroasa din celuloza (initial o hrtie de filtru)
care este irigata de solvent prin forte capilare.
Cromatografia pe strat subtire (TLC), n care faza
stationara pulverulenta este fixata de suportul plan (sticla,
aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat
subtire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigata prin capilaritate.
Cromatografia pe strat subtire de nalta performanta
(HPTLC), n care faza stationara are granulatie extrem de
fina ridicndu-se astfel eficienta separarilor dar si viteza
acestora.
B. n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (sau
mai pretentious cromatografiei n faza gazoasa), denumita
prescurtat GC se disting urmatoarele tehnici:
1. Cromatografia gaz-lichid n care faza stationara este un
lichid
nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi
unul granular, poros, situat ntr-o coloana n asa-numita
cromatografie de gaze conventionala sau chiar pe peretii
coloanei,

confectionata

de

dimensiuni

capilare,

cromatografia pe coloana capilara.


2. Cromatografia gaz-solid este analoga cu cromatografia
de adsorbtie si la cea de excluziune sterica cu deosebirea ca
schimbarea

gazului

nu

modifica

selectivitatea.

Faza

stationara o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv


sitele moleculare (niste silicati naturali sau sintetici)
respective granulele de carbon poros. Metoda este extrem
de importanta pentru separarea gazelor permanente (CO,
CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA


PERFORMANTA (HPLC)
Generalitati
Cromatografia de lichide de nalta performanta (HPLC)
acopera

azi,

substantelor

proportie

moleculare:

aproximativ

organice,

80%,

analiza

organometalice

si

anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labili termic


precum si compusii cu masa moleculara ridicata (naturali
sau sintetici). De aceea, mpreuna cu cromatografia de gaze
constituie un punct de sprijin important n analizele chimice
moderne. Desi eficacitatea coloanelor nu o egaleaza nca pe
cea din GC, prin faptul ca se poate modifica, pe lnga faza
stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face
posibile separari si analize uneori
imposibil

de

realizat

prin

alte

tehnici.

Cuplajul

cu

spectrometria de masa a transformat, n ultimul timp,


aceasta metoda n principalul mijloc de analiza a compusilor
moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii

pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a


dezvoltat biochimia si biotehnologia moderna.

Metoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi,


cromatografia pe coloana clasica, care servea n primul rnd
la

izolarea

preparativa

compusilor

naturali.

Prin

introducerea pompelor si n consecinta, lucrndu-se la


presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze
stationare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent
constituite din granule de faze stationare sferice, cu
diametre 2-5m), n coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a
ajuns, ncepnd cu anul 1969, la configuratia actuala (fig. 9).
Se poate observa ca din rezervoarele continnd unul sau mai
multi solventi pompa (sau pompele), alimenteaza coloana cu
eluent (de regula un amestec de doi sau mai multi solventi).
n imediata vecinatate a coloanei se introduce proba,

automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. n coloana


aflata ntr-o etuva termostat, are loc separarea propriu-zisa.
Efluentul

coloanei

intra

ntr-un

detector

de

unde

componentul, daca este separat complet, poate fi colectat si


izolat, cu ajutorul unui colector de fractiuni. Semnalul este
nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui
calculator. n esenta, un cromatograf analitic HPLC are
structura din fig.

unde nu s-a mai prezentat colectorul de

fractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se


poate observa asemanarea cu GC singura deosebire majora
constituind-o sursa de eluent pompa.
Solvent Pompa Injector Coloana Detector
nregistrator
Schema bloc a unui cromatograf HPLC
Cromatografia de lichide de inalta performanta este folosita
pentru analiza substantelor moleculare: organice, organometalice si anorganice inclusive compusii foarte polari sau
labili termic precum si compusii cu masa moleculara ridicata.
Aceasta metoda a facut posibile separari si analize uneori
imposibil de realizat prin alte metode. In cromatografia de
lichide de inalta performanta detectorii sunt situati la iesirea
eluentului din coloana cromatografica. Sistemul de detectie
trebuie:

sa fie foarte senibili deoarece coloanele de separare au


capacitati de incarcare mici;
volumul lor sa fie de ordinul micronilor apropiat de cel al
probei care e de ordinul mirolitrilor (8-10l) pentru a sesiza
in mod continuu picul cromatografic.
Detectorii folositi in cromatografia de lichide de inalta
performanta se deosebesc in primul rand prin principiul de
functionare:
- detectori spectrofotometrici n UV-VIS au la baza legea
Lambert-Beer;
- detectorii refractometrici au la baza legea lui Fresnel;
-

detectorii electrochimici au la baza proprietatea de

conductivitate a solutilor;
-

detectori de fluorescenta au la baza propritatea de

fuorescenta a substantelor.
Un alt criteriu prin care se deosebesc sau se aseamana este
cel referitor la amestecurile de substante asupra careia se
fac analizele:
- detectori spectrofotometrici n UV-VIS sunt folositi in
identificarea

hidrocarburilor

liniare

si

aromatice

si

derivatilor lor cu diferite functiuni organice;


- detectorii electrochimici sunt folositi pentru identificarea
substantelor in amestecurilor de electroliti si la substantelor
care se pot oxida respectiv reduce;

- detectorii de fluorescenta sunt folositi la identificarea


substntelor care prezinta fluorescenta sau pot fi tranformati
in derivati ce prezinta aceasta proprietate;
- diodele Array sunt folosite in multe cazuri de identificare.
Un alt criteriu de comparatie intre detectori este cel al
valorilor caracteristice ale domeniului liniar dinamic si al
sensitivitatii.
Fiecare detector prezinta avantaje si dezavantaje iar pentru
alegerea celui mai potrivit detector necesar in identificarea
subtantelor dintr-un amestec se vor tine cont de ele.

FAZE IN HPLC
Prepararea probei
Injectarea in coloana
Eluarea cu faza mobila
Detectarea componentilor din proba
Identificare si masurare

Stabilirea metodelor de determinare a concentratiei de


micotoxine.
Principiile de validare a metodei HPLC

A) Tatonari
1) preparari solutii standard
- apa + substanta (concentratii medii si mici)
- parametrii HPLC (conc, debit, detector, injectare)
- coloana si faza mobila
- gradient de concentratie (cand e cazul)
2) stabilire profil de actiune al substantei
- substante izomere prezente in sistem concomitent
- substante rezultate prin degradare
- etaloane (izomeri, substante de degradare)
3) - concluzii
- stabilire lungime de unda pentru analiza
- specificitate fara interferente la RT (Retention Time)
B) Studii intermediare
- stabilitate on line ( 1 2 3 12 24 ore) la diferente de
temperatura cuprinse intre 5C
- liniaritate solutii standard 8 conc. ( 3 conc. la limita minima)
C) Validare
1) Specificitate
- teste in diferiti solventi (polari si nepolari cel putin 5)
- lipsa interferentelor la RT
2) Partea Esentiala preparari solutii
a) liniaritate din faza mobila se prepara 8 conc. (3 la minim)
C1-1 C2 C3-1 C4-1 C5 C6 C7-1
C8

C1-2

C3-2 C4-2

C7-2

C1-3

C3-3 C4-3

C7-3

C1-4

C3-4 C4-4

C7-4

C1-5

C3-5 C4-5

C7-5

LDD

QCA QCB

QCC

QCD dilutie 4x a solutiei C8 se repeta in fiecare zi


b) exactitatea (acuratetea accuracy) E%
- la concentratii mici E% < 20%
- la concentratii mari E% < 15%
c) coeficientul de variatie ( precizia repetabilitatea ) CV%
- la concentratii mici CV% < 20%
- la concentratii mari CV% < 15%
3) Reproductibilitatea inca 4 zile preparari ( QC-uri )
- liniaritatea 8 conc. ( 3 conc. la limita minima)
- valori identice C1 C8 de mai sus
- se calculeaza E% si CV% - criterii identice
4) Stabilitatea
a) on line (studii intermediare) in autosampler (?)
b) la inghet-dezghet ( 3 cicluri termice)
c) in timp 1 saptamana 2 saptamani 4 saptamani

Etapele validarii metodelor de studiu cu HPLC


Stadiu preliminar de studiu Pre-Study
n aceasta etapa initiala se realizeaza testarea reactivitatii
substantelor n
contact cu diferite medii la final ntocmindu-se protocolul de
validare PreStudy.

A. Tatonari
a) se prepara solutii standard n mediu apos sau solvent
preselectat:
- prepararea solutiilor de concentratii medii si mici utiliznd
substanta active si apa purificata sau solvent pur;
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului HPLC;
- se alege coloana cromatografica si faza mobila de lucru;
- eventual se stabileste gradientul de concentratie respectiv
etapele intermediare de spalare a coloanei cromatografice.
b) se prepara blanc-uri de solutie n vederea eliminarii
posibilelor interferente cu substantele active luate n lucru:
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului HPLC;
- se efectueaza studii pe coloana cromatografica si faza mobila
aleasa;
-

se

efectueaza

studii

pentru

alegerea

gradientului

de

concentratie si a
etapelor de spalare a sistemului.
c) se dopeaza matricea cu substante active la concentratii medii
si mici:
- se stabilesc parametri de lucru ai sistemului HPLC astfel nct
semnalele
de raspuns ale substantelor active respectiv ale componentelor
de degradare sa nu se suprapuna, pentru posibilitatea evaluarii
cantitative a substantelor active dopate;
- se efectueaza studii pe coloana cromatografica si faza mobila
aleasa;

se

efectueaza

studii

pentru

alegerea

gradientului

de

concentratie si a
etapelor de spalare a sistemului.
d) se stabileste profilul de actiune al substantei active:
- se stabileste daca exista substante rezultate printr-o posibila
degradare sau asociere;
- se stabileste semnalul de raspuns corespunzator fiecarei
componente
cunoscute;
- se efectueaza studii de determinare a substantelor noi aparute
n procesul de dopare (substante de asociere, degradare,
metaboliti etc), n vederea selectarii celor care prezinta interes.
B. Faza de stabilire a caracteristicilor de performan ta a
metodei
a) se efectueaza studii de stabilitate on-line pentru substantele
active, derivati respectiv standarde de lucru, n autosamplerul
sistemului HPLC, la temperatura prestabilita si la intervale de
timp de 1, 2, 3 ... 10, ...12, ...24, ...48 ore, perioada care sa fie
acoperitoare cu un exces de cel putin 30% fata de timpul maxim
stabilit pentru secventa completa.
b) se verifica liniaritatea nregistrarilor pentru 8(opt) concentratii
diferite (dintre care 3(trei) aproape de limita minima) att pentru
solutiile standard ct si pentru cele dopate cu substante active,
derivati, alte substante etalon.
C. ntocmirea protocolului de validare Pre-Study
n protocol se trec concluziile referitoare la caracteristicile si
parametri

specifici ce trebuie urmariti si au fost stabiliti prin studiile


efectuate:
a) scopul validarii pentru unul sau mai multi compusi;
b) alegerea cantitatilor si calitatii corespunzatoare pentru proba
de validare
(pentru substantele etalon respectiv metaboliti si substante de
degradare),
standardul de lucru;
c) elaborarea metodei de validare (parametri de lucru)
- alegerea parametrilor care se urmaresc n cadrul validarii
(lungimea de unda la nregistrarea spectrului UV frecventa
radiatiei de fluorescenta)
- alegerea metodelor de cuantificare a parametrilor alesi;
- stabilirea limitelor de acceptare a parametrilor care se
determina numeric, pe baza limitelor de acceptare a substantei
active din produsul farmaceutic (specificitatea trebuie sa fie
maxima fara interferente la timpul de retentie RT, randamentul
de extractie maxim)
d) stabilirea timpului de validare.
Validarea preliminara Pre-Study a metodei
A. Specificitatea (specificity) se determina pe baza studiilor
efectuate pe
6 blanc-uri de matrici diferite, astfel nct la timpul de retentie
stabilit (RT) sa nu existe interferente.
B. Carcateristici specifice metodei propuse
1. Curba de calibrare (Linearity) se determina pentru probele
de plasma

dopate cu substante active, derivati sau alte substante etalon


(STD) la 8 nivele de concentratie diferite (dintre care trei la valori
mici) c1 c8. Pentru solutiile de concentratii c1, c3, c4 si c7 se
repeta determinarile de cte 4 ori pentru a avea date multiple la
concentratia minima-c1 , medie-c4 si mare-c7, respectiv ale
controlului de calitate QCA-c3, QCB-c4 si QCC-c7, si nu n ultimul
rnd se prepara o solutie QCD prin dilutia de 4 ori a celei mai
concentrate valori c8 pentru care se efectueaza doua determinari.
Probele QC trebuie efectuate zilnic n solutii standard.
2. Exactitatea (acuratetea Accuracy) E%, se determina prin
calcule si
trebuie sa respecte conditia urmatoare:
- E% < 20% pentru valorile celei mai mici concentratii;
- E% < 15% pentru toate celelalte concentratii.
3. Coeficientul de variatie (precizia-repetabilitatea PrecisionRepetability) CV% se determina prin calcule si trebuie sa respecte
urmatoarele conditii:
- CV% < 20% pentru valorile celei mai mici concentratii;
- CV% < 15% pentru toate celelalte concentratii.
4. Randamentul de extractie (Recovery, RE) _% se determina la
solutiile
cu concentratiile c1, c3, c4, si c7 din solutiile standard.
C.

Reproductibilitatea

(Intermediate

Precision)

se

determina n
urmatoarele 4 zile consecutive, repetnd probele de la liniaritate
cu cele 8
concentratii c1 c8 alese mai sus pentru care se calculeaza
exactitatea (acuratetea)E% si coeficientul de variatie (precizia)

CV%,

respectnd

criteriile

precizate

la

paragrafele

corespunzatoare.
D. Stabilitatea (Stability) care se determina tinnd seama de
urmatoarele:
1.

stabilitatea

on-line

(intermediara)

autosamplerul

sistemului HPLC pentru o durata care excede cu cel putin 30%


timpul maxim pentru derularea unei secvente complete.
2. stabilitatea la nghet-dezghet freeze-thaw pentru care se
efectueaza 3 cicluri de temperatura.
3. stabilitatea de lunga durata pentru care se prepara solutii care
se vor stoca si analiza dupa 1, 2, 3, 4 ... saptamni.
E. ntocmirea raportului validarii care trebuie sa contina
valorile nregistrate, modul de calcul al diferitelor caracteristici si
parametri, reprezentarile grafice si evaluarile si interpretarile
rezultatelor. Pentru justificarea concluziilor finale ale raportului
trebuiesc

anexate

cromatogramele

nregistrate

cu

numele

analistului care a efectuat validarea si a celor care au verificat si


aprobat metoda.

Definirea si determinarea parametrilor de


performanta ai metodei de studiu cu HPLC
Definitie: Caracteristicile si parametri de performanta sunt
proprietati de baza ale metodelor analitice cu ajutorul carora se
demonstreaza ca metoda dezvoltata corespunde scopului propus.
Caracteristici de performanta:
A. Specificitatea (Specificity)
Investigatiile de selectivitate se efectueaza mpreuna cu cele
pentru curbele de calibrare care dau liniaritatea. Media naltimii

picurilor masurate pentru probele standard de calibrare la cea


mai

mica

concentratie

de

cuantificare

(Lower

Limit

of

Quantification, LLQ) se calculeaza si se compara cu posibilele


picuri endogene din blanc-urile de matrici nedopate. Conditia
de baza este ca n cromatogramele blanc-urilor de matrici
nedopate sa nu existe picuri semnificative la timpii de retentie ai
maximelor examinate. Valorile sunt acceptabile doar daca
naltimea picului compusului endogen este mai mica dect 20%
din naltimea picului substantei studiate la cea mai mica
concentratie (LLQ).
B. Curba de calibrare (Linearity)
Pentru fiecare dintre cele cinci nivele de concentratie alese se
prepara cte cinci probe (STD) care se analizeaza ntr-o singura
serie. Diferenta procentuala calculata fata de valoarea nominala
a concentratiei preparate se determina pentru fiecare standard
STD . Conditia de baza pentru ca modelul sa fie acceptat trebuie
sa respecte o valoare de cel putin 0,99 pentru coeficientul de
regresie (R2), iar coeficientul de variatie (CV%) trebuie sa fie
cuprins

ntr-un

domeniu

de

20%

pentru

cea

mai

mica

concentratie respectiv 15% pentru toate celelalte concentratii


testate.
C. Precizia si Acuratetea (Precision and Accuracy)
Se analizeaza probele de control de calitate (Quality Control,
QC) ntr-o
singura serie de cte 5 probe identice pentru fiecare nivel de
concentratie ales si se compara cu valorile teoretice obtinute
pentru curba de calibrare. (determinari zilnice, intra-day assay).
De asemenea, n fiecare din cele cinci zile se mai efectueaza cte

o singura proba de control de calitate (QC) la fiecare dintre


concentratiile alese si se compara cu valorile teoretice obtinute
pentru curba de calibrare (determinari n zile succesive, betweendays

assay).

Se

calculeaza

concentratiile

medii,

deviatiile

standard relative (relative standard deviation, SD), coeficientii de


variatie (coefficient of variation, CV%) si diferentele valorilor
medii fata de cele nominale (E%) la toate nivele de concentratie.
Conditia de baza pentru acceptarea preciziei este ca deviatia
standard relative (SD) a probelor de control de calitate (QC) sa
nu depaseasca 15% att n determinarile zilnice ct si n
determinarile n zile succesive. Iar conditia principala pentru
acceptarea acuratetei este ca diferenta ntre media valorilor
masurate si a celor nominale sa nu depasesca 15% nici n
determinarile zilnice, nici n determinarile n zile succesive.
D. Limita minima de cuantificare (LLQ)
Se analizeaza 5 probe identice la concentratia minima de
cuantificare (LLQ), si se compara fata de valoarea teoretica din
curba de calibrare pentru determinarile n zile succesive. La
aceste concentratii se calculeaza diferenta dintre media valorilor
masurate si cele nominale (E%), deviatia standard relativa (SD)
si coeficientul de variatie (CV%).
Conditia de baza pentru acceptarea preciziei este ca deviatia
standard relative (SD) a concentratiilor din probele masurate
(LLQ) sa nu depaseasca 20% nici n determinarile zilnice, nici n
determinarile n zile succesive. Iar conditia principala pentru
acceptarea acuratetei este ca diferenta ntre media valorilor
masurate fata de cele nominale sa nu depaseasca 20% nici n
determinarile zilnice nici n cele din zile succesive.

E. Probele de dilutie (Sample Dilution)


n fiecare din cele 5 zile de determinari se prepara o proba prin
diluarea de 4 ori cu blanc de matrice nedopata, a celei mai
concentrate alese pentru curba de calibrare c8, iar concentratia
probelor diluate se determina prin comparatie cu valorile
determinarilor zilnice. Conditia de baza pentru ca rezultatul sa fie
acceptat este ca valoare diferentei medii masurate fata de cea
nominala sa nu depaseasca 15%.
F. Stabilitatea (Stability)
F1 Stabilitatea n autosampler (On-Line Stability, OLS)
Se prepara cte 8 probe pentru doua concentratii diferite, alese
astfel nct sa fie una aproape minima iar cealalta aproape
maxima n comparatie cu valorile concentratiilor alese pentru
curbele de calibrare. Toate probele se pastreaza la temperatura
din autosampler (cea aleasa pentru seria de determinari) si se
analizeaza dupa 2, 3, 4 ...10, ...24, ...48 ore, calculndu-se
valorile concentratiilor fata de curba de calibrare din prima zi.
Conditia de baza pentru acceptarea stabilitatii n autosampler
este ca nici una dintre valorile determinate dupa perioadele de
timp descrise mai sus, pentru toate probele de la ambele
concentratii alese sa nu depaseasca un domeniu de 15% fata
de valoarea de referinta.
F2 Stabilitaea de lunga durata (Long-Term Stability, LTS)
Se prepara cte 16 (sau un alt multiplu de 4x) probe pentru cele
doua concentratii alese la stabilitatea n autosampler (descrisa
mai sus). n prima zi se analizeaza cte 4 perechi de probe pentru
ambele concentratii si se compara cu valorile obtinute pentru
curba de calibrare din ziua respectiva. Restul probelor preparate

se pastreaza n aceleasi conditii n care se pastreaza si probele


matricilor prelevate si se analizeaza cromatografic dupa 2, 3
respectiv 4 (sau mai multe) saptamni. De fiecare data se
masoara cte 4 probe din fiecare concentratie si se compara cu
valorile obtinute pentru probele proaspat preparate (tot cte 4) si
curbele

de

calibrare

corespunzatoare

zilei

respective.

Concentratiile se determina fata de curbele de calibrare din ziua


respectiva, att pentru probele depozitate ct si pentru cele
proaspete, apoi se compara valorile medii pentru ambele
categorii (fresh si old). Conditia ce baza pentru a considera
analitul stabil este ca diferenta dintre valorile medii din probele
nghetate si pastrate fata de mediile celor proaspete sa nu
depaseasca 15%.
F3 Stabilitatea la nghet-dezghet (Freeze-Thaw Stability, FTS)
Se prepara cte 4 probe pentru cele doua concentratii alese (ca
mai sus la
stabilitatea n autosampler), care vor fi supuse unor cicluri
repetate de 3 ori de nghet-dezghet n 3 zile consecutive. Dupa
cel de-al treilea ciclu se analizeaza probele n comparatie cu
probe

proaspat

preparate

ziua

respectiva

(cu

aceleasi

concentratii) si se determina valorile concentratiilor fata de curba


de calibrare din aceeasi zi. Conditia de baza pentru ca proba sa
fie considerata nealterata de procesele de nghet-dezghet este ca
diferenta dintre valorile medii ale probelor (FTS) fata de cele
proaspete sa fie cuprinsa ntr-un domeniu de 15%.
G. Randamentul de recuperare (Retrieving Efficiency, RE)
Se prepara 4 probe dupa cum urmeaza, una pentru limita minima
de

cuantificare

(LLQ),

iar

celelalte

trei

pentru

valorile

concentratiilor de control de calitate (QC). Aceste probe se


prepara ntr-o zi a perioadei validare, astfel nct se analizeaza si
se compara cu mediile valorilor a cte 5 probe din cea mai mica
concentratie (LLQ) respectiv control de calitate (QC). Eficienta se
calculeaza prin raportarea mediei naltimii picurilor pentru valorile
preparate la concentratiile (LLQ, QC) fata de naltimile picurilor
probelor de referinta preparate n supernatant.

Determinarea ochratoxinei A din cafea boabe


prin metoda
HPLC
Rezumat:
Scop. Validarea metodei de determinare a ochratoxinei A prin cromatografie
de lichide de nalt performan (HPLC) i aplicarea acesteia pe probe de
cafea boabe prjit.
Material i metod. Probele de cafea, achiziioante din reeaua comercial a
oraului Iai, au fost supuse extraciei cu un amestec CH3OH: NaHCO3 (n
raport de 80:20). Extractele au fost purificate prin extracie n faz solid
(C18) pentru reinerea ochratoxinei A. Micotoxina a fost eluat cu
cloroform; faza organic a fost evaporat la sec i apoi, reziduul reluat cu 0,6
ml faz mobil. Un volum de 20 l a fost supus analizei HPLC. Analiza s-a
realizat pe un cromatograf de lichide tip HP 1090 Series II, echipat cu o
coloan cromatografic tip Stable Bond SB - C18 (150 x 4,6 mm; 5 m),
folosind ca faz mobil un amestec de acetonitril : ap : acid acetic (n raport

de 99 : 99 : 2). Detecia ochratoxinei A s-a realizat n fluorescen (ex=228


nm i em=423 nm).
Rezultate. Metoda HPLC a fost validat. ntr-un numr de 5 probe (12,5%
din numrul total de probe), ochratoxina A a fost prezent sub limita maxim
admis de legislaia n vigoare (5 g/kg cafea boabe prjit), ntr-o singur
prob concentraia ochratoxinei A a fost peste limita maxim admis A iar n
34 de probe (85% din numrul total probe) ochratoxina A nu a fost
identificat prin metoda aplicat.
Discuii. Aceast lucrare contribuie la evaluarea prezenei ochratoxinei A n
produsele alimentare (cafea boabe) comercializate n Romnia i atrage
atenia asupra riscului consumului de alimente contaminate cu micotoxine.
Introducere
Ochratoxina A (Figura nr. 1) este un metabolit toxic produs de specii din
genul Aspergillus n zonele tropicale i subtropicale i de specii din genul
Penicillium n zonele temperate (1). Ochratoxina A a fost izolat pentru
prima dat din culturi de Aspergillus ochraceus de Van der Merwe i colab.
n anul 1965 (2) n timp ce testau capacitatea toxigen a unor tulpini de
micromicei izolate din diferite boabe de cereale i legume.

Figura nr. 1 Ochratoxina A structura chimic

Penicillium verrucosum este izolat frecvent din probe de cereale n timp ce


A. ochraceus contamineaz boabele verzi de cafea, condimentele, boabele de
cacao, soia i arahide (3). Studii experimentale au demonstrat aciunea
imunotoxic, neurotoxic, nefrotoxic, teratogen i cancerigen a
ochratoxinei A. Datorit aciunii cancerigene, evideniate pe animale de
experient, ochratoxina A a fost inclus de Agenia Internaional de
Cercetare a Cancerului (1993) n grupul substanelor posibil carcinogene
grupul 2B.
Material i metod
- balan;
- baie de ultrasunete;
- micro-sering Hamilton;
- HP 1090 Series II lichid cromatograf echipat cu detector cu multidiode
UV-VIS i detector de fluorescen;
- coloan cromatografic tip Stable Bond SB - C18 (150 x 4,6 mm; 5 m);
- standard ochratoxin A (Sigma-Aldrich);
- coloane SPE C18 (Lida, manufacturing corp.);
- hrtie de filtru cantitativ (Schleicher & Schuell MicroScience);
- acetonitril (puritate HPLC, gradient grade, Riedel de Han);
- cloroform (puritate HPLC, Sigma Aldrich);
- metanol ChromasolvR (puritate HPLC, Riedel de Han)
- acid acetic glacial 99,99% (Sigma Aldrich);
- sulfat de sodiu (A.C.S. reagent, Sigma Aldrich);
- ap (puritate HPLC, Merck);
- faz mobil: amestec acetonitril : ap : acetic acid (n rapotul 99: 99: 2).
Procedeu de lucru

Extractia ochratoxinei A si purificarea extractului


Probele de analizat (cafea boabe prajite vrac) au fost supuse extractiei in
vederea separarii ochratoxinei A.
Astfel, o cantitate de 20 grame proba maruntita se agita 20 minute cu un
volum de 20 ml amestec CH3OH :NaHCO3 3%(80 :20) dupa care se filtreaza
prin hartie de filtru cantitativa (4, 5). Filtratul se trece prin coloana SPE
preconditionata prin spalare succesiva cu 4ml metanol, respectiv cu 4 ml apa
purificata. Ochratoxina A este eluata de pe coloana cu un volum de 3 ml
cloroform, cu o viteza de 2 ml/min. Faza organica se evapora la sec ; reziduu
obtinut se reia cu un volum de 0,6 ml faza mobila si se supune analizei
HPLC prin injectarea unui volum de 20 l in conditiile mentionate.
In paralel, s-au lucrat probe imbogatite cu cantitati cunoscute de
ochratoxina A pentru stabilirea randamentului de extractie.
Analiza HPLC s-a realizat astfel ; un volum de 20 l proba (obtinuta prin
dizolvarea reziduului obtinut in urma prelucrarii probei intr-un volum de 0,6
ml faza mobila) a fost supus analizei pe un cromatograf de lichide tip HP
1090 Series II, echipat cu o coloana cromatografica tip Stable Bond SBC18(150x4,6mm ;5m ), folosind o faza mobila un amestec de
acetonitril :apa :acid acetic(in raport de 99 :99 :2). Detectia ochratoxinei A sa realizat in fluorescenta (ex=228nm si em=423nm)
Rezultate si discutii
Specificitate
Pentru determinarea specificitatii metodei au fost analizate probe
continand ochratoxina A si o proba continand faza mobile utilizata ca solvent
al probelor injectate. La timpul de retentie al ochratoxinei A nu s-a obtinut

nici un semnal in cromatograma corespunzatoare fazei mobile, rezulta deci


faptul ca nu exista interferenti(8,9,10)
Identificarea picurilor
Identificarea picului corespunzator ochratoxinei A se realizeaza in functie
de timpul de retentie. In conditiile mentionate, timpul de retentie pentru
ochratoxina A este de 9,5 min.

Fig. nr.2-Cromatograma pentru solutia standard de ochratoxina A


Validarea metodei de determinare a ochratoxinei A prin cromatografie
de lichide de inalta performanta(HPLC)
Pentru determinarea cantitativa a ochratoxinei A, metoda de analiza prin
HPLC prezentata a fost avalidata, urmarindu-se urmatorii parametrii ;
stabilitatea in timp asolutiei, linearitatea, limita de detectie si limita de
cuantificare, precizia sistemului, precizia metodei, exactitatea metodei.
Stabilitatea solutiei
Pentru a determina stabilitatea solutiei de ochratoxina A a fost analizata o
proba cu o concentratie de 19,5ng/ml ochratoxina A dupa ce a fost mentinuta
la temperatura camerei 2,3 si 10 zile. Rezultatele experimentale sunt
precizate in tabelul 1.
STABILITATEA SOLUTIEI

Nr.
1
2
3
4

Ziua
0
2
3
10

Arie pic
33,8
30,9
33,3
31,8

Date statistice
Arie medie=32,45
SD= 1,3379
RSD (%)= 4,1230
TABEL 1

In concluzie, probele in faza mobila continand ochratoxina A pot fi stocate


la temperatura camerei cel putin 10 zile, fara a aparea degradarea acestui
compus, avand in vedere faptul ca aria picului corespunzator ochratoxinei A
este aproximativ constanta(in acest caz, deviatia standard relativa avand
valoarea de 4,1230%)

Linearitatea,limita de detectie si limita de cuantificare


Pentru studiul linearitatii au fost analizate sase serii de solutii, pentru
fiecare

cromatograma

a fost

calculata aria picului

corespunzator

ochratoxinei A, iar valoarea ariei medie a fost reprezentata grafic functie de


concentratie. Prin analiza statistica au fost calculate ecuatia dreptei de
regresie, coeficientul de corectie (r) si eroarea standard de regresie. Folosind
panta dreptei de regresie si eroarea standard a acestei drepte s-au calculat
valorile limitei de detectie si a limitei de cuantificare.
In tabelul nr 2 sunt prezentate ariile picurilor corespunzatoare ochrtoxinei,
iar ia figura nr 3 este reprezentata dreapta de calibrare a ochratoxinei A.
Ariile picurilor ochratoxinei A obtinute in studiul linearitatii metodei
Ochratoxina A
(ng/ml)
9,765625
19,53125

I
20,000
33,800

II
17,1
26,7

Arie pic
III
IV
15,9
13,8
30,9
25,4

V
18,1
26,2

VI
17,8
33,3

Arie
medie
17,12
29,38

39,06250
78,12500
156,2500
312,5000
625,0000
937,5000
1250,000

56,100
95,000
177,30
337,80
628,40
898,74
1232,1

53,4
86,7
172,8
328,5
614,50
904,2
1194,8

45,1
93,3
165,8
331,9
619,70
898,4
1166,5

47,9
89,3
165,7
302,5
602,10
905,4
1192,6

42,6
85,8
164,5
306,8
559,90
909,7
1041,4

48,7
80,6
158,3
321,5
611,50
914,8
1202,2

48,97
88,45
167,40
321,50
606,02
905,21
1171,60
TABEL 2

Deoarece cantitatea de ochratoxina A din probe este mica, ecuatia curbei de


calibrare a fost calculate pentru concentratii cuprinse intre 9,765625 si
39,0625 ng/ml.

Figura nr 3. Dreapta de calibrare a ochratoxinei A


Dupa calcului statistic s-a obtinut ecuatia curbei de calibrare ;
Arie pic=1,0750780952381x concentratia+7,325
Valoarea coeficientului de corelatie (r) este 0,9983 iar eroarea standard a
curbei de regresie (SE) este 1,3229474665. Folosind aceste valori s-au
calculat limita de detectie (LD) si limita de cuantificare (LQ) cu formulele
(1 )si (2)
LD=3xSE =3x1,3229431474665=3,69 ng/ml (1)
panta

1,0750780952381

LQ=10xSE=10x1,3229431474665=12,31ng/ml (2)
panta

1,0750780952381

Precizie si exactitatea
Prima etapa in determinarea preciziei o reprezinta studiul sistemului.
Astfel, o solutie de concentratie de 20ng/ml a fost analizata de cinci ori.
Ariile picurile corespunzatoare ochratoxinei A pentru cele cinci determinari
sunt prezentate in tabelul nr 3.
Precizia sistemului la determinarea ochratoxinei A
Nr.
1
2
3
4
5

Arie pic
26,7
30,4
30,7
26,2
31,8

Date statistice
Arie medie = 26,16
SD = 2, 5344
RSD (%) = 8,6912

TABEL 3

Pentru aceste valori, deviatia relativa standard (RSD%) a fost calculata ca


fiind 8,6912%. Pentru concentratii in proba de ordinul ng, valoarea este
buna, sistemul este precis.
Precizia si exactitatea metodei au fost determinate prin calcularea valorii
medii a 3 determinari la trei concentratii deferite in jurul valorii de interes39,0625ng/ml,19,53125ng/ml

si

respectiv,

9,765625ng/ml(concentratii

urmarita +50%).
Intregul experiment a fost realizat in zile diferite, de alt analist, cu scopul
de a obtine informatii despre robustetea metodei.
Utilizand ecuatia curbei de calibrare si ariile picurilor au fost calculate
concentratiile pentru fiecare proba. A fost determinata regasirea ca procent
din valoarea concentratiei teoretice, regasirea medie si precizia metodei

exprimata prin deviatia stsndard relativa din regasirea calculata. Pentru


aceste doua grupuri de date (I si II), valorile obtinute sunt prezentate in
tabelul nr 4

Precizia si exactitatea metodei


Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Concentratia
Teoretica(ng/ml)
9,765625
19,53125
39,0625

Arie pic
I
20,0
18,1
17,8
33,8
26,2
33,3
56,1
42,6
48,7

II
17,1
13,8
15,9
26,7
25,4
30,9
53,4
47,9
45,1

Concentratia
calculata(ng/ml)
I
II
11,79
9,09
10,02
6,02
9,74
7,98
24,63
18,02
17,56
16,81
24,16
21,93
45,37
42,86
32,81
37,74
38,49
35,14

Regasire(%)

I
120,7
102,6
99,7
126,1
89,9
123,7
116,1
84,0
98,5
Media =
Minim =
Maxim =
Deviatia standard(SD) =
Deviatia standard relativa(RSD%) =

II
93,1
61,1
81,7
92,3
86,1
112,3
109,7
96,6
90,0
99,2%
61,6%
126,1%
16,7206
16,9629%
TABEL 4

Dupa prelucrarea statistica a ambelor seturi de determinari a rezultat o


valoare de 16,9629% a deviatiei standard relative ceea ce demonstreaza
precizia metodei :regasirea medie fiind de 99,2%(pe intervalul 61,6-126,1%)
ceea ce demonstreaza exactitatea metodei.

Valoarea medie (18 valori si o precizie de 95%,valoarea t din Student fiind


de 2,11), intervalul de incredere pentru regasire este de 83,29-115,00%.
Aplicatie la determinarea ochratoxinei A din probe de cafea boabe
prajita.
Metoda de analiza validata a ochratoxinei A prin HPLC a fost aplicata la
determinare ochratoxinei A din probe de cafea boabe.
Probele au fost procurate den reteaua comerciala a orasului Iasi si anume
din unitati ce comercializeaza produse vrac. S-au analizat 40 de probe de
cafea boabe prajita, de diferite sorturi(Columbia-10 probe, Jacobs- 10 probe,
Indonezia- 8 probe, Brazilia-4 probe, Robusta-2 probe, India-1 proba, cafea
decofeinizata- 5 probe).
In urma analizei prin HPLC, cromatogramele obtinute au fost prelucrate,
stabilindu-se aria picurilor corespunzatoare ochratoxinei A si, folosind
ecuatia dreptei de regresie, s-a calculat continutul in ichratoxina A pentru
probele de cafea(valori prezentate in tabelul nr 5)

Nr. crt.

Nr. proba

1
2
3
4
5
6

3
4
5
6
10
40

Continutul in ochratoxina A
Denumire
proba
Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Columbia
Cafea India

Ochratoxina A
(g/kg proba cafea
boabe)
0,77
0,87
1,06
0,55
9,47
3,35
TABEL 5

Din analiza datelor obtinute in urma determinarii ochratoxinei A din cele 40


de probe de cafea boabe prajita, s-a constatat ca intr-o singura proba (2,5%
din numarul total de probe) ochratoxina A este prezenta intr-o cantitae mai
mare decat limita maxima admisa de legislatia in vigoare (5g/kg cafea
boabe prajita)(11) : in 5 probe (2,5% din numarul total de probe) ochratoxina
A se gaseste in concentratii sub limita maxima admisa, iar intr-un numar de
34 probe (85% din numarul total de probe) ochratoxina A nu a fost
identificata prin metoda aplicata.
Concluzii
Metoda corespunde parametrilor de validare si a fost aplicata cu bune
rezultate la determinarea ochratoxinei A din probe de cafea boabe prajita.
Aceasta lucrare contribuie la evaluarea prezentei ochratoxinei A in
produsele alimentare ,cafea boabe vrac) comercializate in Romania.
Avand in vedere consumul crescut de cafea in randul populatiei adulte este
necesara

adoptarea

unor

masuri

in

vederea

protejarii

sanatatii

consumatorului, o masura importanta fiind evitarea comercializatii probelor


cu un nivel ridicat de contaminare cu ochratoxina A.

INCIDENA I TRANSFERUL DEOXINIVALENOLULUI


DIN FURAJE N SER LA OVINE
INTRODUCERE
Contaminarea cerealelor, cafelei, condimentelor, arahidelor i a produselor
derivate din acestea cu fusariotoxine a fost descris pe larg n literatura de
specialitate, datorit implicaiilor acestora asupra sntii animale i umane.
Omul este expus acestor riscuri att prin consumul de produse vegetale
contaminate, ct i prin consumul unor produse provenite de la animale care
au consumat hran contaminat. Deoarece acest risc alimentar este
considerat o problema de sntate public, se acord o importan din ce n
ce mai mareproblematicii cu privire la cile de metabolizare a micotoxinelor
n organismul animal i cel uman. Deoxinivalenolul este fusariotoxina cu cea
mai mare rspndire n cereale i n produsele derivate din acestea. Prin
mecanisme ca inducerea apoptozei la celulele hematopoetice i imunitare,
alterarea imunoglobulinelor i prin impactulasupra sintezei proteice,
deoxinivalenolul are efect hematotoxic, imunomodulator sau de inducere a
unei toxiciti cutanate. La rumegatoare, dei efectele
sunt mai puin toxice, studiile au asociat deoxinivalenolul cu reducerea
consumului de hran (T r e h o l m, 1985) sau cu pierderea produciei de
lapte (W h i t l o w, 1991). Rezultate tiinifice recente au demonstrat c
administrarea

deoxinivalenolului,

la

oaie,

produce

modificri

ale

parametrilor sangvini i ale activitii enzimelor hepatice (B u s u r i c u i Z


a m f i e s c u, 2007). Mecanismele de transfer al fusariotoxinelor n
organismul animal i uman rmn ns nc neclare. H e d m a n (1997)
consider c ratele de absorbie i metabolizare diferite sunt datorate

sensibilitii diferite a animalelor. Ali specialiti (M e k y, 2003; C a v r e t,


2006) au considerat c fusariotoxinele sunt rapid absorbite n intestinul
subire i se elimin n primele 24 de ore de la ingestie, urmat de o excreie
n cantiti mici. Totui, n produsele animaliere se gsesc urme ale
fusariotoxinelor i a derivatelor lor. De aici apare nevoia unor studii avansate
privind mecanismele implicate n metabolismul micotoxinelor i a
neutralizrii activitii lor nainte de a evalua riscul asupra sntii omului.
Deoarece cantitatea de deoxinivalenol prezent n sngele i esuturile de
origine animal n urma intoxicaiei cu fusariotoxine este foarte mic, de
ordinal ppm, se impune folosirea unor metode de analiz adecvat, cu limite
de detecie n acest interval. Dei pentru analiza deoxinivalenolului se
folosesc n general metode gaz cromatografice, i metoda cromatografiei de
lichide de nalt performan (HPLC) ofer performane analitice similare,
cu condiia unei purificri riguroase a probei. Obiectivul acestui studiu a fost
acela de a determina incidena contaminrii cu deoxinivalenol a furajelor
administrate animalelor din loturile experimentale ale laboratorului i
determinarea gradului de transmitere a acestuia n snge la ovine n
condiiile unei intoxicaii acute sau cronice.
MATERIALUL I METODA DE CERCETARE
Metode de analiz
Experienele s-au desfurat la I.C.D.C.O.C. Palas-Constana, n perioada
2007-2008, n baza unui proiect CEEX, finanat de la buget iar instituia
conductoare, care a i asigurat furajul contaminat, a fost I.N.C.D.A.
Fundulea. Furajul a fost contaminat artificial prin injectarea fnului de
lucern sub form de baloi nfoliai cu filtratul de cultur al cipercii
Fusarium medicaginis (un litru de filtrat/ balot de 20 kg), iar furajul de

triticale a fost infestat artificial cu miceliu de Fusarium graminearum


furnizat de Institutul de CercetareDezvoltare pentru Protecia Plantelor i
Dezvoltare Rural - Bucureti (izolatul
a fost crescut pe mediu din semine de triticale, n flacoane de 500 g). Pentru
realizarea intoxicaiei cronice, fiecare animal (n=30) a primit pe timpul
iernii, zilnic, timp de 4 luni, 0,5 kg din amestecul mcinat de cereale i
lucern. n intoxicaia acut, animalele (n=20) au primit 0,5 kg/zi, timp de
10 zile, amestec de cereale i lucern contaminate cu o concentraie mai
mare de ciuperci din genul Fusarium. Determinarea deoxinivalenolului din
furaje i ser s-a fcut prin metoda cromatografiei de lichide de nalt
performan (HPLC) - detecie n UV (detector PDA), cu purificare pe
coloana de imunoafinitate i prin tehnica ELISA. Analizele cromatografice
au fost efectuate la Universitatea Napoli, Dipartimento di Scienza degli
Alimenti, laborator condus de prof. univ. dr. Alberto Ritieni, iar analizele de
imunochimie s-au realizat n cadrul Laboratorului de Imunologie din
I.C.D.C.O.C. Palas-Constana.
Probe de ser. Probele de ser au fost recoltate de la cele dou loturi de cite
30, respectiv, 20 ovine din rasa Merinos de Palas, la terminarea perioadei de
administrare a furajului contaminat, de 4 luni, respectiv, 10 zile. Lotul a fost
constituit din animale apropiate ca vrst i greutate corporal (42 2 kg).
De la fiecare animal au fost colectate probe de snge integral. Ulterior
sngele a fost incubat timp de dou ore la 37oC i centrifugat timp de 10
min. la 3000 rpm pentru obinerea serului utilizat pentru determinarea
micotoxinei.
Reactivi. Standardul de deoxinivalenol provine de la firma R-Biopharm
Rhone LTD. Pudra a fost reconstituit ntr-o soluie de acetonitril care a fost
conservat la 20oC pn la prepararea standardelor de lucru. Solvenii

folosii pentru extracie i ca faz mobil (apa distilat, metanol, acetonitril)


au puritate grad HPLC. Enzima folosit n procesul de extracie a
deoxinivalenolului din ser este -glucuronidaza arilsulfataza extras din
Helix pomatia. Pentru determinarea micotoxinei din furaje i ser prin tehnica
ELISA s-au
folosit truse DON RIDASCREEN.
Metoda HPLC pentru determinarea deoxinivalenolului din concentratul
de cereale
Extracia micotoxinei s-a efectuat prin omogenizarea a 25 g amestec
contaminat mcinat n 200 ml ap distilat i agitare timp de 30 min. la
temperature camerei. Imediat dup terminarea agitrii, cel puin 20 ml din
extract s-a filtrate prin hrtie de filtru Whatman nr. 113. Pentru purificarea
probelor s-au folosit coloane de imunoafinitate DONPREP. S-a utilizat
procesul de backflushing (inversarea fluxului eluanilor pentru completa
denaturare a anticorpilor) de 3 ori i apoi s-a trecut aer prin coloan. Proba
purificat, recuperat n metanol, a fost evaporat la sec sub un current de
azot. Ulterior aceasta a fost reluat n 1,0 ml faz mobil i amestecat
viguros timp de 30 sec. folosind un vortex. Aceast etap are rolul att de a
concentra proba, innd cont de cantitile mici de analit, ct i pentru a
obine rezultate reproductibile, prin reluarea ntr-un volum fix de faz
mobil. Din prob s-a injectat n sistemul HPLC un volum de 100 l.
Condiii cromatografice
Faza mobil a fost constituit dintr-un amestec ap : metanol : acetonitril (94
: 3 : 3 v/v/v); eluia s-a realizat timp de 15 minute la un debit de 1,0 ml/min.
la temperatura coloanei de 30oC.

Pregtirea standardelor i pregtirea curbei standard. Pudra cristalin de


DON se reconstituie cu 10 ml acetonitril 100% pentru a obine o soluie stoc
cu concentraia de 100 g/ml DON. Din aceasta s-au preparat soluii seriate
n faza mobil (10 g/ml, 5 g/ml, 2 g/ml, 1 g/ml, 0,5 g/ml) i s-a
injectat 100 l din fiecare soluie seriat de standard n sistemul HPLC.
Metoda HPLC pentru determinarea deoxinivalenolului din serul ovin
Extracia deoxinivalenolului din probele de ser s-a fcut dup metoda
descris de L a n g (2006). Probe de 2,0 ml de ser au fost incubate peste
noapte, la temperatura camerei, cu cte 3,0 ml tampon fosfat (pH 6,8) i 80
l - glucuronidaza arilsulfataza extras din Helix pomatia. Cei 5,0 ml de
ser, incubai, au fost purificai ulterior prin coloane de imunoafinitate
DONPREP. Principiul de purificare este acelai ca pentru probele de cereale,
difer doar solvenii folosii. Coloanele de imunoafinitate au fost splate o
dat cu 14,0 ml PBS i de dou ori cu cte 2,0 ml ap distilat. Eluia s-a
fcut cu 2,0 x 2,0 ml metanol. Probele obinute s-au concentrat la sec sub
azot i au fost reconstituite n 150 l faza mobil (aceeai ca pentru probele
de cereale), n vederea analizei HPLC. Condiiile cromatografice au rmas
aceleai: s-a injectat cte 100 l din fiecare prob; debitul a fost de 1,0
ml/min. Eluia s-a realizat timp de 15 minute, iar deoxinivalenolul a fost
detectat la 218 nm.
REZULTATE I DISCUII
1. Intoxicaia cronic
Rezultatele determinrilor concentraiei de DON din probele de furaje.
Analiza serului sangvin poate da informaii preioase privind expunerea la
diferite concentraii de micotoxine. Probele biologice, de genul serului, sunt

matrici complexe, n care un numr mare de produi pot interfera n analiza


micotoxinelor i prezint avantajul c pot fi colectate fr mari eforturi.
Metoda HPLC pentru determinarea micotoxinei DON din diferite matrice
este o metod cantitativ, de referin, care confer o acuratee sporit
analizelor, ns necesit o purificare riguroas a probelor. Purificarea se
poate face
prin mai multe metode, ns metoda cea mai folosit n prezent este
purificarea prin coloane de imunoafinitate (IAC) (K r s k a i W e l z i g,
2001). Prin purificarea probelor cu ajutorul coloanelor de imunoafinitate se
mbuntesc att selectivitatea, ct i sensibilitatea metodei. Acest lucru
permite o mai bun detecie a micotoxinei, chiar i atunci cnd aceasta se
afl n cantiti foarte mici, de genul probelor de ser, i elimin interferenele
legate de produii acetilai ai deoxinivalenolului (3-AcDON i 15-Ac-DON).
Coloanele de imunoafinitate conin un anticorp monoclonal specific pentru
DON care poate purifica DON-ul din probe. DON-ul prezent n prob se
leag de anticorpul din coloan, care este apoi spalat pentru ndepartarea
interferenelor; toxina este eliberat ulterior prin eluare cu metanol. Dei
extracia din cereale sau alte produse derivate este mai eficient n cazul
folosirii unui amestec de ap i acetonitril (B e n n e t t i K l i c h, 2003; K r
s k a i W e l z i g, 2001), n cazul nostru extracia deoxinivalenolului din
probele de amestec de furaj s-a fcut numai n ap datorit purificrii
ulterioare a extractelor prin coloane de imunoafinitate. n cazul purificrii
prin coloane de imunoafinitate se pot folosi numai extracte obinute n ap,
solvenii organici denaturnd anticorpii. Micotoxina DON a fost detectat la
lungimea de und de 218 nm, avnd timpul de retenie n condiiile date de
7,5 min. Cuantificarea DON-ul s-a fcut prin compararea ariei picurilor
probei cu cele ale standardelor, cu ajutorul softului de achiziie i prelucrarea

datelor Chromeleon (Dionex). Curba de calibrare pentru detecia


deoxinivalenolului din furaje (figura 1) este dreapt i pornete din origine;
coeficientul de linearitate obinut a fost de 0,996.

Fig. 1 Curba de calibrare pentru deoxinivalenol


(Calibration curve of the deoxynivalenol)

Fig. 2 Cromatograma DON furaj contaminat


(DON chromatogram contaminated forage)

Concentraia medie nregistrat a fost de 41,54 micrograme/kg, cu variaii


cuprinse ntre 41,11 i 41,86 micrograme/kg (tabelul 1), n amestecul 1
(HPLC) i 3,45 mg, cu limite ntre 3,11-3,75 n amestecul 2 (ELISA); LD
fiind de 18,5 mg.

Tabelul 1

Concentraie de DON nregistrat n probele de furaje


(DON concentration from the forage samples)
Nr.
Crt.
1.
2.
3.
4.
5.
Medie

Concentratie DON
Amestec 1 ( HPLC)
Amestec 2 ( ELISA)
g/kg
41,86
41,52
41,68
41,11
41,56
41,55

g/kg
3,11
3,21
3,52
3,65
3,75
3,45

Probele de furaj administrate n cazul intoxicaiei acute au avut o


concentraie medie de DON, analizat prin tehnica ELISA, de 3,45 mg/kg
(tabelul 1). Concentraia de DON nu depeste norma legal admis (1250
g/kg pentru cereale neprocesate) stabilite de Comisia UE (Comisia Codex
Alimentarius) (tabelul 2) pentru gradul de contaminare cu deoxinivalenol n
cazul amestecului utilizat n inducereea intoxicaiei cronice, dar l depete
n cazul furajelor administrate n intoxicaia acut.

Tabelul 2

Limitele maxime stabilite de Uniunea European privind concentraia DON


din diferite matrice

(Maxim limits fixed by the European Union regarding DON concentrations in different
matrices
Produs

Nivel maxim
(g/kg)

Cereale neprocesate, altele decat graul, ovaz si porumb


Grau, ovaz, porumb neprocesate
Porumb neprocesat
Faina de cereale incluzand si malai
Paine, biscuiti, cereale pentru mic dejun
Paste fainoase
Cereale procesate pentru hrana sugarilor si copiilor mici

1250
1750
1750
750
500
750
200

Rezultatele determinrilor concentraiei de DON din probele de ser


Pentru extracia deoxinivalenolului din ser s-au incubat mai nti probele cu
enzima -glucuronidaza arilsulfataza extras din Helix pomatia, deoarece la
rumegtoare principalul metabolit n plasm este conjugatul glucuronidat (P
r e l u s k y i colab., 1986, 1987, 1997). Prezena metaboliilor glucuronidai
a fost pus n eviden prin creterea ratei de recuperare a DON dup
tratamentul cu -glucuronidaza arilsulfataza. Studiile au aratat c dup
administrarea oral a deoxinivalenolului proporia de DON glucuronid
conjugat n plasm este de 73% (P r e l u s k y i colab., 1986). Dei studiile
arat c glucuronid DON este mai puin toxic, timpul su de injumtire
este mai mare comparativ cu cel al DON-ului liber. Analiza cromatografic a
tuturor probelor de ser recoltate de la animalele supuse intoxicaiei cronice a
condus la obinerea unor rezultate nesemnificative de intoxicare, la toate
animalele din experien, care ar putea fi explicate prin cantitatea mic
ingerat, sub limita dozei zilnice tolerate (TDI); menionm c pentru DON
doza minim este de 1,0 g/kg greutate corporal. Este important s lum n
calcul i faptul c rumegatoarele, comparativ cu animalele monogastrice,
sunt mai rezistente la aciunea majoritaii micotoxinelor, fapt datorat

probabil, unei detoxificri la nivel ruminal. n cazul animalelor intoxicate


timp de 10 zile cu un furaj cu o concentraie crescut de DON, analiza
serurilor recoltate la sfritul perioadei de contaminare a demonstrat trecerea
deoxinivalenolului n snge la un numr de 10 animale, ntr-o concentraie
medie de 37,10 g/ l (tabelul 3).
Tabelul 3

Concentraia de DON din ser (tehnica ELISA)


[DON concentration from serum (method ELISA)]
Nr.

Concentratie DON

Crt.

g/l

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Medie

11
35
74
34
25
46
15
63
55
13
37,10

CONCLUZII
Gradul de contaminare cu deoxinivalenol a amestecului de furaj nu a fost
foarte mare (41,54 g/kg ) n condiiile primului amestec testat.
Administrarea de durat (4 luni) a unei raii de 0,5 kg din acest amestec
(cantitatea medie de DON ingerat a fost de 500 ng/kg greutate corporal) la
ovine nu conduce la detectarea n ser a acestei micotoxine.

Absena deoxinivalenolului din probele de ser semnific faptul c la


aceast concentraie, acesta este fie eliminat rapid, fie transformat n ali
produi de metabolism.
Administrarea unui furaj cu o cantitate de DON crescut (3,45 mg/kg) a
condus la trecerea acestuia n snge n proporie de 50%, prezena
micotoxinei n ser avnd valoarea medie de 37,1 g/l.
La rumegtoare s-au realizat mai puine studii cu privire la efectul
tricotecenelor, iar rezultatele sunt destul de contradictorii. Ca urmare,
studiile ulterioare trebuie s determine dac la alte concentraii de DON are
loc transmiterea acestuia n ser.