METODE ANALISIS BIOTIN, ASAM PANTOTENAT, ASAM

FOLAT, DAN VITAMIN B12 SERTA KETERSEDIAAN

HAYATI FOLAT

Diana Agustini Raharja

Dwi Rakhmawati
Feni Ayudia
Ismail Maqqi
Regina Bhakti

J3L112168
J3L112143
J3L212192
J3L112044
J3L112161

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
1 STRUKTUR DAN SIFAT UMUM
2 ANALISIS KUANTITATIF SENYAWA MIRIP VITAMIN DAN
KETERSEDIAAN HAYATI FOLAT
2.1 Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode Biospesifik
2.1.1 Analisis Biotin
2.1.2 Asam Pantotenat
2.1.3 Analisis Asam Folat
2.1.3.1 Perbandingan Metode Analisis Asam Folat
2.1.3.2 Ketersediaan Hayati Folat
2.1.4 Vitamin B12
2.2 Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode Biosensor
3 SIMPULAN
4 DAFTAR PUSTAKA

i
1
3
3
3
5
6
6
7
9
10
12
12

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Struktur asam folat
Gambar 2 Struktur asam pantotenat
Gambar 3 Struktur vitamin B12
Gambar 4 Struktur biotin
Gambar 5 Mekanisme metode ELISA
Gambar 6 Mekanisme metode EPBA

1
2
2
3
4
4

DAFTAR TABEL
Tabel 1 Perbedaan format ELISA dalam penentuan analog asam pantotenat
Tabel 2 Hasil kandungan asam pantotenat dalam makanan
Tabel 3 Perbandingan metode ELISA dan uji mikrobiologis
Tabel 4 Hasil analisis folat dalam kubis brussel

5
6
6
7

1 STRUKTUR DAN SIFAT UMUM

Bentuk alami utama folat (Gambar 1) dalam bahan-bahan dari sumber
tanaman, hewan, dan mikrob ialah spesies poliglutamil dari 5,6,7,8-tetrahidrofolat
(folatH4). Sebagian besar folat yang terdapat secara alami dalam jaringan tanaman
dan hewan, serta dalam bahan pangan yang berasal dari sumber tanaman dan
hewan, memiliki sebuah rantai samping dari 5 sampai 7 residu glutamat dengan
tautan -peptida umumnya diasumsikan bahwa kira-kira 80% folat bahan pangan
berada dalam bentuk poliglutamin. Semua folat, terlepas dari tingkat organisasi
sistem cincin pteridina, substituen satu-karbon N5 atau N10, atau panjang rantai
poliglutaminnya, menambahkan aktivitas vitamin pada mamalia, termasuk
manusia. Analog folat dengan sebuat gugus 4-amino atau modifikasi lainnya
sering menjadi antagonis yang potensial untuk digunakan dalam kemoterapi,
untuk penyakit kanker dan penyakit autoimun.
HO

N
O

H
OH
OH

N
H

Gambar 1 Struktur asam folat

Asam pantotenat (Gambar 2) termasuk ke dalam vitamin larut air yang
terdiri atas -alanina dalam tautan amida dengan asam 2,4-dihidroksi-3,3dimetilbutirat. Asam pantotenat umumnya terkandung dalam daging, bebijian,
telur, susu, dan berbagai sayuran segar. Asam pantotenat umumnya terdapat
dalam bahan pangan dan bahan hayati dalam bentuk koenzim A yang sebagian
besar berupa turunan tioester. Tioester yang terbentuk dari turunan koenzim A
dengan asam-asam organik akan mempermudah proses metabolik terutama dalam
proses penyingkiran dan penambahan gugus asil dalam reaksi biosintetik dan
katabolik. Asam pantotenat sebagai suatu komponen dari koenzim A dan sebagai
suatu gugus prostetik yang terikat secara kovalen dari protein pembawa asil dalam
sintetis asam lemak secara metabolik. Kalsium pantotenat merupakan kristal putih
yang lebih stabil dan kurang higroskopis daripada asam bebasnya dan merupakan
bentuk sintetik yang digunakan dalam fortifikasi bahan pangan dan suplemen
vitamin.
Asam pantotenat stabil dalam pH 5-7 dan menunjukkan stabilitas relatif
dalam bahan pangan yang penyimpanannya rendah air. Asam pantotenat dalam
bahan pangan berkurang kadarnya diakibatkan oleh proses termal dan pemasakan.
Hilangnya asam pantotenat umumnya disebabkan oleh pelepasan, bukan
destruksi. Asam pantotenat dapat diuji dengan berbagai metode seperti uji
mikrobiologis menggunakan Lactobacillus plantarum atau radioimunologi (RIA).

Penentuan asam pantotenat sebagai vitamin larut air dapat pula dilakukan dengan
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), metode reaksi enzim
dalam kapiler, analisis elektrokimia, dan enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA).
OH

OH
CH3

CH3

H
O

OH

Gambar 2 Struktur asam pantotenat

Vitamin B12 (Gambar 3) memiliki aktivitas vitamin serupa dengan
sianokobalamin. Sianokobalamin digunakan dalam fortifikasi bahan pangan dan
asupan nutrisi yang memiliki stabilitas tinggi dan mudah diperoleh secara
komersial. Mekanisme penguraian vitamin B12 belum seluruhnya ditentukan,
sebagian dikarenakan komplesitas molekul dan konsentrasi yang sangat rendah
dalam bahan pangan. Penguraian fotokimia koenzim vitamin B12 menghasilkan
akuokobalamin. Reaksi ini berpengaruh terhadap metabolisme dan fungsi vitamin
B12, tetapi tidak berpengaruh pada aktivitas vitamin B12 total dari bahan pangan
karena akuokobalamin mempertahankan aktivitas vitamin B12. Stabilitas
keseluruhan vitamin B12 paling tinggi pada pH 4-7.
O

H2N

H2N

H2N

Co
N

O
NH2H C
3

CH3
CH3

CH3

O
NH
O
N
O
P
O HO N
O
H
H
H
HO

NH2

H3C
H3C

H3C

CH3

H3C

NH2
CH3
CH3

Gambar 3 Struktur vitamin B12

Biotin (Gambar 4) merupakan vitamin bisiklik larut air yang berfungsi
secara koenzimatis pada reaksi karboksilasi dan transkarboksilasi. Bentuk alami
biotin ialah D-biotin bebas dan biositin. Biositin berfungsi sebagai bentuk
koenzim dan terdiri atas residu lisina terbiotinilasi yang tergabung secara kovalen
pada rantai protein dari berbagai karboksilase. Biotin bebas maupun biositin
terikat protein menunjukkan aktivitas vitamin ketika dikonsumsi dalam makanan.
Biotin stabil pada panas, cahaya dan oksigen. Nilai pH yang terlalu tinggi atau
rendah dapat menyebabkan penguraian karena biotin mendorong hidrolisis ikatan
amida dari sistem cincin biotin.

O
HN

NH
H

(CH 2)4-COOH
S
Gambar 4 Struktur biotin

Biotin dalam makanan nampaknya telah terpenuhi jumlahnya, sehingga

ketersedian hayati yang tidak sempurna biasanya tidak terlalu berpengaruh pada
nilai gizi. Sintesis biotin oleh bakteri pada usus halus memberikan sumber biotin
tambahan yang tersedia untuk manusia. Kebanyakan biotin dalam bahan pangan
berbentuk biositin terikat protein. Bentuk terikat ini akan dilepaskan oleh
biotinidase dalam cairan pankreas dan dalam mukosa usus menjadi bentuk bebas
yang aktif secara fungsional.

ANALISIS KUANTITATIF SENYAWA MIRIP VITAMIN

DAN KETERSEDIAAN HAYATI FOLAT
2.1 Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode Biospesifik

2.1.1

Analisis Biotin

Penentuan biotin dalam makanan dan bahan hayati biasanya dilakukan

dengan uji mikrobiologis dengan Lactobacillus plantarum atau dengan metode
pengikatan ligan yang melibatkan avidin sebagai protein pengikat. Uji
mikrobiologis dan pengikatan ligan merespon biotin bebas dan biositin, tetapi
biositin tidak dapat ditentukan tanpa dilepaskan terlebih dahulu dari protein
dengan pembelahan ikatan peptida oleh hidrolisis asam atau enzimatik. Terdapat
uji enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) dan enzyme protein binding
assay (EPBA) yang telah dikembangkan untuk analisis biotin dalam makanan.
Metode ELISA menggunakan reagen yang stabil dan tak reaktif yang dapat
disimpan lama. Jenis uji seperti ini telah banyak digunakan untuk analisis
makanan. Uji ini dilakukan dengan peralatan yang murah. Jenis sistem ELISA
yang sering digunakan untuk vitamin ialah sistem tidak langsung, yang mana
konjugat protein-vitamin (hapten) yang bergerak ke permukaan. Dalam sistem
tidak langsung pertama-tama antibodi primer dan vitamin bebas ditambahkan ke
dalam sumur-sumur pada pelat mikrotitrasi. Antibodi akan terdistribusi diantara
vitamin dan vitamin termobilisasi. Kemudian sumur dibilas, antibodi ikatan
primer dideteksi dengan penambahan enzim antibodi kedua. Setelah diinkubasi
pada waktu tertentu molekul yang tidak berikatan dibilas dan substrat
ditambahkan. Enzim antibodi kedua akan mengubah substrat menjadi produk

yang kemudian diwarnai. Densitas optik akan ditentukan setelah beberapa waktu
dan sampel akan dikuantifikasi dengan merujuk pada kurva standar.
Penggunaan antibodi pada EPBA digantikan oleh enzim-protein, protein
pengikat ditandai langsung dengan manautkan secara kimia suatu enzim. Dengan
demikian metode EPBA dalam tahap inkubasi lebih sedikit dibandingkan dengan
metode ELISA.

Gambar 5 Mekanisme metode ELISA

Gambar 6 Mekanisme metode EPBA

Hasil uji mikrobiologis pada pengujian biotin menggunakan Lactobacillus
plantarum menunjukkan respons yang baik, biotin D-sulfoksida (100%) dan D,Loksibiotin (50%). Meskipun metode RIA memberikan hasil yang dapat diterima
dengan uji mikrobiologis untuk penentuan kandungan biotin dalam sampel
makanan hewan, hasil yang diperoleh dari metode radioimunologi (RIA) 20-50%
lebih tinggi dibandingkan dengan uji mikrobiologis pada sampel gandum. Uji ini
sensitif untuk menganalisis 1-10 ng biotin, tetapi penerapannya untuk penentuan
biotin dalam makanan masih terbatas dan tidak pasti. Antibodi telah diproduksi
pada uji EPBA untuk biotin menggunakan sintetsis konjugat biotin-albumin

serum anak sapi (BSA) melalui gugus asam karboksilat pada sisi rantai.. Antibodi
ini sangat spesifik untuk D-biotin, dan tidak menunjukkan reaktivitas-silang. Uji
EPBA lebih sensitif dibandingkan dengan uji ELISA. Uji EPBA menghasilkan
batas deteksi 10 g per sumur sedangkan uji ELISA hanya menghasilkan batas
deteksi 500 g per sumur. Uji EPBA memiliki spesifisitas yang luas dan
mengenali analog biotin lainnya dibandingkan dengan uji mikrobiologis
menggunakan L. plantarum. EPBA telah digunakan untuk menentukan kandungan
biotin dalam hati anak domba dan hasilnya baik.
2.1.2 Asam Pantotenat
Asam pantotenat dalam bahan pangan umumnya terdapat dalam bentuk
bebas dan sebagian besar berikatan sebagai koenzim A dan berbagai turunan
protein. Penentuan asam pantotenat dalam penelitian sebelumnya telah banyak
menggunakan metode mikrobiologis. Pengembangan metode dalam penentuan
asam pantotenat yang lebih tepat dan spesifik dilakukan untuk menentukan kadar
asam pantotenat dalam makanan. Metode yang digunakan dalam penentuan kadar
asam pantotenat dalam bahan pangan antara lain ELISA, mikrobiologis, KCKT,
dan teknologi biosensor.
Metode ELISA-taklangsung dikembangkan untuk analisis bahan pangan.
Asam pantotenat dan imunogen albumin serum anak sapi (BSA) dikonjugasikan
melalui dua cara. Cara pertama, alkohol 1 diderivatisasi dengan menggunakan
bromoasetil bromida. Turunan bromoasetil dari asam pantotenat kemudian
direaksikan dengan protein tereduksi dan terdenaturasi. Cara kedua, asam
pantotenat ditautkan dengan BSA melalui gugus asam karboksilat dengan
manggunakan prosedur anhidrida campuran. Antiserum yang digunakan ialah
bromoasetil bromida (BA) dan anhidrida campuran (MA). Tabel 1 menunjukkan
perbedaan hasil dari kedua antiserum, serum bromoasetil spesifik untuk penentuan
asam pantotenat dengan reaktivitas silang rendah untuk komponen yang diuji.
Berbeda dengan BA, antibodi meningkat dengan pemasangan pada molekul ujung
melalui asam karboksilat. Hasil menunjukkan penentuan yang baik untuk
panteteina dan pantotenol. Kedua antiserum gagal untuk mengindentifikasi
koenzim A, diperkirakan karena mengandung turunan asam pantotenat pada setiap
ujung molekul.
Tabel 1 Perbedaan format ELISA dalam penentuan analog asam pantotenat
Jenis
Pengenceran Fase padat (PA-KLH)
Limit deteksi
Komponen
antiserum
(v:v)
(g mL-1)
(g per sumur)
Asam
BA
1:4000
0.1
500
pantotenat
Asam
MA
1:10000
1.0
5000
pantotenat
Panteteina
MA
1:10000
1.0
5
Pantenol
MA
1:10000
1.0
50
Tabel 2 menunjukkan hasil penentuan asam pantotenat dengan metode
ELISA lebih baik dibandingkan dengan uji mikrobiologis. Uji ELISA

menghasilkan nilai yang mendekati hasil literatur dibandingkan dengan metode

mikrobiologis. Penentuan asam pantotenat dengan metode ELISA menggunakan
antobodi aktif yang spesifik untuk vitamin yang berikatan kovalen dengan enzim
fosfatase basa. Penetuan asam pantotenat dengan uji mikrobiologis menggunakan
L. plantarum. Hasil yang ditunjukkan dengan menggunakan metode
mikrobiologis memiliki perbedaan yang signifikan dengan hasil yang ditunjukkan
oleh literatur sehingga hasil yang diperoleh kurang baik dibandingkan dengan
metode ELISA.
Tabel 2 Hasil kandungan asam pantotenat dalam makanan
Makanan

ELISA
(mg per 100 g)

Uji mikrobiologis
(mg per 100 g)

Susu
Kentang
Roti
Telur
Hati
Selada

0.36
0.23
0.23
1.74
8.25
0.18

0.28
0.23
0.23
1.46
8.65
0.07

Kandungan
pantotenat
literatur
(mg per 100 g)
0.35
0.30
0.30
1.80
8.20
0.20

Tabel 3 menunjukkan perbandingan antara metode ELISA dan metode

mikrobiologis dari berbagai segi. Metode ELISA lebih menguntungkan
dibandingkan uji mikrobiologis dengan hasil yang lebih teliti serta sensitivitas
dan akurasi yang baik.
Tabel 3 Perbandingan metode ELISA dan uji mikrobiologis
Metode
ELISA
Uji mikrobiologis
Autoklaf,
Inkubator, piring
Peralatan
spektrofotometer,
mikrotitrasi
inkubator
Antiserum (primer dan
Organisme, kultur, kaldu
Reagen
sekunder)
mikroinokulum, media
Reagen lebih murah tetapi
Biaya
Reagen lebih murah
biaya tenaga kerja mahal
Persiapan uji (jam)
2
7
Lamanya uji (jam)
4
24-36
2.1.3 Analisis Asam Folat
2.1.3.1 Perbandingan Metode Analisis Asam Folat
Analisis folat dapat dilakukan dengan berbagai metode, yaitu metode
KCKT, RIA, EPBA, dan uji mikrobiologis. Metode KCKT menggunakan deteksi
ultraviolet (UV) dan fluorometri untuk melakukan analisis folat yang terkandung
dalam makanan. Metode KCKT memiliki kekurangan, yaitu akan sulit untuk
mendeteksi kadar vitamin dalam konsentrasi rendah yang terdapat dalam

makanan, sehingga dapat pula dilakukan analisis dengan metode EPBA dengan
memanfaatkan protein pengikat folat berlabel enzim dari susu sapi. Asam folat
mewakili kelompok penting vitamin kelompok B. Prosedur yang paling banyak
digunakan dan diterima untuk mendeteksi folat dalam makanan ialah uji
mikrobiologis menggunakan Lactobaacillus rhamnosus dan Enterococcus hirae.
Tingkat folat rendah yang ditemukan dalam sebagian besar makanan dapat
menyebabkan masalah dalam deteksi dan kuantifikasi vitamin menggunakan
metode KCKT UV dan deteksi fluorometrik. Uji mikrobiologis dalam analisis
folat menunjukkan hasil yang cukup memuaskan dibandingkan dengan metode
KCKT. Beberapa literatur dalam analisis folat menggunakan metode RIA yang
dibandingkan dengan uji mikrobiologis, didapatkan bahwa antara metode RIA dan
uji mikrobiologis sering bertentangan. Faktor yang mempengaruhi afinitas folat
pengikat protein ialah suhu, waktu inkubasi dan pH. Asam pteroilglutamat lebih
stabil dibandingkan dengan 5-metil tetrahidrofuran (THF), pada pH yang lebih
tinggi dari 9.3, PGA akan lebih stabil dibandingkan 5-metil tetrahidrofuran
(THF), sebagai alternatif EPBA dikembangkan untuk folat yang mengikat protein
dari susu sapi.
Tabel 4 Hasil analisis folat dalam kubis brussel
Metode
Uji mikrobiologis
EPBA
RPBA
KCKT

Enzim dekonjugasi
Plasma manusia
Plasma ayam
Plasma manusia
Plasma ayam
Plasma manusia
Plasma ayam
Plasma manusia
Plasma ayam

Rerata kandungan
Folat (g per 100
gram)
824
984
739
320
93
290
762
729

Berdasarkan data pada Tabel 4 menunjukkan bahwa metode yang paling

baik untuk analisis folat adalah metode uji mikrobiologis, karena dari keempat
metode tersebut kandungan folat yang paling besar ditunjukkan pada uji
mikrobiologis, yaitu sebesar 824 g per 100 gram pada plasma manusia dan 984
g per 100 gram pada plasma ayam.
2.1.3.2 Ketersediaan Hayati Folat
Nilai nutrisi vitamin dalam bahan pangan bergantung pada konsentrasi total
bentuk vitamin yang secara hayati aktif dan ketersediaannya untuk diserap dan
digunakan dalam jalur metabolisme. Metode penentuan ketersediaan vitamin folat
pada awalnya menggunakan hewan percobaan anak ayam, namun percobaan
dengan menggunakan hewan mamalia seperti tikus lebih cocok digunakan untuk
menentukan ketersediaan folat dalam makanan manusia. Akan tetapi, kedua
metode tersebut memiliki kekurangan, yaitu memerlukan banyak hewan uji dan
menggunakan teknik uji mikrobiologis yang lama. Ketersediaan hayati folat

dalam penelitian diukur dengan hewan uji tikus Wistar jantan yang pertama-tama
dimiskinkan terlebih dahulu folatnya dengan pemberian pakan semisintetik bebasfolat (FFS) dan air secara ad libitum, yaitu pemberian air kepada tikus sampai
pada saat tikus dalam kondisi tidak mau lagi minum meski minuman di sekitarnya
masih ada. Sukrosa dan kasein merupakan 2 komponen utama dalam FFS.
Tikus kemudian diberikan makan lagi dengan menggunakan suplemen folat
yang mengandung asam pteroilglutamat atau kubis yang dikering-bekukan yang
digabungkan ke dalam pakan semisintetik untuk mengukur peningkatan pada folat
jaringan. Semua pakan disimpan dalam kantong politena hitam pada suhu -40 C
tersebih dahulu sebelum digunakan, karena folat dalam pakan stabil pada suhu
tersebut, akan tetapi kandungan folat akan berkurang ketika berada di kandang
hewan percobaan. Oleh karena itu, pakan suplemen asam pteroilglutamat
dianalisis pada awal dan akhir waktu pemberian makanan selama 7 hari.
Uji mikrobiologis ketersediaan folat dalam makanan dilakukan dengan cara
sampel pakan dihomogenkan dengan bufer asam askorbat, dididihkan,
didinginkan, disentrifugasi, kemudian supernatan disimpan pada suhu -20 C
sebelum digunakan untuk pengujian. Ekstrak ditambahkan dengan enzim
dekonjugase ginjal babi untuk memotong poliglutamat folat. Kandungan total
folat pada ekstrak pakan ditentukan berdasarkan respons pertumbuhan
Lactobacillus casei. Medium pertumbuhan kasein asam folat ditambahkan dengan
asam askorbat, kemudian diinkubasi. Kurva kalibrasi dibuat dari asam
pteroilglutamat dengan berbagai konsentrasi. Pertumbuhan L. casei diukur dengan
menggunakan nefelometer EEL.
Tikus yang telah memasuki waktu akhir pemberian makanan kembali
dengan suplemen folat dibius dengan injeksi pada rongga perut menggunakan
natrium barbiturat dan dibunuh dengan irisan pada bagian perut tengah, kemudian
sampel darah diambil dari vena kava. Hati tikus dibilas dengan larutan salin
fisiologis beku-dingin, kemudian dipotong menjadi potongan kecil. Usus halus
diambil, dibilas dengan salin, celah usus dibuka dan mukosa digoreskan dari
bagian jejunum dengan menggunakan kaca preparat. Sampel hati dan mukosa
usus disimpan dalam cairan nitrogen. Sampel serum yang diperoleh dari
sentrifugasi disimpan pula dalam cairan nitrogen sebelum dianalisis. Ketersediaan
folat pada sumber makanan diukur dengan cara menghitung folat yang
dikonsumsi oleh tikus dan membandingkan kenaikan folat serumnya pada pakan
yang mengandung kubis mentah dengan pakan yang mengandung asam
pteroilglutamat.
Ekstraksi sampel jaringan dilakukan dengan cara bagian hati atau mukosa
jejunum dihomogenkan dengan larutan asam askorbat, dididihkan, didinginkan,
disentrifugasi, supernatan ditampung, kemudian pelet diekstraksi ulang.
Supernatan digabungkan, kemudian diencerkan seperlunya untuk dianalisis
dengan menggunakan radioimmunoassay (RIA). Pengujian folat serum dan folat
jaringan dilakukan dengan menggunakan kit RIA berdasarkan pengikatan protein
secara kompetitif. Sampel serum diencerkan dengan menggunakan larutan asam
askorbat, dipanaskan dalam kondisi gelap yang bertujuan menghancurkan
endogen folat-pengikat protein. Setelah didinginkan, folat-pengikat protein
berlabel-[125I] ditambahkan baik ke dalam sampel serum maupun standar asam
folat, kemudian larutan diinkubasi dalam larutan bufer pH 9.3 pada kondisi gelap
dan pada suhu ruangan. Folat terikat dan folat bebas dipisahkan dengan

menggunakan dekstran-berlapis arang dan diikuti dengan sentrifugasi. Supernatan

didekantasi dan dicacah dengan alat cacah kelipan gama Philips PW4750.
Hasil yang diperoleh ketika hewan diberi makan kembali dengan suplemen
folat, yaitu terjadinya peningkatan konsentrasi folat jaringan yang mencerminkan
jumlah folat dalam pakan. Peningkatan folat serum mencerminkan konsentrasi
asam pteroilglutamat yang lebih tinggi dengan jumlah yang sama dengan pakan
yang dikonsumsi. Tikus yang sebelumnya dimiskinkan folatnya, kemudian diberi
makan kembali dengan suplemen kubis. Suplementasi kubis lebih rendah diterima
dengan baik oleh hewan uji dan tidak banyak berpengaruh pada asupan pakan atau
pertambahan bobot, sebaliknya pada pemberian kubis yang lebih tinggi, hewan uji
berkurang nafsu makannya. Akan tetapi, kedua kelompok perlakuan pakan kubis
tersebut sama-sama menghasilkan kadar folat serum yang lebih tinggi daripada
kontrol, kira-kira sebanding dengan kubis yang diberikan.
Respons cadangan folat tersebut pada pemberian pakan kembali dengan
jumlah folat tertentu digunakan sebagai cara mengukur pengambilan dan
pemanfaatan vitamin tersebut oleh hewan uji. Kisaran respons terlebar didapat
pada folat serum, yang juga lebih mudah diukur dengan menggunakan RIA.
Pengujian jaringan padat terbukti lebih rumit antara lain karena lebih kompleks,
rentan memberikan hasil yang tidak akurat, proses pembedahan memerlukan
waktu yang banyak, serta hati dan mukosa usus memiliki kemungkinan besar
terkontaminasi dengan darah. Hal terakhir ini dapat berperan pada tidak
konsistennya respons folat hati pada asupan makanan.
Salah satu kesulitan utama dalam uji ketersediaan hayati vitamin ini ialah
penggabungan makanan manusia ke dalam pakan hewan pada jumlah yang tepat
dan memiliki nilai yang cukup tinggi agar dapat diukur. Pemberian pakan kubis
yang dikering-bekukan tampaknya mengatasi masalah ini. Kadar folat serum
meningkat secara signifikan, bahkan pada penambahan yang relatif sedikit.
Aktivitas enzim asam pteroilglutamat (PGA) hidrolase dalam sitoplasma sel
mukosa usus halus hewan uji agaknya berperan dalam mengurai bentuk
poliglutamat dari folat dalam pakan tersebut sehingga menjadi bentuk yang
tersedia.
2.1.4

Vitamin B12

Vitamin B12 dalam bahan pangan ditentukan dengan uji pertumbuhan

mikrobiologis menggunakan Lactobacillus leichmannii atau Ochromonas
malhamensis. Bakteri tersebut digunakan karena memiliki spesivisitas yang lebih
besar untuk kobalamins dan memberikan penilaian yang lebih akurat dari aktivitas
biologis vitamin. Kelemahan dari bakteri O. malhamensis memerlukan waktu
inkubasi yang lebih lama, yaitu mencapai 34 hari dibandingkan dengan L.
leichmannii, sedangkan kelemahan bakteri L. leichmannii dapat mengalami
gangguan jika sampel mengandung deoksiribonukleosida.
Vitamin B12 dalam uji klinis menggunakan RIA berdasarkan persaingan
antara sianokobalamin bertanda 57Co dan vitamin bebas yang tidak bertanda
terhadap tapak pengikatan yang jumlahnya terbatas pada protein pengikat B12.
Jenis awal uji pengikatan ligan radioaktif untuk vitamin B12 dalam spesimen klinis
sering tidak akurat, karena protein pengikat yang digunakan dapat mengikat

10

bentuk aktif vitamin B12 maupun analog inaktif secara hayati sehingga
menimbulkan galat positif, sedangkan penentuan vitamin B12 dalam makanan
dengan RIA diperoleh hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan uji
mikrobiologis. Hal ini disebabkan pada metode RIA bergantung pada ekstraksi.
Prosedur ekstraksi yang lebih hebat cenderung mendapatkan hasil lebih tinggi
dibandingkan dengan uji mikrobiologis. Sementara keberadaan sianida dalam
prosedur ekstraksi dilaporkan memberikan hasil yang hampir sama dengan uji
mikrobiologis.
Metode EPBA telah dikembangkan dalam pelat mikrotitrasi untuk analisis
vitamin B12 dalam bahan pangan terfortifikasi. Protein-R ditandai dengan enzim
peroksidase horseradish (HRP), lalu konjugat enzim-protein dimurnikan dengan
fast protein liquid chromatography (FPLC). R-protein umumnya digunakan pada
metode EPBA karena harganya lebih murah. Fase terimobilisasi disiapkan dengan
menggabungkan sianokobalamin dengan keyhole limpet hemocyanin (KLH)
menggunakan prosedur bromoasetil bromida, yaitu melalui gugus alkohol primer.
Hal ini berbeda dengan penelitian sebelumnya yang mana konjugat disintesis
menggunakan gugus karboksilamida pada cincin corrin. Peningkatan sensitivitas
uji ditemukan dengan menggunakan konjugat bromoasetil dibandingkan dengan
sebelumnya sehingga protein-R bertanda enzim dapat digunakan pada
pengenceran yang lebih tinggi. Pelapisan pelat mikrotitrasi dan larutan enzim
protein-R berlabel digunakan untuk menstabilkan selama beberapa bulan tanpa
kehilangan aktivitas yang cukup besar.
Batas deteksi uji ini ialah 9 pg per sumur dan terdapat sedikit pengikatan
latar-belakang yang tak-spesifik. Penggunaan EPBA untuk menentukan jumlah
sianokobalamin yang ditambahkan dalam sereal makan pagi memberikan hasil
yang sesuai dengan jumlah teoritis. Ekstrak sampel yang tidak dilakukan
penambahan diuji untuk mengetahui gangguan yang terdapat dalam uji dan
didapat hasil kurva yang tidak dapat diperkirakan yang dibandingkan dengan
larutan standar. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa inkubasi dengan waktu
yang lebih cepat memberikan hasil yang sama dengan inkubasi yang dilakukan
sepanjang malam.
Metode EPBA lebih bagus dibandingkan dengan metode mikrobiologis dan
RIA. Metode ini lebih mudah dilakukan, memiliki potensi ketertiruan yang lebih
baik, dan waktu pengujian yang lebih singkat dibandingkan dengan prosedur
mikrobiologis (dengan Lactobacillus leichmannii dan Ochromonas malhamensis).
Akan tetapi, batas deteksi untuk EPBA baru dapat digunakan pada bahan pangan
yang difortifikasi. Metode EPBA digunakan untuk mengukur jumlah alami dalam
bahan pangan. Kepekaan pengujian masih harus ditingkatkan dengan
menggunakan sistem deteksi titik-akhir lain, dan prosedur ekstraksi atau clean-up
mungkin diperlukan, serta memiliki waktu yang lebih singkat dibandingkan
dengan uji mikrobiologis.
2.2 Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode Biosensor
Metode lain yang dapat digunakan dalam penentuan kandungan vitamin
larut air dalam makanan ialah dengan uji biosensor. Uji biosensor berbeda dengan
uji biospesifik, yaitu uji biosensor merupakan uji yang digunakan untuk menguji

11

seluruh vitamin larut air seperti biotin, asam pantotenat, asam folat, vitamin B12,
dan vitamin B6 yang lebih cepat dan praktis karena menggunakan kit yang
spesifik untuk senyawa tertentu dibandingkan dengan metode biospsifik yang
hanya digunakan untuk menguji satu senyawa atau satu vitamin yang larut air.
Metode biosensor optis surface plasmon resonance (SPR) menggunakan alat kit
Biacore Qflex.
Komponen utama cip sensor pada biosensor komersial terdiri atas cahaya
dan permukaan cip sensor. Cahaya dipantulkan seluruhnya secara internal pada
suatu antarmuka kaca-film logam (biasanya emas), dan reflektans diamati sebagai
fungsi sudut, pada sudut tertentu (sudut SPR), intensitas sinar pantul teramati
minimum. Hal ini menunjukkan eksitasi plasmon permukaan pada antarmuka
logam-larutan. Posisi respons tersebut peka akan perubahan indeks bias di sekitar
permukaan logam. Permukaan cip sensor terdiri atas permukaan kaca yang
dilapisi dengan selapis tipis emas yang dapat menjadi dasar untuk aneka
permukaan khusus yang dirancang untuk mengoptimumkan pengikatan secara
kovalen dan imobilisasi berbagai biomolekul. Permukaan yang paling banyak
digunakan ialah matriks yang tersusun dari gugus karboksimetil (CM) yang
langsung terikat pada lapisan emas atau terikat secara kovalen melalui penaut
hidrogel dekstran dengan panjang bervariasi.
Permukaan cip sensor yang memiliki matriks dekstran CM, terdapat lapisan
penaut alkanatiol yang memungkinkan pengikatan secara kovalen ke matriks
dekstran CM dan meminimumkan pengikatan non-spesifik ke lapisan emas.
Lapisan hidrogel dekstran membentuk suatu lingkungan hidrofilik bagi
biomolekul yang terikat, sehingga mereka tetap dalam keadaan tidak terdenaturasi.
Gugus CM dapat berikatan kovalen dengan amina, tiol, aldehida, dan gugus lain
yang segera setelah berinteraksi dengan sampel yang diinjeksikan, indeks bias
pada antarmuka antara permukaan sensor dan larutan tersebut berubah sebanding
dengan perubahan massa di permukaan. Akibatnya, ketika molekul dalam larutan
uji terikat pada suatu target yang diimobilisasikan pada permukaan cip, massa
molekul meningkat yang memperbesar indeks bias lokal. Sebaliknya, ketika
komponen terurai, indeks bias di dekat permukaan cip sensor akan menurun.
Perubahan real-time massa pada permukaan cip sensor dideteksi secara optis dan
dilaporkan dalam bentuk sensor gram (akur sudut resonans [dalam RU] terhadap
waktu).
Prinsip metode biosensor ialah molekul pendeteksi yang memiliki bobot
molekul tinggi seperti protein atau antibodi pengikat vitamin (VBP/A)
ditambahkan ke dalam sampel. Larutan sampel diinjeksikan pada cip sensor, maka
VBP/A akan terikat ke analit (vitamin) dalam sampel sebanding dengan jumlah
analit (vitamin) dalam sampel terebut. Protein atau antibodi pengikat vitamin
VBP/A yang tidak terikat akan tetap di dalam larutan dan berinteraksi dengan
analit (vitamin atau turunan vitamin) pada permukaan sensor. Pengikatan ke
permukaaan ini berlangsung dalam suatu aliran yang kontinu, bebas pulsa, dan
terkendali, sehingga menjaga konsentrasi VBP/A yang konstan di permukaan cip.
Oleh karena itu, tingkat respons setara dengan waktu kontak antara sampel dan
permukaan, yaitu volume injeksi. Respons diukur sebagai perbedaan mutlak yang
diperoleh segera sebelum dan segera sesudah injeksi sampel. Semakin tinggi
konsentrasi vitamin dalam sampel, semakin bertingkat inkubasi dan semakin

12

rendah respons yang terdeteksi pada cip biosensor. Respons dari deret konsentrasi
standar digunakan untuk membuat kurva kalibrasi.

3 SIMPULAN
Berdasarkan analisis yang telah digunakan, biosensor merupakan teknologi
yang lebih baik dan lebih menguntungkan dibandingkan dengan metode
biospesifik seperti ELISA, EPBA, RIA, dan mikrobiologis. Keuntungan dari
teknologi biosensor ialah seluruh vitamin larut air dapat terdeteksi, sedangkan
metode biospesifik hanya dapat mendeteksi satu senyawa saja. Konsentrasi serum
diperoleh paling tinggi pada ketersediaan hayati folat, sedangkan konsentrasi
terendah terdapat pada mukosa usus.

4 DAFTAR PUSTAKA
Finglas PM, Morgan MRA. 1993. Application of biospecific methods to the
determination of B-group vitamins in food a review. Food Chem. 49:191201.
Gao Y, Guo F, Gokavi S, Chow A, Sheng Q, Guo M. 2008. Quantification of
water-soluble vitamins in milk-based infant formulae using biosesor-based
assays. Food Chem. 110:769-776.
Gee JM, Bhabuta A, Johnson IT. 1989. A technique for assesing the biological
avaibility of folate in foods. Food Chem. 31:149-158.
Lindsay RC. 1996. Food Chemistry. Ed ke-3. Di dalam: Fennema OR, editor.
New York (US): Marcell Dekker.