METODO LOWRY PARA DETERMINAR PROTEINA

(antes Rick, 1956)

Preparacin de las soluciones
Solucin prestock:
Disuelve 4 g de NaOH + 30 g de Na2CO3. Afora con
agua destilada a 1 L (guardar a temperatura ambiente).
Tartrato de Sodio y Potasio 4% (wv):
Disuelve 4g de KNaC4H4O6 . 4H2O y afora con agua
destilada a 100ml (guardar en refrigerador).
Sulfato cprico 2% (wv):
Disuelve 2g de CuSO2 y afora con agua destilada a
100ml (guardar a temperatura ambiente).
Solucin estandar:
Albumina de suero bovino (BSA) 0.2 mg/ml.
Disuelve 20 mg y afora a 100 ml con agua
destilada.Dividir alicuotas y guardar en tubos pequeos
en el congelador.
Reactivo de Folins:
Producto comercial

METODO LOWRY PARA DETERMINAR DE PROTEINA

(antes Rick, 1956) cont.
Solucin Lowry A:
Mezcla 1 ml de solucin de tartrato de NaK + 1 ml de solucin CuSO2 afora con solucin
pre-stock a 100 ml. Nota: respeta el orden de adicin de las soluciones para evitar
formacin de precipitados. La cantidad de nuestra a preparar es de acuerdo al nmero de
muestras a procesar.
Solucin Lowry B:
Diluir Reactivo Folin 1:1 con agua destilada. Calcular la cantidad a preparar segn las
muestras procesadas diarias. Esta solucin se dura solo un da.
Espectrofotmetro:
Prender el espectrofotmetro 45min con anterioridad. Coloca los datos para lectura:
Task/Quantification/Set-up
WAVELENGTHS
Use wavelength 660 nm
Background correction none
CALIBRATION
Analytic name bsa

Calibration curve type Lineal Off Set

ENTER CONCENTRATION
Concentration

ug Units

Weigth & Volume

Weigth_/_ Volume Units

_Prompt for standard information

_Prompt for standard information

DATA TYPE

DISPLAY SPECTRUM

Absorbance

From_nm To_nm

Una vez incluido todos los datos presiona OK para que queden registrados.
Preparacin de la muestra:
Cuenta y lava las larvas (mnimo 10) con agua destilada (almacenar a -20C o procesar
inmediatamente)
Homogeniza la muestra con tris buffer (500ml*2), en bao fro.
Centrifugar a 12000rpm, 4C, 3 min
Separar sobrenadante (975l)
Colocarlo en tubos eppendorf y almacenalos en congelacin (-20C) o procesarlo. No
almacenar por ms de 6 meses. Esta muestra puede ser de la misma que se uso para
determinar Tripsina.

Leer por triplicado

METODO LOWRY PARA DETERMINAR DE PROTEINA

(antes Rick, 1956) cont.
Curva estandar:
Nmero
tubo

Vol (l) BSA

0.2 mg/ml

Vol (l)
agua dest.

Vol (l)
Lowry A

Vol (l)
Lowry B

250

1000

125 *

250

1000

125 *

25

225

1000

125 *

25

225

1000

125 *

50

200

1000

125 *

50

200

1000

125 *

75

175

1000

75

175

1000

100

150

1000

10

100

150

1000

125 *

11

125

125

1000

125 *

12

125

125

1000

125 *

13

150

100

1000

125 *

14

150

100

1000

125 *

15

175

75

1000

125 *

16

175

75

1000

125 *

17

200

50

1000

125 *

18

200

50

1000

125 * *

Agitar y
dejar
reposar
por 10
min

125 *
125 *
125 *

Dejar un
lapso de 30
seg* entre
muestras

g
protena

Al
agregarle
al ltimo
tubo se
dejan
reposar a
completar
20 min*
Ejm:
con el
estandar al
agregar
Soln B al
ltimo tubo
el primero
lleva 17
min,
entonces
solo
reposar 3
min para
leer el
primer
tubo.
Leer las
muestras
cada 30
seg

0
0
5
5
10
10
15
15
20
20
25
25
30
30
35
35
40
40

Una vez leidas todas las muestras del estandar se escriben g protena en la columna de
bsa (g) y se presiona Calibrate. Si algun punto sale de la recta se puede eliminar. No se
deben eliminar ms de tres puntos. Show Coefficient muestra el comportamiento de la
curva estandar:
Calibration Results Summary
_______________________________________

_______________________________________

Analytical Name

bsa

Coefficient k1

483.36000

Number of Standards

18

Std. Dev of k1

7.86500

Calibration Curve

C=k0+(k1*A)

Std. Dev of Calibrat

4.44680

Coefficient k0

-16.13300 g

Correl. Coeff. (R2)

0.99578

_______________________________________

_______________________________________

El valor de Correl. Coeff. (R2) debe acercarse lo ms posible a 1 sin rebasarlo.

Despues de esto se pueden correr las muestras

Leer por triplicado

METODO LOWRY PARA DETERMINAR DE PROTEINA

(antes Rick, 1956) cont.

Lectura de las muestras:

Diluir 1:0.5 (muestra:buffer) para completar a 300 l de muestra (sobrenadante). Para
leer por triplicado. El proceso de preparacin es igual que el de la curva estandar.
El valor del blanco (buffer [tris base pH 8] con el cual se hizo la dilucin arriba
mencinada) se restar de las lecturas de las muestras para corregir los resultados.
Solucin

Vol (l)
muestra

Vol (l)
agua dest.

Vol (l)
Lowry A

Muestra

sobrenadante

100

150

1000

Blanco

buffer

100

250

1000

Agitar y
dejar
reposar
por 10
min

Vol (l)
Lowry B

125 *
125

**

* Dejar un lapso de 30 seg* entre muestras.

Al agregarle al ltimo tubo se dejan reposar a completar 20 min*.
Leer las muestras cada 30 seg.
El software da directamente la cantidad de protena en la alcuota medida. Para obtener
la concentracin en mg/ml hay que dividir la lectura entre la alcuota y multiplicar por el
factor de dilucin.
Para salvar los valores:
File/Print to file/Current View/nombre.txt
Para imprimir:
File/Print /Current View