La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

El invento de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa, se debe al Dr. Kary Banks Mullis

(Premio Nobel de Qumica, 1993).
La tcnica permite amplificar una secuencia entre dos puntos definidos, pero se requiere
conocer previamente la secuencia que hay a ambos lados de la regin a amplificar. Se
desnaturaliza, una preparacin de ADN y se hibrida con dos cebadores cotos que son
complementarios de las cadenas opuestas a cada extremo de la regin que se requiere
amplificar. Para sintetizar la cadena complementaria a partir del extremo 3-OH de cada
cebador se emplea ADN polimerasa. El ciclo se repite desnaturalizando la preparacin y
empieza de nuevo. El nmero de copias de la secuencia elegida se amplifica,
exponencialmente. Se duplica hasta que se acumula una cantidad de molde-cebador que
excede la capacidad de la enzima a saturarse y el incremento tiende a hacerse lineal. Una
modificacin posterior introduce el empleo de una polimerasa del ADN de una bacteria
termfila; esta enzima permanece activa durante las fases de calentamiento para
completar cada ciclo de desnaturalizacin-reasociacin, permitiendo amplificaciones de
hasta 4 millones de veces en 25 ciclos. La PCR no copia molculas enteras de DNA, si no
que amplifica fragmentos de millones de pares de bases (la diana). 20-30 ciclos de
reaccin, los productos de cada ciclo actan como moldes de DNA para el siguiente ciclo.
Cada ciclo requiere 5 minutos
Metodologa
Posee gran sensibilidad: puede detectar y amplificar DNA en casi cualquier muestra.
Componentes para de una PCR

Reaccin que ocurre nico tuvo tras mezclar en l componentes necesarios e

incubarlos en un termociclador, componentes indispensables:
ADN molde que se desea amplificar
ADN polimerasa
Cebadores de secuencia especfica
Nucletidos para la sntesis de nuevo ADN
Tampn de reaccin que incluye las distintas sales requeridas por la enzima.

Los oligonucletidos iniciadores para la PCR, tienen una longitud de 10 a 30 bases. 0.2 a
0.1 M, El amortiguador estndar contiene 50 mM KCl, 10 mM de Tris-HCl, y 1.5 mM
MgCl2. MgCl2 puede tener un efecto sobre la especificidad y los productos que se
amplifican. Concentracin de la enzima ADN polimerasa Taq o la que se requiera es de
2.5 unidades por 100 L de reaccin. Los desixirribonucletidos trifosfato (dNTPs) de 50 a
200 M, si las concentraciones son altas es posible que se promuevan falsas
incorporaciones por la polimerasa. El segmento de ADN se amplificar a partir del molde
puede tener hasta 10 kb de longitud, ms tpico son amplificaciones de 100 a 1000 pb.
Termociclador. Facilita el PCR. Bsicamente la reaccin de cadena de la polimerasa
consta, de una treintena de ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos:

I) Desnaturalizacin del ADN bicatenario a 90C.

II) entre 40 y 60C, se forman y se rompen constantemente los puentes de hidrgeno
entre los oligonucletidos y el ADN. El Ta depende de la composicin de bases y del
tamao de los cebadores. Se suelen emplear dos cebadores que se unen cada uno a una
cadena diferente delimitando la secuencia diana que se pretende amplificar. La seleccin
de cebadores constituye los puntos ms crticos del ensayo de PCR.
III) 72C, la polimerasa alcanza su mxima actividad. Extensin de la cadena de ADN a
copiar, a partir de los cebadores, enzima ADN polimerasa, que inicia su actividad tras
reconocer la unin de los cebadores a las cadenas de ADN de la muestra.
Esta amplificacin exponencial tiene como resultado un gran nmero de copias de la
secuencia de ADN flanqueada por el par de oligonucletidos. Permitiendo obtener una
gran sensibilidad al detectar muy bajas cantidades de ADN molde y especificidad al
detectar nicamente la secuencia de cido nucleico. Lo que produce un incremento en la
secuencia de diana de entre 1 000 000 y 1 000 000 000 de veces.
APLICACIONES DE LA PCR.

Para la clonacin directa del ADN genmico o del ADN complementario.

Mutagnesis in vitro e ingeniera del ADN.
Ensayos para detectar la presencia de agentes infecciosos.
Diagnsticos prenatales o enfermedades genticas.
Anlisis de la variacin de secuencias allicas y la secuenciacin directa del ADN
genmico y complementario.

La PCR valiosa para obtener DNA para clonacin de genes o secuenciacin, en estudios
comparativos o filogenticos para amplificar genes de diversas procedencias. El rRNA
16S, una molcula utilizada en anlisis filogenticos tiene regiones altamente
conservadas y otras altamente variables, los cebadores especficos para el gen del rRNA
16S de bacterias o arqueas se pueden sintetizar y utilizar para analizar estos organismos
en un habitad especifico.
PCR se ha aplicado en tres grandes campos:
a) Diagnstico etiolgico. Mejora la eficacia diagnstica complementando mtodos,
diagnstico rpido y precoz del agente etiolgico.
b) Control del tratamiento con antimicrobianos. Iniciado el tratamiento, comprobar su
eficacia.
c) Caracterizacin gentica de agentes infecciosos. Genotipificacin; identificacin de
mutaciones determinantes de resistencias a frmacos o de virulencia; epidemiologa
molecular; etc.

Tipos de ARN: ARNm, ARNt y ARNr

Las cadenas polipeptdicas se especifican mediante marcos de lectura abierta
Para que el ADN se convierta en protenas especficas (con forma y funcin) se requiere
de la maquina celular que los sintetiza a partir de los gen. Los genes indican los tipos de
protenas que debe sintetizar, el ADN no es un molde para la sntesis de estas protenas,
el molde es cido ribonucleico (ARN), es una macromolcula larga no ramificada, formado
por una sola cadena, cuyo azcar que compone es la ribosa, y sus bases principales son:
adenina, guanina, citosina y uracilo. Tipos de ARN, el ARN mensajero (ARNm), ARN
ribosomal (ARNr) y el ARN de transferencia (ARNt).
El ARNm es la plantilla o molde para la sntesis de protenas, existe una molcula de ARN
para cada gene o grupos de genes que van a expresarse.
Transcripcin proceso en el cual se van adicionando una por una las bases del ARN
copiando la informacin del ADN. Posterior inicia la traduccin, (descodificacin), la
sntesis de protenas de acuerdo a las instrucciones ledas en el RNA mensajero molde.
Flujo de informacin de una clula se la le ha designado como el dogma central de la
biologa molecular:
Toda esta informacin inequvoca del ADN a la protena para la que codifica est dada en
el cdigo gentico, que es la relacin entre las secuencias de bases del ADN y la
secuencia de aminocidos de la protena. El cdigo es casi universal y se relaciona con
las cuatro letras del ADN, tomadas de tres en tres llamadas codones, con las letras de
una protena, formado por 20 aminocidos. Sesenta y un codones especifican
aminocidos particulares. Los otros tres codones (UAA, UAG y UGA) son las seales para
la terminacin de la cadena, para los aminocidos hay ms de un vocablo clave.
ARNt es responsable del transporte de aminocidos al ribosoma para apoyar de la
sntesis de protenas de nuevo. Las molculas de aminocidos de traslados son
pequeas, desde 74 hasta 95 bases. Un tRNA unido covalentemente a un AA en
desarrollo se dice que est "cargado". Dentro de la regin codificadora del ARNm, cada
grupo de tres nucletidos constituye un codn, la colocacin de los aminocidos correctos
en el polipptido naciente depende del reconocimiento del codn del ARNm por un motivo
trinucletido complementarias realizadas en un brazo del tRNA y conocido como un
anticodn. Los pares de anticodn del ARNt son la base para el codn en el alargamiento
de la protena del ribosoma, Aunque no es tan abundante como ARNr, El ARN ms
pequeo que es el ARNt desempean un papel central en la traduccin.
ARNm solo dirige la sntesis de protenas a travs del aparato de traduccin mvil que
consiste en gran medida de ARNr y ARNt. Especies especficas del ARNm varan
ampliamente en nmero y abundancia en la clula. Algunos ARNms estn presentes en
cientos de copias por clula, mientras que otros todava estn presentes slo unas pocas

copias por clula, este aspecto del perfil de ARN de la clula puede ser problemtico por
la abundancia de transcripciones muy baja que son difciles de detectar.
La cintica de expresin de los genes procariotas son tan rpidos que el mRNA
bacteriana suele ser transcritas, sometidos a la traduccin, y se degrada de forma
simultnea.
En contraste con los sistemas procariotas, casi todos los ARNm eucariotas son
monocistrnicos. Aunque el resultado es la traduccin de un solo polipptido de una
determinada molcula de ARNm eucariota monocistrnicos, que el mRNA, est sujeta a la
traduccin repetida mientras el discurso sigue siendo biolgicamente y qumicamente
competentes. La transcripcin del ARNm a menudo es por varios ribosomas que estn
involucrados en la traduccin simultneamente. Se conoce como un polisomas.
Polisomas se observan tanto en clulas procariotas y eucariotas, polisomas eucariotas, 7
a 8 ribosomas por polisomas, tienden a ser ms pequeos que sus homlogos
procariotas.