Anda di halaman 1dari 13

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNOLOGI ENZYM

Percobaan 4: ELEKTROFORESIS PROTEIN ENZIM

AVNER DANIEL GONIE


31120021

FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA
YOGYAKARTA
2014

BAB I
PENDAHULUAN
A. TUJUAN
1. Mengerti prinsip dasar elektroforesis
2. Menggunakan teknik SDS-PAGE untuk memisahkan protein - protein darah.
B. LANDASAN TEORI
Enzim merupakan protein yang khusus disintesis oleh sel hidup untuk
mengkatalisis reaksi yang berlangsung di dalamnya. Fungsi khusus dari enzim adalah
untuk menurunkan energi aktivasi, mempercepat reaksi pada suhu dan tekanan yang
tetap tanpa mengubah besarnya tetapan keseimbangan dan sebagai pengendali
reaksinya (Martoharsono, 1994).
Enzim merupakan senyawa protein yang dapat mengkatalisis seluruh reaksi
kimia dalam sistem biologis. Semua enzim murni yang telah diamati sampa saat ini
adalah protein. Aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai
protein. Enzim dapat mempercepat reaksi biologis, dari reaksi yang sederhana, sampai
ke reaksi yang sangat rumit. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan
molekul zat-zat yang bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi
terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan
mempermudah terjadinya reaksi. Enzim mengikat molekul substrat membentuk
kompleks enzim substrat yang bersifat sementara dan lalu terurai membentuk enzim
bebas dan produknya (Lehninger, 1995).
Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas dan Elektroforesis Gel.

Elektroforesis Kertas: merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas


sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion
kompleks) sebagai fase gerak. Pemisahan tersebut terjadi karena adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas
tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan
yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan daya
absopsi zat terlarut (Boyer, 2004).

Elektroforesis

Gel:

merupakan

elektroforesis

yang

menggunakan

gel

sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan


protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul
dengan

panjang

memisahkan

yang

suatu

sama. Elektroforesis

makromolekul

dengan

gel

merupakan

cara memberi

teknik

gaya pada

makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yang dibantu


dengan tenaga listrik. Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju
perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruhmedan listrik. Media atau
gel yang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis DNA) dan
poliakrilamid

gel (elektroforesis

protein).

Laju

pergerakan

molekul

dipengaruhi oleh ukuran molekul, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas


muatan, pori-pori gel,

voltase, dan larutanbuffer elektroforesis (Martin,

2006).
Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah
molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul
yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung s ampel yang
akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik
yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium (misal agarosa),
maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif.
Kecepatan

gerak

molekul

tersebut tergantung

pada

rasio

muatan

terhadap

massanya dan bentuk molekulnya. (Yuwono, 2008).


SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila
dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi
utama SDS pada metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis)
yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, selain
itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan
menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan
menghancurkan sebagian stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke
arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan listrik (Anam, 2009).

Tujuan

analisis

protein

dengan

metode

elektroforesis

yaitu

untuk

memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks


penyangga akrilamid. Selain itu dengan elektroforesis akan diketahui jenis protein
dalam bahan atau sampel yang akan dianalisis. Elektroforesis dalam skala besar
memungkinkan digunakan sebagai metode pemisahan untuk menentukan komponen
dari protein (Wibowo, 2010).
Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu untuk mencegah difusi
akibat timbulnya panas pada arus listrik. Selain itu gel akrilamid sering
dimanfaatkan

untuk memisahkan

molekul

protein

yang

kecil.

Konsentrasi

akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi migrasi protein. Pada proses
pembuatan gel, akrilamid akan berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen
(Prihanto, 2011).
Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan
untuk mencetak sumuran (well), selain itu digunakan untuk menimbun atau
memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasuki gel
pemisah. Stacking gel juga digunakan untuk menahan sementara agar sampel
bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Pada saat elekroforesis protein, proteinakan
tertarik ke bagian bawah arus listrik. Protein yang memiliki berat molekul palingkecil
bergerak cepat sehingga tertarik sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang
memiliki berat molekul paling besar akan berada pada bagian atas dari gel (Utami,
2007).
Pewarnaan atau staining pada gel merupakan bagian dari metode SDSPAGE. Fungsi

pewarnaan

gel

pada

elektroforesis

yaitu

untuk

membantu

memonitor jalannya elektroforesis. Pewarnaan gel pada metode elektroforesis protein


terdiri dari commasie blue staining dan silver salt staining. Pada pengecatan dengan
menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita-pita protein terbentukpada gel
pemisah. Jarak migrasi diukur dan dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh
pewarna biru bromofenol. Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk mengamati
migrasi molekul protein selama elektroforesis (Anam, 2009).

BAB II
METODE
A. ALAT dan BAHAN
2. Bahan :
1. Alat :
PBS 0,1 M pH 7,4.

Sentrifus
Separating gel 3 ml (5,4 ml larutan A ; 3,75 ml

Microsentrifuge
Kotak es
larutan B; 5,85 ml dH2O; 100 l APS 10%; 40
Sonikator
l TEMED ).
Vorteks
Stacking gel 3% sebanyak 3 ml dibuat dengan
Tabung sentrifus cap 10 ml
susunan : 0,45 ml larutan A; 0,567 ml 1 M Tris Sampel darah
Cl pH 6,8;0,045 ml SDS 10% 1,938 ml dH2O;

30 l APS 10%; 5 l TEMED.


Larutan A : campuran 29,2 g acrylamid dan 0,8

bis-acrylamid dalam 100 ml akuades.


Larutan B : (4X separating gel buffer) :
campuran dari 75 ml 2M Tris-HCl (pH 8,8) 4 ml

10% SDS dan 21 ml H2O.


100 ml buffer cuci (150 mM NaCl, 5 mM
Na2PO4, 0,1mM EDTA pH 7,4). Simpan dalam

kondisi dingin.
100 ml buffer hemolisis (5 mM Na2PO4, 0,1
EDTA pH 8). Simpan dalam kondisi dingin.

B. CARA KERJA
Untuk mengisolasi protein darah diperlukan beberapa tahapan yaitu :
1. Pemisahan sel-sel darah dengan plasma darah
2. Isolasi protein dari sel-sel darah
3. Salting out menggunakan garam berkonsentrasi

a. Pemisahan sel-sel darah dan plasma darah

diambil 5 ml sampel darah

dimasukan dalam tabung sentrifugasi


10 ml, sentrifus dengan kecepatan
5000 rpm selama 15 menit

disimpan dalam tabung


mikrosentrifuse 2 ml dan tandai
dengan kode PD. Dibuat dalam 2
tabung ulangan

diambil 500 l bagian supernatan


(sebagai plasma darah)

dibuang secara perlahan sisa


supernatan, kemudian ditambahkan
6 ml buffer cuci (dalam kondisi
dingin)

Divorteks dan disentrifus dengan


kecepatan 5000 rpm selama 15 menit

dilakukan ulangan dari langkah 4-6


sekali lagi. Endapan yang diperoleh
merupakan sel-sel darah.

dibuang supernatan dengan hati-hati

b. Isolasi protein dari sel-sel darah


ditambahkan 6 ml buffer hemolisis
(dalam kondisi dingin) pada endapan
sel-sel darah yang diperoleh pada
langkah bagian A

disimpan dalam lemari es

divorteks, kemudian disentrifus


dengan kecepatan 5000 rpm selama
15 menit

diambil 1 ml supernatan dengan pipet


secara hati-hati dan simpan dalam
tabung mikrosentrifuse 2 ml dan
tandai dengan protein sitoplasmik
(PS)

dibuang kira-kira sebanyak 5 ml sisa


supernatan pada tabung

ditambahkan 7 ml buffer hemolisis


dingin, divorteks

dibuang supernatan dengan hati-hati,


sisakan sekitar 2 ml berikut endapan

disentrifuse dengan kecepatan 13000

dipindahkan kedalam mikrosentrifuse

disentrifugasi dengan kecepatan


14.000 rpm selama 30 menit

baru, beri kode protein membran

rpm selama 15 menit

(PM)

dibuang supernatan hati-hati dan


simpan dalam kotak es

c. Pengendapan protein plasma dengan kadar garam tinggi

diambil mikrosentrifus cap 2 ml dan


ditambahkan 250 l larutan
(NH4)2SO4 yang jenuh

ditambahkan 500 l sampel plasma


darah dari tabung kode PD

disentrifugasi dengan kecepatan


14.000 rpm selama 3 menit

divorteks dan diinkubasi pada suhu


kamar selama 5 menit

diambil bagian supernatan dan


simpan dalam tabung sentrifuse

diberi kode PSG dan simpan dalam


suhu dingin

dihomogenkan dengan pipet

ditambahkan kembali 1 ml larutan


50% (NH4)2SO4 (yang tak jenuh)

disentrifugasi dengan kecepatan


14.000 rpm selama 3 menit

dibuang bagian supernatan dan


keringkan bagian endapan

diberi kode sampel PEG pada bagian


endapan merupakan sampel protein
hasil pengendapan dengan garam
berkonsentrasi tinggi

d. Pengendapan protein plasma dengan etanol

diambil mikrosentrifuse cap 2 ml dan


ditambahkan 250 l larutan
(NH4)2SO4 yang jenuh

ditambahkan 500 l sampel plasma


darah dari tabung kode PD

disentrifugasi dengan kecepatan


14.000 rpm selama 3 menit

divorteks dan diinkubasi pada suhu


dingin selama 5 menit

diambil bagian supernatan dan


simpan dalam tabung sentrifuse

diberi kode PSE dan simpan dalam


suhu dingin

dihomogenkan dengan pipet

ditambahkan kembali 1 ml etanol


dalam kondisi dingin

disentrifugasi dengan kecepatan


14.000 rpm selama 3 menit

dibuang bagian supernatan dan


keringkan bagian endapan

diberi kode sampel PEE pada bagian


endapan merupakan sampel protein
hasil pengendapan dengan garam
berkonsentrasi tinggi

e. Elektroforesis SDS-PAGE

1
diambil masing-masing sampel
dengan kode PS, PSG, dan PSE
sebanyak 50 l

ditambahkan 450 l buffer sampel


dan 25l -merkaptoetanol ke setiap
tabung.

2
diambil masing-masing sampel
dengan kode PS, PSG, dan PSE
sebanyak 50 l

ditambahkan 900 l buffer sampel


dan 25l -merkaptoetanol ke setiap
tabung

divorteks 1 & 2

diwaterbath dalam kondisi mendidih


selama 5 menit. disentrifugasi dengan
kecepatan tinggi selama 3 menit..

dielektroforensis pada voltage 120


mV selama 1 jam,

dimasukan sampel ke dalam sumur


yang terbentuk

diikuti dengan pewarnaan gel dengan


menggunakan coomassie blue

direndam gel dalam larutan


coomassie blue semalam (digoyang
pelan)

Diamati hasilnya

BAB III
HASIL dan PEMBAHASAN
A. HASIL

B. PEMBAHASAN

BAB IV
KESIMPULAN

BAB V
DAFTAR PUSTAKA
Anam, K. 2009. SDS-PAGE dengan Silver Staining dan Zimogram. Bioteknologi
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
Boyer, R. 2004. Modern Experimental Biochemistry. California: The Benjamin
Publishing Company
Lehninger, L. A., (1993), Dasar-Dasar Biokimia, Maggy T, penerjemah. Jakarta :
Erlangga. Terjemahan dari School of Medicine.
Martin, R. 2006. Gel Electroforesis: Nucleid Acids. Oxford: Bros Scientific
Publishers Ltd.
Martoharsono, S. (1994). Biokimia jilid 1. Gadjah Mada University Press.
Yogyakarta.
Prihanto, A.A. 2011. Teknik Molekuler: Elektroforesis. http://asep.lecture.ub.ac.id.
Diakses Tanggal 15 Mei 2014
Utami, E.S.W., dkk. 2007. Sintetis Protein Selama Embriogenesis Somatik Anggrek
Bulan Phalaenopsis amabilis (L.). Jurnal Biodiversitas. Vol.8, No.3, Hal.188191
Wibowo, M.S. 2010. Elektroforesis. Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung
Yuwono, T. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Penerbit Erlangga