FAKULTAS BIOTEKNOLOGI UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA YOGYAKARTA 2014
BAB I PENDAHULUAN A. TUJUAN 1. Mengerti prinsip dasar elektroforesis 2. Menggunakan teknik SDS-PAGE untuk memisahkan protein - protein darah. B. LANDASAN TEORI Enzim merupakan protein yang khusus disintesis oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi yang berlangsung di dalamnya. Fungsi khusus dari enzim adalah untuk menurunkan energi aktivasi, mempercepat reaksi pada suhu dan tekanan yang tetap tanpa mengubah besarnya tetapan keseimbangan dan sebagai pengendali reaksinya (Martoharsono, 1994). Enzim merupakan senyawa protein yang dapat mengkatalisis seluruh reaksi kimia dalam sistem biologis. Semua enzim murni yang telah diamati sampa saat ini adalah protein. Aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Enzim dapat mempercepat reaksi biologis, dari reaksi yang sederhana, sampai ke reaksi yang sangat rumit. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim substrat yang bersifat sementara dan lalu terurai membentuk enzim bebas dan produknya (Lehninger, 1995). Ada 2 jenis elektroforesis yaitu Elektroforesis Kertas dan Elektroforesis Gel.
Elektroforesis Kertas: merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas
sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion kompleks) sebagai fase gerak. Pemisahan tersebut terjadi karena adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan daya absopsi zat terlarut (Boyer, 2004).
Elektroforesis
Gel:
merupakan
elektroforesis
yang
menggunakan
gel
sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan
protein menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan
panjang
memisahkan
yang
suatu
sama. Elektroforesis
makromolekul
dengan
gel
merupakan
cara memberi
teknik
gaya pada
makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yang dibantu
dengan tenaga listrik. Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruhmedan listrik. Media atau gel yang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis DNA) dan poliakrilamid
gel (elektroforesis
protein).
Laju
pergerakan
molekul
dipengaruhi oleh ukuran molekul, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas
muatan, pori-pori gel,
voltase, dan larutanbuffer elektroforesis (Martin,
2006). Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung s ampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif. Kecepatan
gerak
molekul
tersebut tergantung
pada
rasio
muatan
terhadap
massanya dan bentuk molekulnya. (Yuwono, 2008).
SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan listrik (Anam, 2009).
Tujuan
analisis
protein
dengan
metode
elektroforesis
yaitu
untuk
memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks
penyangga akrilamid. Selain itu dengan elektroforesis akan diketahui jenis protein dalam bahan atau sampel yang akan dianalisis. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan digunakan sebagai metode pemisahan untuk menentukan komponen dari protein (Wibowo, 2010). Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE yaitu untuk mencegah difusi akibat timbulnya panas pada arus listrik. Selain itu gel akrilamid sering dimanfaatkan
untuk memisahkan
molekul
protein
yang
kecil.
Konsentrasi
akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi migrasi protein. Pada proses pembuatan gel, akrilamid akan berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen (Prihanto, 2011). Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan untuk mencetak sumuran (well), selain itu digunakan untuk menimbun atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasuki gel pemisah. Stacking gel juga digunakan untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Pada saat elekroforesis protein, proteinakan tertarik ke bagian bawah arus listrik. Protein yang memiliki berat molekul palingkecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar akan berada pada bagian atas dari gel (Utami, 2007). Pewarnaan atau staining pada gel merupakan bagian dari metode SDSPAGE. Fungsi
pewarnaan
gel
pada
elektroforesis
yaitu
untuk
membantu
memonitor jalannya elektroforesis. Pewarnaan gel pada metode elektroforesis protein
terdiri dari commasie blue staining dan silver salt staining. Pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita-pita protein terbentukpada gel pemisah. Jarak migrasi diukur dan dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pewarna biru bromofenol. Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk mengamati migrasi molekul protein selama elektroforesis (Anam, 2009).
BAB II METODE A. ALAT dan BAHAN 2. Bahan : 1. Alat : PBS 0,1 M pH 7,4.
Sentrifus Separating gel 3 ml (5,4 ml larutan A ; 3,75 ml
Microsentrifuge Kotak es larutan B; 5,85 ml dH2O; 100 l APS 10%; 40 Sonikator l TEMED ). Vorteks Stacking gel 3% sebanyak 3 ml dibuat dengan Tabung sentrifus cap 10 ml susunan : 0,45 ml larutan A; 0,567 ml 1 M Tris Sampel darah Cl pH 6,8;0,045 ml SDS 10% 1,938 ml dH2O;
30 l APS 10%; 5 l TEMED.
Larutan A : campuran 29,2 g acrylamid dan 0,8
bis-acrylamid dalam 100 ml akuades.
Larutan B : (4X separating gel buffer) : campuran dari 75 ml 2M Tris-HCl (pH 8,8) 4 ml
10% SDS dan 21 ml H2O.
100 ml buffer cuci (150 mM NaCl, 5 mM Na2PO4, 0,1mM EDTA pH 7,4). Simpan dalam
kondisi dingin. 100 ml buffer hemolisis (5 mM Na2PO4, 0,1 EDTA pH 8). Simpan dalam kondisi dingin.
B. CARA KERJA Untuk mengisolasi protein darah diperlukan beberapa tahapan yaitu : 1. Pemisahan sel-sel darah dengan plasma darah 2. Isolasi protein dari sel-sel darah 3. Salting out menggunakan garam berkonsentrasi
a. Pemisahan sel-sel darah dan plasma darah
diambil 5 ml sampel darah
dimasukan dalam tabung sentrifugasi
10 ml, sentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit
disimpan dalam tabung
mikrosentrifuse 2 ml dan tandai dengan kode PD. Dibuat dalam 2 tabung ulangan
diambil 500 l bagian supernatan
(sebagai plasma darah)
dibuang secara perlahan sisa
supernatan, kemudian ditambahkan 6 ml buffer cuci (dalam kondisi dingin)
Divorteks dan disentrifus dengan
kecepatan 5000 rpm selama 15 menit
dilakukan ulangan dari langkah 4-6
sekali lagi. Endapan yang diperoleh merupakan sel-sel darah.
dibuang supernatan dengan hati-hati
b. Isolasi protein dari sel-sel darah
ditambahkan 6 ml buffer hemolisis (dalam kondisi dingin) pada endapan sel-sel darah yang diperoleh pada langkah bagian A
disimpan dalam lemari es
divorteks, kemudian disentrifus
dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit
diambil 1 ml supernatan dengan pipet
secara hati-hati dan simpan dalam tabung mikrosentrifuse 2 ml dan tandai dengan protein sitoplasmik (PS)
dibuang kira-kira sebanyak 5 ml sisa
supernatan pada tabung
ditambahkan 7 ml buffer hemolisis
dingin, divorteks
dibuang supernatan dengan hati-hati,
sisakan sekitar 2 ml berikut endapan
disentrifuse dengan kecepatan 13000
dipindahkan kedalam mikrosentrifuse
disentrifugasi dengan kecepatan
14.000 rpm selama 30 menit
baru, beri kode protein membran
rpm selama 15 menit
(PM)
dibuang supernatan hati-hati dan
simpan dalam kotak es
c. Pengendapan protein plasma dengan kadar garam tinggi
diambil mikrosentrifus cap 2 ml dan
ditambahkan 250 l larutan (NH4)2SO4 yang jenuh
ditambahkan 500 l sampel plasma
darah dari tabung kode PD
disentrifugasi dengan kecepatan
14.000 rpm selama 3 menit
divorteks dan diinkubasi pada suhu
kamar selama 5 menit
diambil bagian supernatan dan
simpan dalam tabung sentrifuse
diberi kode PSG dan simpan dalam
suhu dingin
dihomogenkan dengan pipet
ditambahkan kembali 1 ml larutan
50% (NH4)2SO4 (yang tak jenuh)
disentrifugasi dengan kecepatan
14.000 rpm selama 3 menit
dibuang bagian supernatan dan
keringkan bagian endapan
diberi kode sampel PEG pada bagian
endapan merupakan sampel protein hasil pengendapan dengan garam berkonsentrasi tinggi
d. Pengendapan protein plasma dengan etanol
diambil mikrosentrifuse cap 2 ml dan
ditambahkan 250 l larutan (NH4)2SO4 yang jenuh
ditambahkan 500 l sampel plasma
darah dari tabung kode PD
disentrifugasi dengan kecepatan
14.000 rpm selama 3 menit
divorteks dan diinkubasi pada suhu
dingin selama 5 menit
diambil bagian supernatan dan
simpan dalam tabung sentrifuse
diberi kode PSE dan simpan dalam
suhu dingin
dihomogenkan dengan pipet
ditambahkan kembali 1 ml etanol
dalam kondisi dingin
disentrifugasi dengan kecepatan
14.000 rpm selama 3 menit
dibuang bagian supernatan dan
keringkan bagian endapan
diberi kode sampel PEE pada bagian
endapan merupakan sampel protein hasil pengendapan dengan garam berkonsentrasi tinggi
e. Elektroforesis SDS-PAGE
1 diambil masing-masing sampel dengan kode PS, PSG, dan PSE sebanyak 50 l
ditambahkan 450 l buffer sampel
dan 25l -merkaptoetanol ke setiap tabung.
2 diambil masing-masing sampel dengan kode PS, PSG, dan PSE sebanyak 50 l
ditambahkan 900 l buffer sampel
dan 25l -merkaptoetanol ke setiap tabung
divorteks 1 & 2
diwaterbath dalam kondisi mendidih
selama 5 menit. disentrifugasi dengan kecepatan tinggi selama 3 menit..
dielektroforensis pada voltage 120
mV selama 1 jam,
dimasukan sampel ke dalam sumur
yang terbentuk
diikuti dengan pewarnaan gel dengan
menggunakan coomassie blue
direndam gel dalam larutan
coomassie blue semalam (digoyang pelan)
Diamati hasilnya
BAB III HASIL dan PEMBAHASAN A. HASIL
B. PEMBAHASAN
BAB IV KESIMPULAN
BAB V DAFTAR PUSTAKA Anam, K. 2009. SDS-PAGE dengan Silver Staining dan Zimogram. Bioteknologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor Boyer, R. 2004. Modern Experimental Biochemistry. California: The Benjamin Publishing Company Lehninger, L. A., (1993), Dasar-Dasar Biokimia, Maggy T, penerjemah. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari School of Medicine. Martin, R. 2006. Gel Electroforesis: Nucleid Acids. Oxford: Bros Scientific Publishers Ltd. Martoharsono, S. (1994). Biokimia jilid 1. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Prihanto, A.A. 2011. Teknik Molekuler: Elektroforesis. http://asep.lecture.ub.ac.id. Diakses Tanggal 15 Mei 2014 Utami, E.S.W., dkk. 2007. Sintetis Protein Selama Embriogenesis Somatik Anggrek Bulan Phalaenopsis amabilis (L.). Jurnal Biodiversitas. Vol.8, No.3, Hal.188191 Wibowo, M.S. 2010. Elektroforesis. Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung Yuwono, T. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Penerbit Erlangga
