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Es

una condicin patolgica


establecida por el efecto
biolgico de una alteracin
en el genoma (mutacin)
Esta

alteracin puede haberse


adquirido o no de los progenitores

Qu queremos estudiar?

Modificaciones en el ADN
afectaran la funcin biolgica

Cualquier modificacin en la
secuencia nucleotdica del
ADN
Puede ser un reordenamiento,
un cambio de base o
variaciones en la cantidad.

De acuerdo al tamao de la mutacin:


- MACRO-MUTACIONES:
Alteraciones Cromosmicas
1)Estructurales
2)Numricas
- MICRO-MUTACIONES:
Alteraciones a nivel molecular
Desde megabases a 1 pb (mutacin
puntual)

Muestra
disponible
Diagnstico
prenatal o
postnatal

Indicacin
clnica

TCNICAS
CITOGENTICAS

MOLECULARES

Son un conjunto de
herramientas que
aprovechan la estructura y
propiedades del ADN
(cido desoxirribonuclico)

Los cuatro nucletidos


que forma el ADN
varan slo en sus
bases nitrogenadas
Hay dos purinas
(adenina y guanina) y
dos
pirimidinas (citosina y
timina)
Adenina = Timina
Guanina = Citosina
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La molcula de ADN es
una doble hlice
El dimetro es uniforme
en toda la molcula
La curvatura de ADN es
hacia la derecha
Las dos cadenas corren
en distinta direccin son
antiparalelas
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La estructura de
azcar y fosfato se
ubican en el
exterior de la
molcula de doble
hlice
La base
nitrogenada en la
regin interior
Las bases
complementarias se
unen por puente de
hidrgeno
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Las dos hebras


de ADN se
disponen de
manera
ANTIPARALELA

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14

ALGUNAS PROPIEDADES DEL ADN


* Algunas hebras del ADN se pueden desenrollar
y separar. A esto se lo llama
DESNATURALIZACIN

Se puede inducir experimentalmente con


aumento de temperatura.
*Las hebras resultantes monocatenarias se
reasocian nuevamente bajando la temperatura
o elevando la concentracin de iones. A este
proceso se lo denomina RENATURALIZACIN
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ALGUNAS PROPIEDADES DEL ADN


Todos los cidos nuclicos tienen
carga negativa y en un gel de
agarosa en presencia de un campo
elctrico migran hacia el polo positivo
con una velocidad inversamente
proporcional a su longitud.
Las enzimas de restriccin cortan la
doble hlice de ADN en secuencias
especficas .

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Extraccin de ADN
Corte con enzimas de restriccin
Electroforesis en Agarosa
Southern Blot
PCR
Clonado
Ejemplos
- Corea de Huntington
- Sndrome de X frgil
- Cncer

Segn el tejido se utilizarn diferentes


tcnicas.
Ej: en Sangre Perifrica con enzimas
proteolticas a partir de la fase de
glbulos blancos. Luego se precipita
con etanol.
Se lava varias veces
Se chequea midiendo absorbancia del
ADN

Son enzimas que reconocen determinadas


secuencias de ADN de 4-10 pb y las cortan
generando extremos romos o cohesivos.
Son muy especficas

ADN cortado se somete a


una electroforesis en gel

Por capilaridad se pega el


ADN al filtro

Desnaturalizacin del ADN e


hibridacin con sonda*

Se aplica la pelcula de rayos


X (autorradiografa)

Los fragmentos hibridados se


muestran como bandas

Se requiere informacin de la secuencia a


clonar para hacer los cebadores

A 95 C se separan las cadenas del templado


de ADN

A 60C puede hibridarse cada cadena con


los cebadores (primers ant y post)

A los 75C la Taq polimerasa empieza a


extender las cadenas copiando el molde

A los 95C se separan ahora 4 cadenas y as


se va amplificando en cada ciclo

Clonado: copia de fragmento de ADN,


clula u organismo que resulta
genticamente idntico

Secuenciacin de ADN: se determina la


secuencia de bases. Puede ser por
mtodos enzimticos o qumicos.

Especies Transgnicas: organismo cuyas


clulas poseen ADN derivado de otro

Ejemplos de
Aplicacin

Enfermedad degenerativa de los


ncleos basales del encfalo
Herencia dominante
Edad en que se manifiesta: 35 a 50 aos
Demencia y muerte (5 a 20 aos
despus)
1993 se identifica gen HD en 4p
Se observa expansin de trinucletidos
repetitivos en una zona especfica del
gen

5...CAG CAGCAG.3
8 a 35
NORMAL

5..CAG CAG CAG CAG.CAG3


36 a 120
ENFERMEDAD DE HUNGTINTON
Se produce una protena poliglutamnica anormal

El gen Hd con (CAG)n se


amplific por PCR y se
corri en gel.
Luego se revel con
coloracin de plata.
La primera calle son
marcadores control.
1,2,6,y 10 son normales
con menos de 35 (CAG)
3,4,5,7, y 8 con
enfermedad de
Huntington.
5 una aparicin juvenil por amplificacin al tener 86
(CAG) mientras su padre 55(CAG)
9 es feto afectado (DPN)

Recesiva
Afecta 1/2000 r.n. de raza blanca
Compromete glndulas excrinas de todo
el cuerpo por defecto del transporte del Clen la membrana de los epitelios
glandulares
Muerte entre edad de 10 a 20 aos por
complicaciones pulmonares y cardacas
Gen en 7q21
muy grande (230 kb) 27 exones
Protena: CFTR (canal de Cl-)

Existen ms de 1000
La mayora en exones 10 y 11
70% corresponde a F 508 que es una
delecin de 3 bases en el exn 10 y
provoca la prdida de un aa
Existen aproximadamente 20
mutaciones ms frecuentes y el resto
son muy raras.
Se expresan en homocigosis por ser
recesivas

Tcnicas Aplicaciones

Ventajas

Desventajas

Bandeo G

Identificar AC estructurales y
numricas

Bajo costo
Pesquisa de todo el
genoma

Requiere clulas en divisin


Baja eficiencia en cariotipos
complejos

Bandeo G
AR

Identificar AC estructurales y
numricas
Precisar puntos de ruptura

Bajo costo
Pesquisa de todo el
genoma

El anlisis de todo el
cariotipo es muy tedioso

FISH

Determinar la presencia,
nmero de copias y
localizacin de secuencias
de ADN

Su costo no es demasiado Solo es informativa de la


elevado
secuencia que se desea
Es rpida y sencilla
investigar
Se aplica a clulas en
interfase y en divisin

Multi FISH
/ SKY

Detecta rearreglos
cromosmicos complejos que
involucran ms de un
cromosoma e identifica
cromosomas marcadores

Pesquisa de todo el
genoma
Clarifica rearreglos
cromosmicos complejos

Es laboriosa y de alto costo


Requiere clulas en divisin
y de muy buena calidad
No detecta
intracromosmicas

a CGH

Detecta prdidas yganancias


de secuenciasde ADN

Pesquisa de todo el
genoma
No necesita clulas
en divisin

Tanto el equipamiento como


los reactivos son costosos
Las AC que se detectan
deben ser confirmadas por
FISH
No detecta AC balanceadas

CONCLUSIONES:
- Todas las tcnicas son
complementarias pero no excluyentes.
- No todas las tcnicas descriptas se

realizan en la Argentina.
Solo algunos laboratorios realizan
FISH con fines diagnsticos, debido al
costo de reactivos y equipamiento .
- Estas tcnicas citogenticas pueden
complementarse con otras que son de
biologa molecular exclusivamente.

a-CGH

Muchas
gracias por su
atencin
Diana Radakoff de Doldan

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