Ocorrncia

de genes tad associados formao de biofilme em isolados de Pasteurella multocida de

pulmes de sunos com pneumonia1

Autores: Moraes, D.F.S.D.2; Brando, L.N.S.2; Pitchenin, L.C.2; Filho, J.X.O.3; Mores, N.3; Nakazato, L.2; Dutra,
V.2*

?
ABSTRACT


RESUMO

Os atuais sistemas de criao intensiva de sunos aumentam a presso de seleo microbiana
propiciando a disseminao de doenas respiratrias. A bactria Pasteurella multocida (P. multocida) associada
a diversas patologias respiratrias em animais submetidos a esse tipo de criao, causando grandes perdas
econmicas. A formao de biofilme foi descrita in vitro em P. multocida e fatores analisados indicam a facilitao
na colonizao dos tecidos, aumentando a resistncia s defesas do hospedeiro e aos antibiticos. O objetivo
deste trabalho foi identificar a ocorrncia de genes tad, associado formao de biofilme em isolados de P.
multocida de pulmes de sunos criados intensivamente. Foram analisados 70 isolados de P. multocida de
pulmes, sendo 67 com leso e trs sem leso. Todas as amostras positivas para o sorotipo D, foram negativas
para a presena do gene tadD. As trs amostras de pulmo sem leso foram positivas para o sorotipo D e
negativas para o gene tadD, sugerindo que se tratam de amostras da microbiota do animal. Conclumos com este
trabalho que o gene tadD est associado a isolados de P. multocida de pulmes com pneumonia.
Termos de indexao: Sunos, Pasteurella multocida, genes tad, pneumonia suna.

1Recebido em .........................................

Aceito para publicao em ..................................................

2Laboratrio de Microbiologia e Biologia Molecular Veterinria. Departamento de Clnica Mdica Veterinria do
Hospital Veterinrio da UFMT. Av. Fernando Corra da Costa, n 2367. Bairro Boa Esperana, Cuiab, Mato
Grosso, Brasil. CEP: 78060-900.

3Embrapa Sunos e Aves. Rodovia BR 153, Km 110, Concrdia SC. CEP 89700-000.

* Autor para correspondncia: valdutra@ufmt.br

Valria Dutra 13/2/14 20:56

Deleted: submetidos criao

INTRODUO

Pasteurella multocida (P. multocida) um bacilo gram-negativo capaz de causar doenas em vrias
espcies, levando a perdas econmicas, especialmente associadas s indstrias de processamento de produtos
de origem animal, no mundo todo (Borowski 2001, Ribeiro et al. 2012). Esta bactria transmitida por pequenas
quantidades de partculas suspensas no ar e pelo contato direto com animais doentes, sendo capaz de causar
patologias como o clera avirio, septicemia e pneumonia em bovinos, rinite atrfica progressiva, pleurisia e
pneumonia em sunos (Boyce et al. 2010). Uma vez que faz parte da microbiota da mucosa oral de ces e gatos,
casos de pasteurelose em humanos so geralmente associadas ao contato com esses animais, atravs de
mordeduras (Collins et al. 2012,Nagata et al. 2013,Nguefack et al. 2014).
So descritos cinco sorotipos: A,B, D, E e F de acordo com os antgenos capsulares (Dziva et al. 2008),
sendo geralmente associado, mas no restrito, a um hospedeiro especfico (Armungam et al. 2011). Diferentes
tcnicas de genotipificao tem sido utilizadas para classificar este microrganismo, como o RAPD (Lee et al.
2012) e MLST (Silva et al. 2012, Bisgaard et al. 2013). Dada a importncia econmica desta bactria,
principalmente em sistemas de produo de sunos, seus fatores de virulncia tm sido amplamente estudados.
Dentre eles, a toxina PMT, geralmente associada amostras toxignicas e que com outras bactrias como a
Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) so responsveis por causar rinite atrfica nos sunos (Bckstrm et
al. 1988, Ahn et al. 2008). So descritos os genes exbB/tonBe hgbA envolvidos no seqestro de ferro, os genes
codificadores da neuraminidase (nanB e nanH), fmbria do tipo IV e protenas de membrana externa (OMP e
Oma87) (Ruffolo& Alder 1996, Bethe et al. 2009) e dez genes associados a utilizao de L-fucose( Johnson et al.
2013).
Os genes tad so essenciais para formao de biofilme em vrios gneros, como Aggregatibacter,
Haemophilus, Pasteurella, Pseudomonas, YersiniaeCaulobacter (Tomichet al. 2007). Com seu lcus gnico
composto por flp1, flp2, tadV, rcpC, rcpA, rcpB, tadZ, tadA, tadB, tadC, tadD, tadE, tad F e tadG ou apenas flp-rcp-
tad, tem sido implicado na patognese de diversos gneros bacterianos (Tomich et al. 2007). Schreineret al.
(2003) relatam que a mutao nos genes flp-1 e tadA causaram a perda na virulncia de amostras patognicas
oriundas de humanos, na regio da cavidade oral. Harper et al. (2006) e Tang et al. (2009) citam o tadD como um
fator de patogenicidade crucial aderncias em substratos (tecidos ou materiais) e formao de biofilme em P.
multocida.
O objetivo deste trabalho foi analisar a ocorrncia dos genes tad em isolados de P. multocida de
pneumonias de sunos e da microbiota de pulmes sem leso.

MATERIAIS E MTODOS:

Amostras

Foram coletados 100 pulmes com leses macroscpicas de pneumonia (consolidao pulmonar,
deposio de fibrina, pleurisia e/ou aderncia) e 100 pulmes sem leses macroscpicas em frigorficos de
Inspeo Federal entre 2010 e 2012. Os isolados de P. multocida foram confirmados bioquimicamente pelos
testes da catalase, oxidade, urease, Triple Sugar Iron (TSI) e os acares: glicose, sacarose, lactose, maltose e
manitol (Quinn et al. 1994).

Extrao de DNA e PCR especfico para P. multocida e sorotipos dos isolados

O DNA foi extrado, seguindo o protocolo de fenol/clorofrmio (Sambrook& Russel 2004). A PCR foi
realizada a partir do proposto por Townsed et al. (2001) (volume final de 20 l, 20 ng de DNA, 2.4 mM de MgCl2,
10X de Taq Buffer com 50 mM de KCl, , 20 pmol de cada oligonucleotdeo, 0,2 mMde dNTPs e 1 U TaqDNA
polimerase). A PCR foi realizada em termociclador (BIO-RAD MyCyclerThermalCycler), com desnaturao inicial
por 5 minutos 95C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos para desnaturao 95C, 30 segundos de
anelamento 54C e 60 segundos de extenso 72C, seguidos por um ciclo de extenso final por 7 minutos
72C. Como controle positivo foi utilizado um isolado de P. multocida, confirmado por sequenciamento do gene
kmt1 e controle negativo gua ultrapura. Os produtos de amplificao foram analisados em eletroforese em gel
agarose 2,0%, corados com Gel Red(Biotium), 100 V por cm, e observados em
ChemiDoc XRS utilizando o software ImageLab, que resulta em um produto de amplificao de 460 pb para o
gene kmt1de P. multocida. Como marcador de massa molecular utilizou-se o padro 100 pb DNA Ladder
(Fermentas).

PCR para os genes tad

Para anlise da presena dos genes tad, foram desenhadas sete sequencias de primers, sendo o tadA,
tadB, tadC, tadD, tadE, tadF e tadG (Quadro1).Todos os primers foram desenhados com base na sequencia da

Valria Dutra 13/2/14 21:03

Deleted: Tambm

luc 13/2/14 21:59

Deleted: .

Valria Dutra 13/2/14 21:09

Comment [1]: ??????

luc 13/2/14 21:59

Deleted: (

luc 13/2/14 21:59

Deleted: sequenciou sequenciaram e
analisaram dois genomas de amostras
patognicas de P. multocida (cepas P1059 e X73)
e os realizaram a comparou comparao com o
genoma de de um uma isolado amostra no
patognicoa (cepa PM70). , identificando uma
regio encontrada nas amostras patognicas que
no foi encontrada na amostra no patognica.
Trata-se da regio L-fucose responsvel pelo
metabolismo de carboidratos, fundamentais aos
processos bacterianos para aquisio de energia
em ambiente de baixa disponibilidade de
nutrientes, como o trato respiratrio. Ainda neste
mesmo estudo, foram identificadas protenas
expressas nas amostras patognicas associadas
membrana (Protena precursora da ativao da
hemolisina, Protena de membrana externa
receptora do transporte de ferro, LspB, PfhB3,
Opa e SprT), que no foram encontradas na
amostra no patognica, sugerindo ser um fator
de virulncia.

Valria Dutra 13/2/14 21:10

Deleted: e

Valria Dutra 13/2/14 21:11

Deleted: Desta forma, o

Valria Dutra 13/2/14 21:11

Deleted: o

Valria Dutra 13/2/14 21:19

Comment [2]: esqueci desse PCR dos sorotipos

Valria Dutra 13/2/14 21:12

Deleted: 20

amostra de P. multocida PM36950 (acesso ao GenBank- CP003022) utilizando a ferramenta primer-BLAST

(disponvel em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).
A amplificao dos genes atravs da PCR foi realizada em um volume final de 20 l, contendo 30 ng de
DNA, 20 pmol de cada oligonucleotdeo, 2,5mM de MgCl2, 1,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 1x de taq
buffer com 50 mM de KCl, 0,2 mM de cada dNTPe gua ultra pura q.s.p. Como controle positivo foi utilizado um
isolado de P. multocida e controle negativo, de gua ultra pura. Os produtos de amplificao foram analisados
em eletroforese em gel agarose 2,0%, corados com Gel Red (Biotium), 100 V por cm e observados em
ChemiDoc XRS utilizando o software ImageLab.

Anlise estatstica

Foi utilizado o teste de qui-quadrado utilizando o software disponibilizado em
http://statpages.org/ctab2x2.html, e o quadro de anlise de contingncia (2x2) para anlise de associao entre
presena de leso e a presena dos genes tad nos isolados de P. multocida. Foram admitidas as associaes cujo
valor de p seja <0,005 e utilizado a correo de Yates para maior acurcia dos dados.

RESULTADOS

Foram obtidos 70 isolados identificados pelos testes bioqumicos e amplificao do gene kmt1 especifico
para P. multocida. Destes, 67 (67/70) isolados eram de pulmes que apresentavam alteraes macroscpicas. e
apenas trs isolados (3/70) foram isolados dos pulmes sem leses.
Na tipificao capsular, 85,71% (60/70) das amostras de P. multocida foram positivas para o sorotipo
capsular A e 14,29% para o sorotipo D (10/70). O sorotipo A foi predominante em pulmes com leses (60/67) e
em pulmes sem leses observou-se somente o sorotipo D (3/3) (Quadro 1).

Em relao ocorrncia dos genes tad em isolados com lesoes, 89,55% (60/67) dos isolados
apresentaram amplificao para os genes tadA, tadB, tadC, tadD, tadE, tadF e tadG, sendo todos do sorotipo A O
nico gene que no amplificou nas amostras com leso foi o gene tadD em 10,45% (7/67) amostras e estas
pertenciam ao sorotipo D.
J as trs amostras provenientes de pulmes sem leso tiveram variaes em seus perfis de
amplificaes. Os genes tadA, tadB, tadC estava presente em 100% (3/3) das amostras. De forma contraria, o gene
tadD estava ausente em todas. Os genes tadE, tadF e tadG estavam presente em 33,3%, 33,3% e 66,6% das
amostras de P. Multocida isloadada de pulmo sem leses.
Pela anlise do teste qui-quadrado, foi observada a associao existente entre a presena de leso e a
ocorrncia de genes tadD(p<0,01), tadE (p<0,001%) e tadF(p<0,001%).

DISCUSSO

Pasteurelose uma das doenas mais comuns em sunos de crescimento e terminao em todo o mundo.
Amostras toxignicas capazes de desencadear a rinite atrfica progressiva (RAP) so mais associadas aos
sorotipos D que ao sorotipo A (Amigot et al. 1998). Enquanto isolados de pneumonia geralmente no so
toxignicos e podem apresentar os tipos capsulares A e D, sendo o A mais encontrado (Ewers et al. 2006, Bethe et
al. 2009). Destacam-se os maiores ndices encontrados em pulmes com leses de pneumonia associados ao
sorotipo A, em vrios pases como o Reino Unido (82,2%), Alemanha (53,4%) e Coria do Sul (56,6%) (Davies et
al. 2003,Ahn et al. 2008,Bethe et al. 2009). Tang et al. (2009) relatam a presena do sorotipo capsular A em
apenas 39,5% das amostrasde um total de 233 isolados de P. multocida obtidos de pulmes de sunos com
doena clnica respiratria, na China. Ainda neste mesmo estudo, o sorotipo D foi identificado em 54,9% das
amostras. Provavelmente esses valores se devem ao fato de neste estudo terem sido utilizados isoladosde vrios
locais do trato respiratrio, ao contrrio dos demais estudos que analisaram apenas isolados pulmonares. No
Brasil os ndices do sorotipo A encontrados, variam entre 89,4% (Moreno et al. 2003)a 95,5% (Borowski et al.
2002), ndices similares encontrados em nosso estudo (85,71%).
Os fatores de virulncia da famlia Pasteurellaceae so amplamente estudados. Nestes, estoinclusos, as
adesinas (filamentos de hemaglutinina, fmbria do tipo IV e Flppili), toxinas (dermonecrtica, associada B.
Bronchiseptica em quadros de rinite atrfica), siderforos (que fazem o seqestro de ferro do hospedeiro),
sialidases (que podem aumentar a patogenicidade bacteriana por alterar sua relao com receptores, reduzindo
assim a eficcia das defesas do hospedeiro) e protenas de membrana externa, que fazem a proteo da bactria
contra o sistema imune do hospedeiro (OmpA, OmpH, Oma87 e PlpB) (Harper et al. 2006).
A capacidade de formar biofilme aumenta a patogenicidade bacteriana, pois impede a ao de
antimicrobianos e do sistema monoctico fagocitrio (Donlan&Conserton 2002).O tadlcus pertence ao grupo
das adesinas e composto por 14 genes, sendo eles o flp-1flp-2tadVrcpCABtadZABCDEFG, sendo responsvel
pela aderncia e formao de biofilme em vrias espcies patognicas, como o Actinobacillus
actinomicetecomytans, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa e

Valria Dutra 13/2/14 21:13

Deleted: 2l

Valria Dutra 13/2/14 21:16

Formatted: Font:Italic
Valria Dutra 13/2/14 21:16
Deleted: .

Valria Dutra 13/2/14 21:17

Deleted: confirmados

Valria Dutra 13/2/14 21:17

Deleted: a

Valria Dutra 13/2/14 21:17

Deleted: bioqumica

luc 13/2/14 22:06

Deleted: (67/70)

luc 13/2/14 22:08

Deleted: (consolidao pulmonar, deposio
de
... [1]

luc 13/2/14 22:09

Deleted: Dos 100 pulmes sem leso analisados,
... [2]

luc 13/2/14 22:21

Deleted: 100

luc 13/2/14 22:10

Deleted: Sessenta

luc 13/2/14 23:07

Deleted: (60/70)

luc 13/2/14 23:08

Deleted: dez

luc 13/2/14 22:25

Deleted: 2

luc 13/2/14 22:56

Deleted: todos os isolados do sorotipo A

... [3]

luc 13/2/14 23:15

Deleted: .

luc 13/2/14 23:03

Deleted: Nenhum isolado do sorotipo D (0/10)
... [4]

luc 13/2/14 23:03

Deleted: As sete amostras deste sorotipo ... [5]

luc 13/2/14 23:33

Deleted: A amostra 16A foi positiva para o...
s [6]

luc 13/2/14 23:34

Deleted: ,

luc 13/2/14 23:36

Deleted: ; a amostra 17A foi positiva para o
...s [7]

luc 13/2/14 22:37

Deleted: avaliada

luc 13/2/14 22:28

Deleted: s variveis

Valria Dutra 13/2/14 21:31

Comment [3]: amostra de penumonia???

luc 13/2/14 22:31

Deleted: x

luc 13/2/14 22:33

Deleted: (Quadro 3), leso x genes

luc 13/2/14 22:33

Deleted: (Quadro 4) e leso x genes

luc 13/2/14 22:39

Deleted: (Quadro 5). Baseando-se no quadro
... [8]de

Bordetella pertussis(Kachlany et al. 2000, Tomich et al. 2007, Bernard et al. 2009, Schilling et al. 2010,). Em
contrapartida, o gene tad tambm encontrado em bactrias no patognicas, como o Caulobacter crescentus e
Chlorobium spp., mas nestas espcies este aparato utilizado para adeso e fixao em substratos ambientais
(Tomich et al. 2007).
Ao menos 12 genes do lcus tad so requeridos para a formao de todos os fentipos relacionados
aderncia, incluindo a produo do Flp pili, morfologia rugosa das colnias, auto agregao e formao de
biofilme (Tomich et al. 2007). Harper et al. (2006), citam que as fmbrias e adesinas so fundamentais para a
aderncia em clulas do hospedeiro e que o tadD atua codificando um aparato de secreo requerido para a
formao do Flp pili. Fuller et al. (2000) demonstraram que mutaes no tadD de P. multocida afetam seu
potencial de aderncia, concordando com nossos resultados, onde o tadD foi encontrado em todas as amostras
oriundas de pulmes com leso (67/67) e foi ausente nas amostras sem leso (0/3).
Tang et al. (2009) analisando 233 isolados de P. multocida de leses pulmonares e rinite atrfica
obtiveram 101 (43,3%) dos isolados positivos para tadD. Destas amostras a maioria era sorotipo A (92,4%) e
associado pneumonia, sendo apenas 10,2% pertencente ao sorotipo D. Esses dados se assemelham ao nosso
estudo, onde 60 (85,71%; 60/70) isolados foram positivos para o gene tadD, sendo todos pertencentes ao
sorotipo A e ao grupo com leses. Das 10 amostras negativas para o tadD, todas pertenciam ao sorotipo D sendo
sete (70%) isolados oriundos do grupo com leso.
A expresso dos genes de aderncia em A. actinomycetecomintans, tambm influenciada por fatores
ambientais, sendo inibida em condies de baixa tenso de O2 e em meios ricos em nutrientes (Tomich et al.
2007).
Bhattacharjee et al. (2001) relatam que o tadA1 responsvel pela codificao da ATPase em A.
actinomycetecomitans, sendo responsvel pela disponibilizao de energia para este sistema. Pela similaridade
dessas regies, provvel que na P. multocida exera a mesma funo essencial, justificando a presena desta
regio em todas as amostras analisadas em nosso estudo, inclusive nas amostras sem leso.
Em A. actinomycetecomitansos tadE e tadF so codificados pelo tadZ e conhecidos por pseudopilins,
sendo que mutaes nessas regies no tiveram efeitos na sntese de biofilme, indicando que provavelmente
essas regies apresentem funes variadas (Tomich et al., 2006). Nos isolados do nosso estudo a apresentao
destas regies foi aleatria, onde apenas 2 amostras no as apresentou (17A e 18A), sendo ambos isolados de
pulmes sem leso.
A formao de novas variantes genticas um pr-requisito para a evoluo bacteriana (Boyce et al.
2010). Acredita-se que os genes tad surgiram atravs da necessidade de adaptao bacteriana ao hospedeiro,
atravs de trocas horizontais de materiais genticos, formando uma ilha Genmica (Hacker & Kaper 2000). Juhas
et al. (2009) citam que a formao dessas ilhas podem ter surgido de vrias formas como plasmdeos,
transpossons e bacterioides. Anlises das -proteobactrias, incluindo a famlia Pasteurellaceae, indicam que a
transferncia horizontal dessas ilhas pode ocorrer entre famlias prximas e estudos indicam que existe uma
grande disperso entre os procariotos (Planet et al. 2003). Provavelmente esses genes foram adquiridos de um
ancestral comum (o que hoje representaria a famlia Rhizobiaceae), que no era requerido para a patognese em
humanos e animais, mas sim para uma melhor fixao ambiental (Planet et al. 2003). A apresentao desse tipo
de aparato fundamental para a fixao e sobrevivncia bacteriana. Planet et al. (2003) avaliaram o potencial de
aderncia associado ao gene tad em A. actinomicetecomitans, utilizando um transposson em um isolado so
aderente (CU1000N). Os mutantes foram incapazes de gerar colnias aderentes e avaliao (comparao de
filogenia das bactrias que apresentavam o lcus gnico tad, anlise de congruncia e tcnicas de rvores de
conciliao Mxima Parsimnia) dos possveis genes homlogos para identificar a transferncia horizontal
deles, confirmou-se que se trata de um gene com histria evolucionria comum a vrios gneros (Yersinia,
Pasteurella, Actinobacillus, entre outros).
Atualmente aceita e vastamente utilizada para comparao com genes homlogos em outras bactrias,
a nomenclatura do lcus gnico tad, proposta para Aggregatibacter(Actinobacillus) actinomycetemcomitans, onde
se inclui os genes: flp-1-flp-2-tadV-rcpCAB-tadZABCDEFG (tomich et al. 2007, Planet et al. 2003,Schreiner et al.
2003). As sequencias nucleotdicasflp-1 codificam o maior componente estrutural do Flppili (Inoueet al. 2000) e
mutaes nesta regio desencadeiam em formaes de bactrias com virulncia reduzida (Tomich et al. 2007).
Os genes tad so requeridos para a formao de biofilme em vrias espcies, inclusive em P. multocida. A
ausncia de amplificao de parte desses genes (no caso o tadD, tadE e tadF) apresentou correlao estatstica
com a ausncia de leso, sendo portanto associado esta condio. Provavelmente as amostras de pulmes sem
leso sejam comensais, uma vez que a apresentao destes genes de virulncia essenciais formao do biofilme
no foram demonstradas.
Concluso????
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao CNPq e Fapemat, pelo financiamento do projeto e a Capes pela bolsa concedida.

Valria Dutra 13/2/14 21:33

Comment [4]: ??? como se pode afirmar isso?

Valria Dutra 13/2/14 21:33

Deleted: corroborando

Valria Dutra 13/2/14 21:35

Deleted: o que conhecido por I

Valria Dutra 13/2/14 21:35

Deleted:

Valria Dutra 13/2/14 21:35

Deleted: Ilhas Genmicas

Valria Dutra 13/2/14 21:36

Deleted: ,

Valria Dutra 13/2/14 21:36

Deleted: entre outros.

Valria Dutra 13/2/14 21:36

Deleted: ilhas

Valria Dutra 13/2/14 21:37

Comment [5]: ??????

Valria Dutra 13/2/14 21:38

Comment [6]: o que isso?

Referncias bibliogrficas:

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in
the
study
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the
TightAdherence
(tad)
locus
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Quadro1 - Relao geral das amostras de P. multocida com o sorotipo, leso e tadgene
Isolado
M305/09
M135/10
M142/10
M150/10
M152/10
M153/10
M154/10
M155/10
M158/10
M159/10
M160/10
M161/10
M162/10
M163/10
M164/10
M165/10
M166/10
M167/10
M171/10
M173/10
M174/10
M175/10
RS/G09/02
MT/G04/03
MG/F01/01
MG/F01/02
MG/F01/03
MG/F08/01
MS/F08/01
MTF04/01
MTF02/02
MTF03/02
MTF06/02
MTG05/01
MTF01/01
MTF03/01
MTF01/02
MTF02/01
MTF03/02
MTG04/02
1B
2B
3B
6B
11B
12B
13B
14B
15B
16A
16B
17A
17B
18A

Sorotipo
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
D
D
D
D
D
D
D
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
D
A
D
A
D

tadD
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-
-
-
-
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-
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+
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+
-
+
-
+
-

Leso
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Ausente

tadA tadB tadC tadE tadF

+
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-
-
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-
-

tadG
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+
-
+
+

luc 13/2/14 22:24

Comment [7]: Colocar na ordem A,B,C, D..

luc 13/2/14 22:23

Deleted: TAD D

luc 13/2/14 22:23

Formatted: Font:Italic
luc 13/2/14 22:23
Formatted: Font:Italic
luc 13/2/14 22:24
Formatted: Font:Italic

20B
25B
26B
27B
28B
31B
32B
33B
35B
41B
43B
44B
45B
46B
47B
48B

A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
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+

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+
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+

Quadro2 - Sequencia dos primers do TAD gene e suas respectivas alturas de amplificao
TAD
TAD A1
TAD B
TAD C
TAD D
TAD E
TAD F
TAD G

Sequencia do primer
Foward: GGTCGCATCACGAGGACTAT
Reverse: AGGCGAAATTACGATGCAAG
Forward: TTCGCCTAATTGTCCCGTTA
Reverse: TGGAAGTTAGGGCAATACCG
Forward: GTGACCAAAAGCTTCACACG
Reverse: GGGATTGCAGTTTTGCTGAT
Foward: TCGCAACCGCTAATCGACAA
Reverse: GCGGCTTTAAAACAAGTGGC
Foward: TGGATTCGTCCCAAGAGAAC
Reverse: ATCTCTCCTACGGGGAGTCG
Foward: GATCTAATCAGCCCCGTTGA
Reverse: TATCATTGGCGATTGTACGC
Foward: AACTTGCCCAATTGTTCTCG
Reverse: CCTTCTGGTTGGACTTCTGC

Altura
amplificao
172 pb
150 pb
221 pb
1274 pb
195 pb
183 pb
224 pb

da

luc 14/2/14 10:53

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Deleted: Quadro3Associao entre presena

de leso pulmonar e a presena do gene tadD
em isolados de P. multocida.
Presena de Leso
... [9]

lesao
sem lesoa

tadA

tadB

tadC

tadD*

tadE*

tadF*

tadG

Figura 1: Percentual de occurrence de genes tad em isolados de P. multocida de pulmes e sem
leses macroscopicas. Os genes marcados com * apresentam

luc 14/2/14 10:55

Formatted: Tabs: 2,56 cm, Left