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Mtodos de Separao em Qumica- Prtica IV

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA UESB


DEPARTAMENTO DE CINCIAS EXATAS E NATURAIS DCEN
COLEGIADO DO CURSO DE QUMICA

OTIMIZAO E VALIDAO DA SEPARAO CROMATOGRFICA

Relatrio
de
aula
prtica
apresentado Prof.. Dr. Dbora
Santana como avaliao parcial da
disciplina Mtodos de Separao
em Qumica.
Discentes: Isaas Silva; Mateus
Duarte; Paulo Henrique; Poliana
Fernandes Oliveira.

ITAPETINGA-BA
Dezembro/2014

Mtodos de Separao em Qumica- Prtica IV

INTRODUO
Segundo1, a cromatografia lquida uma tcnica importante, pois a maioria dos
compostos no so suficientemente volteis para cromatografia gasosa. A cromatografia
lquida de alta eficincia (CLAE) um tipo de cromatografia onde o solvente empurrado
pelas dimenses da coluna que recheada de partculas muito pequenas, o que proporciona
uma separao muito eficiente. Utiliza-se uma presso para ajudar a passagem do solvente
pelo interior na coluna.
Para uso dessa tcnica de separao necessrio ter um sistema adequado, que
composto por um sistema de distribuio de solvente, uma vlvula de injeo de amostra, uma
coluna de alta presso, um detector e um computador para controlar o sistema e apresentao
dos resultados.

Figura

Equipamento

para

cromatografia

lquida

de

alta

eficincia

(CLAE).

(http://www.shimadzu.com.br/analitica/produtos/hplc/lc-20a_prominence.shtml)

Para1 a eficincia de uma coluna aumenta com a diminuio do tamanho das partculas
da fase estacionria, sendo que a eficincia de uma coluna est tambm relacionada com o
aumento da quantidade de pratos e a diminuio da altura dos pratos, podendo ser obtidos
picos mais estreitos nos grficos que mostram as respostas do detector em funo do tempo de
eluio, no qual denominamos cromatograma. Um dos parmetros utilizados nos clculos
deste trabalho o tempo de reteno, que o tempo necessrio, a partir da injeo da mistura
na coluna, para que cada componente alcance o detector, sendo que, quanto maior a interao
com fase estacionrio, maior ser o tempo de reteno, e em contrapartida, quanto menor a
interao de um composto com a fase estacionrio, menor ser o seu tempo de reteno, e
consequentemente, moveras mais rpido pela coluna.
O fator de reteno (K), em um experimento pode ser calculado a partir da seguinte
frmula:

Mtodos de Separao em Qumica- Prtica IV

(t r t m )
Equao 1
tm

Onde (tr) o tempo de reteno do soluto de interesse e (tm) o tempo de reteno do


soluto que no retido.
Segundo1, em uma cromatografia possui-se tambm a medida quantitativa da
separao de dois picos adjacentes, na qual denominamos de resoluo, a resoluo em uma
separao pode ser calculada a partir da equao abaixo:

Rs

t r
Equao 2
(Wmd )

Sendo (tr) a diferena nos tempos de reteno e (Wmd) a largura mdia medida na
linha-base nas mesmas unidades que o numerador (tempo ou volume).
Para2 outros dois fatores podem influenciar na resoluo cromatogrfica, sendo o
nmero de pratos tericos (N) e a seletividade (), onde esses fatores so diretamente afetados
pelas condies: tipo de coluna, temperatura, deteco, fluxo, e quantidade de amostra. N e ,
podem ser calculados com as frmulas abaixo:
2

16.t r
(W 2 )

Equao 3

t rb t m
t ra t m

Equao 4

Onde, (tr) o tempo de reteno, (W) a largura da base do pico e (tm) o tempo morto e
(b) o soluto mais retido.

MATERIAIS E MTODOS
Instrumentos e Materiais Utilizados
01 Cromatografia lquido de alta eficincia Shimadzu, com sistema quaternrio de
solventes, vlvula de injeo com ala de amostragem de 20L, forno de coluna e
detector de arranjo de diodos;
01 coluna C18 Thermo Hypersil ODS (4,6 x 150mm, 5);
02 bqueres 50 mL;
01 balo volumtrico de 10 mL;
Seringa;
Filtro de Seringa;
Micropipeta.

Mtodos de Separao em Qumica- Prtica IV

Reagentes Utilizados
Padro de cido vanlico;
Padro de cido serngico;
Aceto nitrila;
gua destilada;
Soluo stock.
Procedimento Experimental
Foram realizados os seguintes procedimentos, que sero descritos a seguir:
1: Foi realizado o clculo de diluio:

As amostra iniciais tinha 2000 ppm, e foram diludas a 2 ppm, em uma micro vidraria
de 10 ml, dessa maneira utilizado 0,010 ml do analito;

As amostras foram aferidas com a fase mvel, no caso aceto nitrila.

2: Adequaes no equipamento (HPLC):

O equipamento foi ligado;

Observou-se os reservatrios da fase mvel, para saber o nvel;

Colocou-se para purgar a bomba dos recipientes A e B (Isopropanol e Aceto nitrila),


para que sassem todas as bolhas;

Foi colocado um tempo de corrida de 20 min;

Foi utilizado o mtodo File;

O fluxo utilizado foi 1ml/min.

3: Injeo de amostras:

Injetou-se a amostra e no foi possvel obter resultados conclusivos;

Injetou-se a soluo stock e se obteve resultados satisfatrios.

4: Otimizao do processo:

Foi aumentado o tempo de corrida para 5 min;

Diminuiu o ngulo de inclinao do gradiente;

Diminuiu o fluxo 5mL/min para 2ml/min;

Aumentou as concentraes dos analitos;

Alterou o modo gradiente para isocrtico (95:5);

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Aps o procedimento citado anteriormente, foi alterando a proporo da fase mvel


para: (90:10);

RESULTADOS E DISCUSSO
Durante a realizao dessa pratica foi tomado como principio um fluxo inicial de
1mL/min para os padres estabelecidos de cido Vanlico e cido Sirngico, nesse processo
obteve-se os seguinte dados como demostra nos cromatograma da figura-1 e da figura-2 foi
estabelecido 2mL/min, o que permitiu realizar a otimizao da analise cromatogrfica, de
acordo os clculos de resoluo-Rs, e a parir da dai determinar o trs principais pontos que
influenciam a resoluo cromatogrfica: o numero de pratos tericos (N), fator de reteno
(K) e seletividade (a). Esses fatores por sua vez so afetados pelas variveis cromatogrficas
como tipo de coluna, temperatura, deteco, fluxo e quantidade de amostra, aqui foram
analisados apenas a varivel correspondente ao fluxo.

uV
4000000

3500000

3000000

2500000

2000000

1500000

1000000

500000

0
0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00 min

Figura 1: Cromatograma de padres cido vanlico (rosa) e cido sirngico (azul), 100 % aceto nitrila
-1

fluxo 1,0 mL min .

Cromatograma-1

Tr

Tr1

Vanlico

1,544

1,368

Sirngico

1,599

1,473

Tm

0,5

Rs

1,721 0,353

306,10

2,088

1,052

0,1818

1,725 0,252

644,192

2,198

1,052

0,1818

Tr2

Wb

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ANALISE DO 1 CROMATOGRAMA PARA O PADRO CIDO VANLICOFLUXO DE 1mL/min


Numero de pratos

Fator de reteno

Seletividade

Resoluo

tericos:

,088

ANALISE DO 1 CROMATOGRAMA PARA O PADRO CIDO SIRNGICOFLUXO DE 1mL/ min.


Numero de pratos
tericos:

Fator de reteno

Seletividade

Resoluo

uV
4000000

3500000

3000000

2500000

2000000

1500000

1000000

500000

0
0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

min

Figura 2: Cromatograma de padres cido vanlico (rosa) e cido sirngico (azul) 100 % aceto nitrila
-1
fluxo 2,0 mL min

Mtodos de Separao em Qumica- Prtica IV

Cromatograma-2

Tr

Tr1

Tr2

Wb

Rs

Vanlico

0,804

0,703

0,906

0,203

250,98

0,608

1,026

0,0455

Sirngico

0,812

0,738

0,886

0,148

481,62

0,624

1,026

0,0455

Tm

0,5

ANALISE DO 2 CROMATOGRAMA PARA O PADRO CIDO VANLICOFLUXO DE 2mL/min


Numero de pratos
tericos:

Fator de reteno

Seletividade

Resoluo

08

ANALISE DO 2 CROMATOGRAMA PARA O PADRO CIDO SIRNGICOFLUXO DE 2mL/min


Numero de pratos
tericos:

Fator de reteno

Seletividade

Resoluo

Discusso: Os dados aqui discutidos esto nas tabelas descritas cima, sendo que
alguns dados no foram descritos, mas esto subtendidos nas tabelas, tais como tempo de
reteno e tempo morto.
Desempenho do cido vinlico em comparao com a eficincia no cromatografo-1
com fluxo de 1mL/min e no cromatografo-2 com fluxo de 2 mL/min. Como podemos

Mtodos de Separao em Qumica- Prtica IV

observar essa amostra no cromatografo-1 obteve um numero de pratos tericos de 306,10 e


no cromatografo-2 um numero de 250,98, diante desses dados segundo2, a eficincia
cromatogrfica aumenta medida que o nmero de pratos se torna maior, conforme a altura
do prato H torna-se menor. Esses mesmos critrios podem ser observados no desempenho em
do cido Sirngico, o qual apresentou um numero de pratos tericos no cromatografo-1 de
644,192 e no cromatografo-2 de 481,62.
Outra caracterstica a ser discutida, est relacionada ao fator de reteno, o qual um
parmetro experimental importante amplamente empregado na comparao das velocidades
de migrao de solutos em colunas. Dessa forma, as separaes so realizadas sob condies
nas quais os fatores de reteno para solutos na mistura situam-se na faixa de 1 a 5. Diante
disso os fatores de reteno na cromatografia lquida podem ser manipulados para fornecer
melhores separaes por meio da variao da composio das fases mvel e estacionaria1. No
caso dos dois cromatogramas analisados, podemos identificar que o cido Vanlico no
cromatograma-1 teve um fator de reteno igual a k=2,088 j no cromatograma-2 teve um
fator de reteno k= 0,608, de forma semelhante o cido Sirngico, teve no primeiro passo o
valor de k=2,198 j no segundo passo k= 0,624, de modo geral esses valores indicam que a
que o cromatogram-1 estava dentro dos padres estabelecido de 1 a 5.
O fator de seletividade encontrado nos cromatograma-1 e 2 indica a medida da
capacidade de separao de duas substncias definido como segue: Se duas substncias no
podem ser separadas, ento = 1 e a coeluio ocorre. 1Quanto maior o valor de , melhor a
separao, entretanto, se aumenta, o tempo requerido para a separao tambm aumenta,
sendo que na prtica, os coeficientes de seletividade so ideais quando so prximos de 1.5.
Esses dados nos mostram que o coeficiente que apresentou um melhor desempenho foi o
cromatogama-1 uma vez que seus picos foram mais bem separados, estando entre o valor
determinado pela literatura.
A resoluo Rs de uma coluna nos diz2 quanto duas bandas se distanciam uma em
relao outra em comparao com as suas larguras. A resoluo fornece uma medida
quantitativa da habilidade da coluna em separar dois analitos. evidente, que uma resoluo
de 1,5 fornece uma separao essencialmente completa entre compostos A e B, enquanto
uma resoluo de 0,75 no o faz. A uma resoluo de 1,0, a zona de A contm
aproximadamente 4% de B e a zona de B, aproximadamente 4% de A. A uma resoluo de
1,5, a sobreposio aproximadamente de 0,3%. A resoluo para uma dada fase estacionria
pode ser melhorada aumentando se o comprimento da coluna e, dessa forma, o nmero de
pratos. Uma consequncia adversa do aumento no nmero de pratos, contudo, o acrscimo

Mtodos de Separao em Qumica- Prtica IV

no tempo requerido para a separao dos componentes. Diante dessa abordagem, segundo1,
quanto maior for resoluo melhor ser a separao entre dois picos, e dessa forma podemos
visualizar atravs dos dados, que o cromatogrma-1 apresentou um melhor desempenho em
relao ao cromatogama-2, uma vez que sua resoluo do 1 foi de Rs= 0,1818.
De modo geral, ao analisarmos os dois cromatogramas, verificamos a que o tempo de
reteno apresentou caractersticas peculiares, entretanto, podemos discutir algumas
mudanas significativas, segundo2, o tempo de reteno Tr o tempo decorrido entre a
injeo da amostra e o aparecimento do pico do soluto no detector de uma coluna
cromatogrfica, partindo dessa ideia notamos que quanto maior a diferena do tempo de
reteno entre dois compostos maior a eficincia da coluna, vejamos que o cromatogram-1
apresentou uma melhor separao entre os picos, j o cromatogama-2 quase coeluram.
Outro aspecto interessante a se discutir est relacionado ao fluxo, pois de inicio foi
utilizado um fluxo de 5mL/min no tendo bom resultados, depois foi utilizamos fluxos de
1mL/min e 2mL/min, que elucidaram dois cromatogramas diferentes, no primeiro gerou um
tempo de corrida mais demorado que no segundo, isso nos permite entender que, quando
aumenta o fluxo a corrida mais rpida, no entanto, corre se o risco de coeluir os compostos
(cromatograma-2), e se diminumos o fluxo a corrida fica mais demorada, como ilustra o
cromatogram-1.

CONCLUSO
Conclumos que a cromatografia lquida de alta eficincia um dos mais modernos mtodos
cromatogrficos, que se destaca entre os demais devido ao fato de ser capaz de quantificar
uma ampla variedade de compostos, e que o processo de injeo manual do analito na coluna
pode causar erros no cromatograma, o que pode ser minimizado com a automatizao do
processo. Alm disso, verificamos que quanto mais fortemente absorvida for uma substncia,
mais retida ela ficar, e quanto mais solvel for uma substncia, mais rapidamente ela vai se
mover dessa forma, de modo geral os dois cromatogramas analisados no apresentaram um
alto rendimento uma vez que seus valores que deveriam indicar uma boa separao no
ficaram dentro dos padres estabelecidos pela literatura, como exemplo o valor de Resoluo,
onde ambos os cromatogramas no tiveram to bom desempenho ficando muito distante do
valor de Rs=1,5, no entanto, o que podemos dizer diante dos dados e das analises feitas que
o cromatogafo-1 foi o que apresentou uma melhor eficincia de separao em relao ao
cramotograma-2, tendo um maior numero de pratos tericos, melhor fator de reteno, boa

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seletividade, melhor resoluo e assim conclumos que a metodologia proposta na pratica foi
alcanada, pois se determinou todos os parmetros que medem a eficincia de uma coluna.

REFERNCIA
1
2

HARRIS, D. C. Anlise Qumica Quantitativa, 7 edio, Rio de Janeiro: LTC, 2008.

SKOOG, D.A; West, D.M; Holler, F.J. & Stanley, R.C. Fundamentos da Qumica
Analtica, Traduo da 8 edio norte americana. So Paulo, Ed.Thomson, 2007.