1

Identification des
bactries
CM BIO 308

I. Gnralits sur la taxonomie

Taxonomie = Etude diversit des organismes

Classification

Nomenclature

Identification

Taxonomie
des
procaryotes:
(1)
classification
phntique
(=phnotypique), puis (2) classification numrique et actuellement (3)
classification phylogntique.

La meilleure taxonomie devrait tre POLYPHASIQUE:

Premire tape: rassembler les souches de mmes caractristiques

phnotypiques
Deuxime tape: similitudes phnotypiques confirmaient par homologie
gntique: %GC puis hybridation ADN / ADN.
2 souches appartiennent la mme espce si le % hybridation ADN/
ADN > 70% et un Tm < 5C (temprature de fusion). De mme une

diffrence dans le %GC < 3% (

% GC peuvent tre identiques sans

que les bactries soient proches do l utilisation hybridation ADN /

ADN).

A. Classifications
4

1-Classification physiologique - phntique

- Subjective et instable do autres classifications. MAIS:

- Complte lidentification molculaire (plus coteuse)
- Consiste comparer caractristiques souche identifier avec celles
dj rpertories pour souche(s) type(s) despces connues:

? Quels caractres choisir parmi les milliers disposition!

Savoir:
5
- lorigine du prlvement (cela permet de tester que certaines

caractristiques phnotypiques)
- On

travaille

sur

une

culture

pure:

Applicable

que

pour

microorganismes cultivables et croissance rapide.

- caractre instable (par mutation du gnome ou transfert gntique
(plasmide))

- Dure dincubation et taille de linoculum sont importants

- Avoir une connaissance large de la bactriologie et disciplines
associes (Une seule erreur peut fausser compltement lidentit)

Origine du prlvement

Type de produit

Selles

Urines
Prlvement gnital
Crachat

Sang (hmoculture)
Liquide Cphalo Rachidien (LCR)

Gorge

Quelles microorganismes possibles partir du

produit pathologique ou d'un isolement suppos fait
avec le produit pathologique?
en gnral on part d'un milieu slectif qui oriente le
diagnostic de faon vidente. Cas le plus frquent :
Salmonella- Shigella (Yersinia).
Entrobactries ou Enterococus (Pseudomonas).
Streptococcus agalactiae, (Listeria interdite),
Candida albicans, (Gonocoque)
Haemophilus, Streptococcus A ou pneumoniae,
Entrobactrie, Pseudomonas (mucoviscidose),
etc
Toutes les bactries et levures possibles !
Nourrisson : penser aux Entrobactries (E. coli)
sinon Haemophilus, Streptococus pneumoniae et
agalactiae, Neisseria (menig. Interdite), Cryptococcus
neoformans
en gnral orient (Streptococcus pyogenes)

2- Classification numrique ou adansonienne (Sneath, 1957)

chacun

des

caractres

pris

en

compte

(morphologiques,

mobilit,

biochimiques) est attribu la mme valeur cest--dire 1 quand la souche le

possde et 0 quand elle ne la pas.
Coefficient de similitude : a / (a + b + c)
et Coefficient dgalit : a + d / (a + b + c +
d)
a : caractres + dans la souche a et la souche
b
b : caractres + dans la souche a et dans la
souche b
c : caractres - dans la souche a et + dans la
souche b
d : caractres - dans la souche a et la souche b

3- Classification phylogntique ou molculaire

Classification moderne base essentiellement sur lanalyse des
acides nucliques (ADN et ARN)

Nombreuses mthodes et techniques:

- Mesure pourcentage GC (Guanine Cytosine)
- Hybridation ADN / ADN

- Squenage de lARN 16S

- Squenage gnome bactrien

Pourcentage CG

A 260nm

10

Hybridation ADN / ADN

11

ARN 16S = marqueur

phylogntique
- Domaines hautement
conservs

- Rgions hypervariables:
permettent un
discrimination interespces.

% homologie > 97%

= mme espce

12

Classification phylogntique actuelle des microorganismes

3 des 30 phyla que comptent les bactries qui seront tudis en TD:

P. Actinobacteria
O. Actinomyctales
Ss.O Micrococcineae (16 F)
F. Micrococcaceae (14 G) *
Ss.O Corynebacterineae (7 F)
F. Corynebacteriaceae (4 G)*

P. Firmicutes
O. Clostridiales (13 F)
F. Clostridiaceae (30 G) *
Cl. Bacilli
O. Bacillales (9 F)
F. Bacillaceae (52 G) *
F. Staphylococcaceae (5 G) *
F. Listeriaceae (2 G) *
O. Lactobacillales (6 F)
http://www.bacterio.net/-classifphyla.html
F. Enterococcaceae (7 G) *
F. Streptococcaceae (3 G) *

P. Proteobacteria
Cl. b-Proteobacteria
O. Neisseriales (1 F)
F. Neisseriaceae (33 G) *

Cl. g-Proteobacteria
O. enterobacteriales (1 F)
F. enterobacteriaceae (53 G) *
(G. Citrobacter, Enterobacter,
Escherichia, Klebsellia, Proteus,
Salmonella, Shigella, Yersinia, Serratia)

Cl. e- Proteobacteria
O. Campylobacteriales (3 F)
F. Campylobacteraceae (4 G) *
13 F. Helicobacteraceae (6 G) *

O. Pseudomonadales (2 F)
F. Moraxellaceae (8 G) *
(G.Acinetobacter, Branhamella)

F. Pseudomonadaceae (12 G) *
O. Vibrionales
F. Vibrionaceae (12 G) *
O. Pasteurellales (1F)
F. Pasteurellaceae (18G) *

14

Squenage du gnome bactrien

Amlioration des techniques (cot lev)

Comparaison des gnomes
Variabilit au niveau de la taille (1 5 Millions de

pb)
Autres classifications : chimiotaxonomie: structure chimique (lipides,

polysaccharides) de paroi, membrane + autres constituants cellulaires

Classification

gntique:

transferts

dADN,

recombinaison

bactries (conjugaison, transduction et transformation)

entre

B. Nomenclature
15

1-Dfinitions espces, souches et clones

Bactries sont rparties en catgories hirarchises: Familles, genres et espces

Espce bactrienne: cellules ayant des caractristiques similaires une

souche type mais prsentant une diffrence mineure(biovars, srovars)
mais significative avec les autres souches appartenant cette espce
Souche type: souche dsigne permettant lidentification des bactries.
En gnral est lune des premires souches tudie et souvent mieux
caractrise que les autres souches.
Ainsi, un ensemble de souches suffisamment
proches de la souche type sera inclut au sein de
la mme espce.

16

Espce bactrienne au sens phylogntique: rassemblement de

souches ayant un pourcentage dhybridation ADN / ADN >
70% ainsi quun Tm < 5C

Clone : ensemble dorganismes gntiquement identiques issus, par

multiplication vgtative, dun organisme parental unique

Certains bactriologistes emploient une dfinition proche pour dfinir

une souche: population dorganismes descendant dun organisme
unique ou dun isolat de culture pure.

Une souche est la sous-division dune espce et un clone

une population descendant dune mme souche

17

2- Ecriture

Escherichia: nom de Genre

coli: nom despce

On peut abrger si nom entier citer une fois dans le texte: E. coli
Noms familles, ordres: pas en italique mais majuscule: Enterobacteriaceae
- Pour dsigner toutes les espces dun genre: nom du Genre suivi de spp.
-Appartenance dune souche isole un genre (sans connaissance de
lespce et jusqu son identification): nom du Genre suivi de sp.

-Le rang de sous-espce est admis et not subsp (subspecies) suivi du nom
latin en italique. Exemple: Pasteurella multocida subsp. multocida
N.B: Sous-espce si le % de similarit est la limite de la rgle ou le caractre phnotypique trs
diffrent

C. Identification
18

connaissances des caractristiques distinguant familles, genres et espces de

bactries

Ainsi les bactries peuvent tre identifies grce :

- Morphologie: observations macroscopiques de colonie isole sur glose,

microscopiques: forme , regroupement)
- Mobilit
- Coloration de gram
- Observations de spores
- Caractres mtaboliques (biotype = biovar)
- Type respiratoire
- Typage: on dfinit des srotypes, lysotypes, antibiotypes

C. Identification
19

La notion de typage en bactriologie a un intrt pidmiologique.

(chane infectieuse dans un hpital ou intoxication alimentaire collective).

Techniques phnotypiques de typage:

Biotypage : tests sur diffrents types de sucres mtaboliss ...

Antibiotypages : Analyse plus ou moins complexe d'antibiogrammes.
Lysotypages : Etudes pour la sensibilit diffrents bactriophages.
Dvelopps pour quelques pathognes nosocomiaux (S. aureus, P.
aeruginosa,
et
Salmonella
spp.).
Srotypages : Fonde sur la prsence ou labsence de dterminants
antigniques cellulaires, flagellaires et capsulaires et de leur raction
avec des antiserums spcifiques. Exemple antignes O et H des
Entrobactries.

C. Identification
20

Des mthodes molculaires compltent ce typage :

Betsy Foxman et al.; Choosing an appropriate bacterial typing technique for epidemiologic studies ;
Epidemiol Perspect Innov. 2005; 2: 10.

Exemple de mthode:
Multi Locus SequenceTyping:

Mme application que lARN 16S mais

sur des gnes de mnages (=
constitutifs) qui sexpriment de faon
quasiment identique dans toutes les
cellules dorganismes quelque soit les
conditions
de culture.

II. Rappels sur la cellule procaryte

21

A. La cellule procaryote

Un procaryote est un tre vivant dont la structure cellulaire ne porte pas de noyau

Unique Chromosome circulaire

Peu dorganites:
Ribosomes, Inclusions (= vsicules de
stockage). PAS de golgi, RE, vsicules
Membrane plasmique + paroi (= forme
cellule).
PAS de Mitochondries de chloroplastes:
- Enzymes respiratoires
- Ex: Bactriochlorophylle (photoSse)
Localises dans la membrane plasmique
Prsence
ou
pas
selon
lespce
dappendices (flagelles, pili, fimbriae)
denveloppe (capsule), de plasmides

22

B. Composition en lments chimiques dune bactrie

95% du poids sec dune cellule est compos de quelques lments

majeurs : C, O, H, N, S, P, K+, Ca2+, Mg2+ et Fe2+
Composition lmentaire caractristique des cellules bactriennes :
C (50%)
O (20%)
N (14%)
H (8%)
P (3%)
S, Na et K (1% chacun)
Ca , Mg (0,5% chacun)
Fe (0,2%)
les oligolments (0,2% cumul)
La cellule a besoin denviron 30 lments.
Macro-, micro-lments, oligolments (lments traces : Co, Zn,
Mo, Cu, Mn, Ni, W, Se)

Importance:
Permet de dfinir la
composition chimique
dun milieu de culture:
O ils reprsentent les
besoins
lmentaires
Cf: CM nutrition
de Mme
GAINVORS-CLAISSE

III. Mtabolisme des bactries

23

A. Introduction

Le mtabolisme en gnral est lensemble des ractions chimiques

mises en jeu par un organisme pour se maintenir en vie.

Se compose de 2 mcanismes
opposs mais complmentaires:
-Celles qui produisent de
lnergie: catabolisme
-Celles qui consomment de
lnergie: anabolisme ou
biosynthse.

24

Toute bactrie est capable de synthtiser ses propres macromolcules et

constituants cellulaires partir de nutriments (gnralement des
molcules simples).
Les nutriments servent aussi de sources dnergie. Lnergie cellulaire est
ncessaire la synthse des constituants des bactries en phase de
croissance, la locomotion ou encore au transport actif de molcules

Cf: CM nutrition de Mme GAINVORS-CLAISSE

Sans production dnergie la bactrie meurt.

Energie se forme grce aux ractions doxydo-rductions (=rdox).

25

Oxydation = perte dlectrons du substrat

Rduction = gain dlectrons.

Lnergie libre par les ractions rdox doit tre stocke pour tre
consomme en temps voulu (anabolisme). Elle est stocke sous la forme
de composs phosphoryls (= un phosphate est additionn un compos
chimique) comme lADP pour donner lATP.
Lnergie se trouve donc dans des liaisons chimiques de molcules

cellulaires comme lATP (Adnosine Triphosphate).

En rsum:
ADP + Pi (PO4 3-) + nergie ATP : catabolisme
ADP + Pi (PO4 3-) + nergie ATP : anabolisme

B. Mtabolisme nergtique
26

1- Dfinition

Ensemble des ractions qui saccompagnent de la production dnergie

chimique utilisable par la cellule. Ces ractions sont toutes des ractions
doxydorductions au cours desquelles un nutriment (= source dnergie)
est oxyde.
bactries se procurent cette nergie en transformant les produits
chimiques (= inorganiques ou organiques) prsents dans leur
environnement (= chimiotrophes). Dautres utilisent lnergie solaire (=
phototrophes)
Cf: CM nutrition de Mme GAINVORS-CLAISSE

MAIS, ni les produits chimiques, ni la lumire sont employs directement

pour alimenter en nergie les processus cellulaires. La cellule transforme
lnergie en une autre forme dnergie utilisable par la cellule.

La
27

cellule

procure

lnergie

sous

forme

dATP

soit

par

phosphorylation au niveau du substrat soit par phosphorylation

oxydative (via une chane de transporteurs dlectrons).

2- Phosphorylation au niveau du substrat

lorsque la synthse dATP se fait par
transfert direct dun groupement
phosphate issu dun compos organique
la molcule dADP.
- se droule au niveau du cytoplasme
- pas besoin de transporteurs dlectrons

28

3- Phosphorylation oxydative

AH2 : Donneur d'lectrons (substrat nergtique)

A : Donneur oxyd
B : Accepteur final d'lectrons
Les transporteurs intermdiaires (X, Y et Z) peuvent tre des
co-enzymes tels que NAD, FAD, FMN ou des cytochromes

Dans certaines ractions

rdox, le transfert derequiert un ou plusieurs
intermdiaires, appels
transporteurs dlectrons
Loxydation (perte de ces
lectrons) dun substrat
(nutriment) est couple
la rduction (gain
dlectron) dune autre
molcule (= premier
transporteur dlectrons)
NAD+ + 2 + 2H+ NADH + H+

29

3- Phosphorylation oxydative (suite)

La molcule de NADH + H+
est son tour oxyde par
le second transporteur de
la chane de transport
dlectrons (schma prcdent Y).

Puis les lectrons arrive

un accepteur final
dlectrons (schma prcdent B).

Ce flux dlectrons et de
protons conduit la
formation dnergie
cellulaire sous forme dATP

30

C. Respiration et
fermentation : cas
des
chimiohtrotrophes

chimiohtrotrophes
ont 2 options pour
rcuprer lnergie :
Ils mtabolisent les
substrats organiques
par fermentation ou
par respiration.

Ex: mtabolisme du glucose chez les chimiohtrotrophes

1- Respiration
31

La

rcupration dnergie se fait via la chane de transfert des

lectrons (localise dans la membrane cellulaire de la bactrie).

Les composants majeurs dune chane de transfert des lectrons sont:

des flavoproteines ou autres (FAD, NAD+...)
des quinones (ubiquinones, menaquinone)
des cytochromes (cytochrome c, cytochrome oxydase aa3, )
avec test loxydase (cf. TD-TP).

A relier

La respiration = phosphorylation oxydative.

32

2 types de respirations selon nature chimique de l'accepteur final :

- La respiration arobie : transfert d jusqu un accepteur final d
qui est lO2 molculaire et une synthse simultane dATP

- La respiration anarobie; Prsence dune chane de transfert des

lectrons similaire celle des bactries respiration arobie. Mais
laccepteur final d nest plus lO2 mais un autre compos
inorganique : NO3- qui donnera par rduction NH4+, SO42-/ H2S,
CO2/CH4, L'accepteur peut tre organique (ex: fumarate/succinate)

33

Lnergie produite au cours de la respiration implique 2 processus

34
diffrents et complmentaires:
la transformation des composes carbon en CO2 (cf: bilan glycolyse cycle de Krebs)
le transport des lectrons.
2- Fermentation
Les fermentations = formation dnergie par toutes les ractions rdox se
droulant en anarobie.
Cette nergie est fournie au microorganisme

grce des phosphorylations au niveau du

substrat.

Ce

sont

donc

les

composants

organiques qui servent aussi bien de donneurs

que daccepteurs d.

35

La fermentation bactrienne des glucides saccompagne :

Dune Production de gaz: H2,
CO2 ou les 2.

H2 : oxydation substrats
CO2: dgradation sucres C6----(CO2->)-->C5--(CO2->)-->
C4--(CO2->)--> C3
De la Formation des

mtabolites de dgradation:
produits terminaux acides ou
alcools

36

Les bactries selon leur quipement enzymatique auraient ou

non la potentialit de cataboliser telle ou telle substance

chimique pour produire de lnergie par respiration ou

fermentation. Ces nombreuses caractristiques biochimiques
peuvent tre assez diffrentes dune bactrie une autre pour
que le bactriologiste les utilise pour leur identification.
Ce moyen didentification sera vu en TD par lutilisation de

milieux de culture.

3- Relation mtabolisme chimiohtrotrophes et type respiratoire

37

Cf: CM nutrition de Mme GAINVORS-CLAISSE

Anarobie strict: Utilisent indiffremment la fermentation ou la respiration
anarobie

Anarobie facultatif (ou AroAnarobie Facultatif): respiration arobie en

prsence dO2. Sinon une partie fermentent une autre fait la respiration
anarobie quand lO2 est absent.

Anarobie-arotolrants: Produisent exclusivement leur nergie par fermentation

Microarophiles: respiration arobie principalement sinon respiration anarobie

Arobies stricts: respiration arobie.

IV. Milieux de culture

38

A. Rappels
1-Dfinition et vocabulaire

Un milieu de culture doit satisfaire les exigences nutritives dun microorganisme Cf

CM nutrition Mme Gainvors-Claisse et BIO 0101

Une partie dune culture ou prculture qui contient des

microorganismes qui se sont dvelopps ou qui sy dveloppent, est
prleve pour inoculer /ensemencer un milieu de culture. Cette
partie prleve constitue linoculum. Le milieu ensemenc sera
incub cest--dire plac dans des conditions optimales de
croissance (T, pH, O2) lesquelles sont offertes par une
tuve/incubateur. Aprs un temps dincubation les microorganismes
se seront multiplis/dvelopps et on obtiendra une nouvelle culture.

39

2-prparation des
milieux

Gnralement sont vendus sous forme de poudre

dshydrate non strile. Bouillon ou glose
Dissoudre la quantit indique dans le volume deau
appropri.

Striliser le milieu (le plus souvent autoclavage et filtration)

Rpartir strilement dans les rcipients adapts.

40

La strilisation: opration physique (autoclavage) ou mcanique

(filtration) qui consiste tuer tous les organismes (les virus sont
seulement inactivs) prsents dans un milieu de culture ou sur un
support (tubes, erlens) quils soient sous forme vgtative ou
sporule (F. rsistance). Le rsultat est dfinitif.

Cycle classique: 121C, 1bar, 20 minutes

B. Diffrents milieux de culture et composition de base

41

1-Les diffrents types de milieux

2 catgories de milieux selon les constituants de base:

Milieu empirique (= riche ou complexe): Contient des extraits de viandes,
de levure ou peptones... La quantit et la qualit de ces molcules ne sont
pas exactement connues. Cependant, leur richesse en substances
organiques permettent une croissance aise pour de nombreux
microorganismes (chimioorganohtrotrophes, auxotrophes).

Milieu synthtique (= minimum ou dfini): Contient des substances

chimiques pures dont on connat parfaitement la quantit et la qualit.
Considr comme pauvres car ne contiennent que ce qui est ncessaire
au dveloppement dun microorganisme.
Etudes des besoins nutritifs, Mise en vidence de certain(s) caractre(s)
biochimique(s).

Parmi ces 2 catgories on dfinit dautres milieux:

42

Milieu non slectifs (=ordinaire ou de base) :

Beaucoup de microorganismes nexige pas de nutriments particuliers pour

cultiver. Ces microorganismes sont qualifis de non exigeants (
peuvent
tre auxotrophes pour un facteur de croissance). Un tel milieu est
empirique. Ex: GN, bouillon tryptone-soja
GN (Glose Nutritive):
extrait de viande 1,0g/L
extrait de levure 2,5g/L
peptone 5,0g/L
chlorure de sodium 5,0g/L
Agar 15,0g/L

Bouillon tryptone soja (TSB):

Peptone de casine 17,0g/L
Glucose monohydrat 2,5g/L
Peptone de soja 3,0g/L
Chlorure de sodium 5,0g/L
Phosphate dipotassique 2,5
g/L

pH = 7,0

pH 25C = 7,3 +/- 0,2

43

Milieux Enrichis :

Ils renferment : des composants de base, un ou (des) composant(s)

indispensable(s) aux bactries pour leur croissance. Ce sont des milieux
pour microorganismes exigeants.
Ex: milieu au sang frais : Il apporte le facteur X (hme) ncessaire la
croissance de nombreuses bactries qui sont exigeantes vis--vis de ce
facteur.
Glose de base Columbia au sang
Enzymatic Digest of Casein......................5 g/L
Enzymatic Digest of Animal Tissue..........8 g/L
Yeast Enriched Peptone.........................10 g/L
Corn Starch..............1 g/L
Sodium Chloride................................5 g/L
Agar........................................................14 g/L
Final pH: 7.3 0.2 at 25 C
Formula may be adjusted and/or supplemented as required to meet performance
specific

= Sheep, rabbit or horse blood...50g/L

44

Milieux Slectifs :
On retrouve des composants de base et un ou (des) plusieurs agents
slectifs (NaCl fortes concentrations, sels biliaires, cristal violet) qui
inhibent la croissance de microorganismes indsirables donc
permettant la slection de certains autres microorganismes.

Les agents slectifs ajouts sont choisis selon les caractristiques du

microorganisme recherch.
Gnralement utiliss pour analyser un prlvement polybactrien.

Ex: milieux Chapman, Drigalski, Mac Conkey, BEA, Ctrimide: (voir

TD)

45

Milieux denrichissement :

Permettent certaines espces den supplanter dautres, en

favorisant leur croissance et /ou en inhibant celle des autres
microorganismes (peut donc tre slectif).
Si un inoculum contient trs peu du microorganisme requis (parmi une
importante population dorganismes non souhaits), lutilisation dun
milieu denrichissement appropri peut augmenter (= enrichir) la
proportion de lespce souhait.
Ex: bouillon slnite (enrichi la
culture de Salmonella typhi, les
bactries intestinales (ex: E. coli)
tant inhibes.

Tryptone 5g
Lactose4g
Slnite 4g
Hydrognoslnite de sodium 4,0g
Eau distill (quantit suffisante pour
1L)

46

Milieux diffrentiels :

Ils permettent de diffrencier deux espces microbiennes vis--vis de

lutilisation dun substrat (en gnral un sucre). Donc sur un caractre
biochimique quils ont ou pas.
La diffrentiation se fait en ajoutant un indicateur de la raction
chimique: indicateur color de pH ou doxydorduction (bleu de
bromophnol, rouge neutre, rsazurine ).
De nombreux milieux slectifs sont aussi diffrentiels
Ex: milieux Chapman, Drigalski, Mac Conkey, SS, Hekton : (voir TD)

Glose Mac Conkey

47

2-Les Constituants de base des milieux

Agar-agar: Glifiant de bouillons (=mil. cult. Liquide). Cest un

polysaccharide (galactanes) issu dalgues rouges, que la majorit
des microorganismes est incapable dhydrolyser.
Se mlange leau et se liqufie aprs tre chauffe 90-100 C (
lautoclave 120C), Se glifie une temprature de 40 C environ.
Peptones: sont des produits de dgradation plus ou moins avances
des matires protiques.

Hydrolyse chimique (HCl) ou enzymatique (pepsine, trypsine,

papane) de protines issues de vgtaux (soja, bl, mas),
danimaux (organes, muscles), du lait (casne) ou de levures.

48

Peptones:

Leurs apports: Acides Amins (AA)ou oligopeptides (Sources dazote et

Eie), bases azotes (A, G), vitamines ( pas toutes), glucides ( pas
toutes), minraux (hyd. Chimique).
Les peptones pepsiques de viande: riche en peptides. Conviennent aux
microorganismes peu exigeants.
Les peptones trypsiques de viande: plus dAA et de vitamines que les
prcdentes. Dveloppement rapide et abondant des microorganismes
Peptones de levures: (= Extrait de levure): riches en vitamines (vit.B)
Convient aux microorganismes exigeants (ayant besoin souvent de
facteur de croissance)
Peptones composes: mlange de peptones Ex: peptones trypsiques =
tryptones. Pour microorganismes exigeants.

49

Extraits de viande : Extraction froid (macration) ou chaud

(dcoction) de tissus animaux (souvent buf).
Riches en glucides, sels minraux, vitamines et surtout de composs
azots (AA libres , peptides) donc en facteurs de croissances.
Conviennent aux bactries htrotrophes.

3-Mthodes dinoculation des milieux de culture

Toute inoculation de milieu de culture se fait strilement.

Il existe un milieu de culture intermdiaire entre bouillon et glose.
Cest la glose molle = milieu semi-solide. Contient 3 6 g/l dagar
contre (15 g/l en gnral pour le gloses)

50

Inoculation dun milieu liquide :

Peut se faire partir dune (pr)culture liquide: on trempe lanse (=

se) dans la (pr)culture pralablement agite. Linoculum prlev
est dpos dans un bouillon de culture neuf et strile.

51

Inoculation dun milieu par piqre :

La glose est dabord rgnre (=glose chauffe pour tablir un
gradient de concentration en O2 glose Viande Foie) ou liqufie au
bain marie
Piqre: ensemencement milieu semi-solide contenu
dans un tube, en plongeant la verticale une pipette
Pasteur boutonne charg dinoculum.

Pipette Pasteur
boule
charge
dinoculum

Ensemencement du milieu Viande Foie (VF)

52

Inoculation dun milieu solide:

Gloses inoculs de diffrentes faon, en fonction du but poursuivi.

Ensemencement en Stries

Point de
dpart de
linoculum
Point darrive de
linoculum

Anse de platine (ou se)

Pour des repiquages

de culture pure. On
dpose linoculum
un point de dpart
quon rpartit sur la
glose jusqu un
point darriv.

53

Ensemencement en Stries: mthode du quadran

(puisement de linoculum)

- En quadran:

Rsultats aprs culture

-1ere mthode

-2me mthode

dpt initial

But: Raliser un
isolement bactrien.
Linoculum est
progressivement puis
en ralisant des stries
selon un schma dfini.
Dans les dernires stries
se dpose de faon
isoler une cellule qui en
se multipliant donnera
une colonie distincte.

54

Etalement sur glose

Pipette pasteur

Etaler un
dinoculum
Pointvolume
darrive
linoculum
liquidede(0,05
0,1 ml) sur
glose.
Le rpartir avec taloir ou billes
striles.

55

Ensemencement dans la
masse

1 ml dune dilution dun inoculum bactrien est dpos au centre

dune bote de Ptri vide.
Couler 15 20 ml dune glose en surfusion (= maintenue liquide
45 C) sur cet inoculum. Puis mlanger pour rpartir lensemble
dans la bote. Les bactries pousseront dans et en surface de la
glose aprs incubation.
Ensemencement en tapis

La surface de la glose est inonde

dun inoculum pas trop concentr.

56

http://www.bacterio.cict.fr/