BIOLOGIA Y REPRODUCCION DE LOS

HONGOS
Lic. ROBERTO E. ROJAS LEON

INTRODUCCION
El reino de los hongos comprende tal vez el
20% de la biodiversidad sobre el planeta tierra
Existen aproximadamente 2 millones de
especies
Son organismos de vida libre no dependen de
los seres humanos ni animales
Principal descomponedor de materia orgnica
La mayora tiene una limitada patogenicidad

Organismo vivo ms grande ?

Ballena azul

150 Tm

Elefante africano

5 Tm

Sequoias (arboles gigantes) 10 m dimetro 85 m altura

UN HONGO:

Armillaria ostoyae
2.400 aos
890 Ha

6.000 Tm
Oregn (USA)
Fungi Experimental Methods in Biology Maheshwari 2005

Muy tolerantes
Algunas especies (ejm. Aspergillus
nidulans) pueden sobrevivir y crecer a:
pH 2 (jugo de limn, estmago) vs pH 12
(amonio, leja)
2 C vs 48 C

Por que estudiar los Hongos?

BUENOS
Esenciales para el reciclamiento, micorrizas,
biotecnologa, investigacin, industria.

MALOS
Patgenos, parsitos

Los hongos son diferentes

Pueden ser tan grandes:
15 km de dimetro
6000 toneladas

Tan pequeos:
(5m)3 = 1.3 x 10-10 g

Estrategia hifal de ataque a los rboles

Fungi Experimental Methods in Biology Maheshwari 2005

Diagrama de los estadios en el desarrollo de una colonia individualde un hongo

a) Espora germinando

b) Ramificacin de un micelio radialmente expansivo

c)

Red hifal interconectada por fusin de hifas

d)

Micelio descontinuado de una colonia fngica

Fungi Experimental Methods in Biology Maheshwari 2005

Morfologa colonial fngica:

Periferia, hifas no se fusionan
Subperiferia, se fusionan.

Fungi in the Environment GADD2007

Anastomosis hifal
A. Hifa a hifa
B. Hifa a estaca
C. estaca a estaca
D. Hifa a lateral de hifa

The Fungi CARLILE 2001

Fusin hifal

Fungi Experimental Methods in Biology Maheshwari 2005

EXTENSION APICAL Y CRECIMIENTO

SINCRONIZADO

Crecimiento de la hifa: punta hifal

Regin muy pequea < 100 m
N-acetilglucosamina-14C

Crecimiento polarizado en una sola direccin

Fungi Experimental Methods in Biology Maheshwari 2005

Cuerpo
Spitzenkrper
Acmulos de vesculas
pequeas, sin delimitacin,
bien definida.
Derivadas del cuerpo de
golgi.
Debajo de la MC de la
punta hifal.

Fungi Experimental Methods in Biology Maheshwari 2005

Cuerpo
Spitzenkrper
Avanza continuamente con
la elongacin hifal.
Contiene enzimas y
precursores polisacridos
preformados para sntesis de
la pared.
Fungi Experimental Methods in Biology Maheshwari 2005

Morfologa de Mohos y Levaduras

MORFOLOGIA y REPRODUCCION
Hifa
reproductiva y
conidia

Micelio
(talo)

Superficie
del
substrato

Hifa
area

Hifa
vegetativa

MORFOLOGIA DE LOS HONGOS

Morfologa macroscpica de las colonias:
Levaduras, unicelulares, gemacin, fisin
Mohos, esporas
hifas
Dimrficos, levaduras 37 C moho 25-30 C

Conjunto de hifas

micelio

Tipos de micelio:
Situacin (areo, profundoo sumergido)
Tabicamiento (tabicados o septados, continuos o cenocticos o en
sifn)
Funcin vegetativa, reproductiva o fructificacin)

Hifas:
Hialinas o incoloras
Negras o pardas (demateceos)

HONGOS FILAMENTOSOS: MOHOS

Pluricelulares
Hifas, filamentos ramificados
Dimetro constante, 1-30 m o ms,
dependiendo de la especie
Pueden ser cultivados
Colonias radialmente expansivas

Cabello vs Hifa

Levaduras
Unicelulares
Ascomycetes
Basidiomycetes
Deuteromycetes

Dividen asexualmente
Brotacin
Fisin

Tamao variable
2-3 m a 20-50 m longitud
1-10 m de ancho

Levadura tpica gemando, microscopa de

barrido (x10000)

Fungi Biology and Applications Kavanagh2005

Diversidad de formas celulares de las levaduras

Levaduras: pigmentos
Confiere color a la colonia
Cremas
Blancas
Negras
Rosadas
Rojas
Naranjas
Amarillas

Saccharomyces cerevisiae
Geotrichum candidum
Aureobasidium pullulans
Phaffia rhodozyma
Rhodotorula rubra
Rhodosporidium spp.
Cryptococcus laurentii

Levaduras: pigmentos
Uso biotecnolgico
Suplemento alimenticio (salmones)

Phaffia
rhodozyma

ASTAXANTINA
(salmn no sintetiza)

ENVOLTURA CELULAR
Mohos y levaduras:
Membrana plasmtica
Periplasma
Pared celular
Componente estructural extracelular (fimbria y
cpsula)

Infectious disease pathogenesis, prevention, and case studies Shetty 2009

Membrana Plasmtica
Bicapa fosfolipdica
Interespaciada con protenas globulares
Dicta entrada de nutrientes y salida de
metabolitos
Barrera selectiva para su translocacin
Ergosterol, mayor esterolde MC
Colesterol, clula animal
Fitosterol, clula vegetal

Periplasma (Espacio Periplsmico)

Regin externa a MC e interna a PC
En levaduras, no atraviesan PC
Protenas secretadas (manoprotenas)
Enzimas (invertasa y fosfatasa cida)

En mohos
MC y PC ntimamente ligadas:
Hifas a menudo resistentes a plasmlisis

Componentes de la Pared
Glucanas
>mananas
galactomananas
<quitina
polisacrdos

Ergosterol

Pared Celular
Exoesqueleto de formacin dinmica
Define crecimiento, rigidez celular, forma y
propiedades interactivas.
Mohos:
Ligado al crecimiento apical
Neurospora crassa
Delgada en pice ~ 50 nm
Engruesa detrs del pice, 250 m

Pared Celular
Gruesa red de complejo fibrilar
Mohos
Diferentes polisacridos de acuerdo al grupo
taxonmico (quitina, glucanos, manoprotenas,
quitosan, cido poliglucornico o celulosa)
Pequeas cantidades de protenas y glicopronas

Pared Celular
Mohos superiores
Crecimiento apical..formacin de septos

Mohos inferiores
Crecimiento apical..sin formacin de septos

Septos
Compartimentalizar hifa
Tpicamente perforadas (poros)
Pasaje y comunicacin de citoplasma

Pueden bloquearse (cuerpos de woronin)

Pared Celular
Levaduras
Polisacridos (predominantemente -glunacos,
rigidez)
Protenas (principalmente manoprotenas,
porosidad)
Lpidos
Material fosfato inorgnico

Hifas tienen menos mananos que levaduras

Quitina en mayor cantidad en cicatriz de
brotacin

Estructura de envoltura celular, en Saccharomyces cerevisiae

Fungi Biology and Applications Kavanagh2005

Fimbrias
Protrusiones proteicas largas que aparecen
desde PC de ciertos basidiomicetos y
ascomicetos
Involucradas en conjugacin cel.-cel.

Polimero Pullulan
Substancia extrahifal
Comercialmente producido de
Aureobasidium pullulans

Organelas fngicas
Ncleo
Caracterstica de los hongos,
multinucleacin (?)
o Almacn de N y P orgnico (DNA)
1-3 m dimetro
3-16 cromosomas
Hasta 47 Mb DNA (levaduras 15 Mb)

Neurospora crassa, mostrando estado multinucleado

en sus hifas.

Fungi in the Environment GADD2007

Otras organelas
Mitocondria
Cuerpos de Golgiconsiste de una simple
cisterna vs acmulos de cisternas
Otros tipos:
ribosomas, retculo endoplsmico, vacuolas,
vacuolas lipdicas, partculas de almacenamiento
de glucgeno, microtbulos, vesculas.

MICOLOGIA
Estudio de los hongos (mikes = seta u hongo.
Organismos eucariotas, hetertrofos, uni o
pluricelulares, con pared celular definida y se
reproducen por esporas.
100,000 especies vlidamente descritas
1,700 nuevas especies cada ao

1.5 2 millones de especies de hongos!

Menos del 5% son descritas, tomara >800 aos
para describir todas las especies

MICOLOGIA
Fueron incluidos en plantas inferiores
50s, veinte patgenos
150 especies
Patgenos de hombres y
animales, dcada 80.
394 especies, 2000
(?) .2014

ESPECIES DE HONGOS PATOGENOS Y

OPORTUNISTAS
STRAMINIPILA (Phythium insidiosum)

PROTOZOA (Rhinosporidium seeberi)

FUNGI
Zygomycetes

28

Basidiomycetous yeasts

25

Ascomycetous yeasts

28

Filamentous basidiomycetes

Ascomycetes (fruit bodies in culture)

30

Coelomycetes

22

Hyphomycetes

TOTAL

269

394
Hoog et al. 2000 Atlas of Clinical Fungi

Saprofitos
Parsitos
Mutualistas (simbiontes)
Molculas estructurales:

Celulosa, hemicelulosa,
almidn, lignina,
quitina, queratina,
lpidos entre otras.
No hay pinocitosis.
Enzimas estructurales:
hidrlisis.
Molculas simples C
y/o Energa

NUTRICION

NUTRICION

Absorcin: enzimas
Lipasas, aceite vegetal
Invertasas, confitera
Lactasas, lcteos
Proteasas, hidrlisis de
protenas
Amilasas, almidn
Celulasa, celulosa y
hemicelulosa
Pectinas, bebidas no alcohlicas
Etc.
No hay pinocitosis.

MICOLOGIA

Clasificacin
Whittaker
(1969)
y
modificada por Margulis y Schwartz
(1988): 5 reinos.
1.
2.

3.
4.
5.

Monera: Procariotas (bacterias, actinomycetes, algas

verdes azuladas)
Protista: Eucariotas (protozoarios y otros organismos uni
y pluricelulares.
Hongos: Eucariotas (carecen de flagelos y desarrollan de
esporas)
Plantas: Eucariotas.
Animal: Eucariotas

MICOLOGIA
Paterso y Sogin, 1992
Procariota y Eucariotas
Evidencia molecular:
secuencia de bases de
ARNr.
7 Reinos
Archaebacteria
Eubacteria
Protozoa
Chromista
Plantae
Animalia
Eumycota

Aplicacin INDUSTRIAL de los Hongos

Existen procesos industriales aprovechando
las reacciones de descomposicin (enzimas,
metabolitos primarios y secundarios).
Fermentacin alcohlica (cervecera y panadera):

Levaduras, azcar
Alcohol
CO2

OH y CO2
bebidas alcohlicas
nieve carbnica

Preparacin de Enzimas

Almidn
Amilasa (A. niger)

dextrina (A. flavus)

Aplicacin INDUSTRIAL de los Hongos

Maduracin del queso:
Camembert
Roquefort

P. camemberti
P. roqueforti

Acido Ctrico
Principal cido orgnico de frutas ctricas
Producida por fermentacin de carbohidratos
(sucrosa preferido)
Aspergillus niger
Especies de Candida

Enzimas fngicas producidas a escala industrial su aplicacin y organismo productor

Fungi Biology and Applications Kavanagh 2005

Reproduccin de los
Hongos

Esporas.
Mostrando rangos de formas y tamaos
Lnea curva es punta de alfiler

The Fungi CARLILE 2001

REPRODUCCION DE LOS HONGOS

Espora

Tubo Germinativo

HIFA
No hay esporas
Micelio estril (Mycellia
sterillia)
Fenmeno del Pleomorfismo: Mutacin
irreversible, pierde rganos de
reproduccin

REPRODUCCIN SEXUADA
Produccin de rganos sexuados y gametos
Fusin de Protoplastos (Plasmogamia)
Fusin nuclear (Cariogamia)
Desarrollo de
Cuerpos fructferos
Esporas sexuadas

CUERPOS FRUCTIFEROS SEXUALES

Ascoma
ascocarpo:
Cleistotecio.
Cerrado
Peritecio.
Ostiolo
Apotecio.
Abierto
Basidiocarpo

CUERPOS FRUCTIFEROS ASEXUALES

Picnidio: conidias
picnosporas
Coremios: hifas
fasciculadas
Esporodoquio
Acrvulo

REPRODUCCION DE LOS HONGOS

Forman ESPORAS (perpetuar especie).
Son de dos tipos:
Esporas. Reproduccin Sexuada (teleomorfo perfecto), fusin protoplasma y ncleo
(meiosis).
Conidios. Reproduccin Asexuada (anamorfo imperfecto), no fusin de ncleos
(mitosis).

AmbasformasdeReproduccin

Holomorfos

REPRODUCCION DE LOS
HONGOS
Estado Asexual
ANAMORFO

HONGOS

MITOSPORICOS

Los hongos como un todo

HOLOMORFO

Estado Sexual
TELEOMORFO

HONGOS

MEIOSPORICOS

Taxonoma:

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. Atlas of clinical

fungi. 2nd Ed. Utrecht & Reus, Centraalbureau loor Schimmelcultures - Universitat Rovira i
Virgili, 2000

REINO
Protozoa

Mesomycetozoa

REINO
Chromista

Oomycota
Chytridiomycota
Ascomycota

REINO
Eumycota

Zygomycota
Basidiomycota

Clasificacin: De Hoog GS y col. 2000

Ascomycota

Basidiomycota (22.244 especies 1428 gneros)

Zygomycota

Chytridiomycota

(32.267 especies 3266 gneros)

(1.056 especies 173 gneros)

(793 especies 112 gneros)

NOMENCLATURA
Los hongos son nombrados de acuerdo al
sistema binomial de de Linneo

Cryptococcus neoformans

NOMENCLATURA

Desafortunadamente muchas parejas fueron descritos y nombreado antes

de que se dieran cuenta que eran formas diferentes de un mismo hongo
Cryptococcus neoformans (A) = Filobasidiella neoformans (T)

El nombre de la forma tisular (anamorfo) es usado por los clnicos

ESPOROS
Pueden clasificarse:
A Por su forma,
esferoides,
cilindroides,
polidricas, ovoides,
alantosporos
(relleno),
helicosporo,
estaurosporo
(estrella), acicular.

Esporos Clasificacin
B. Por su aspecto externo
(a)Verrugoso
(b)Equinulado
(c)Aciculado
(d)Fobeado
(e)Ribuloso
(f)Estriado
(g)punteado.

Esporos Clasificacin
C Por el tabique
(a) amerosporo (sin tabique)
(b) didimosporo (tabique nico)
(c) fragmosporo (tabiques transversales)
(d) dictiosporos o muriformes (tabique transversales y longitudinales).

Esporos Clasificacin
D.Por su tamao
Macroconidias
microconidias.

Agrupacin de conidias basadas en su

ontogenia: CONIDIOGENESIS

TALICO:

Artroconidia

BLASTICO:

Blastoconidia
Phialoconidia
Aneloconidia
Poroconidia
Simpoduloconidia
Aleurioconidia

BLASTOCONIDIA
Conidios producidos por gemacin blastognesis.
Ejm. Levaduras, Cladosporium sp.

Conidios producidos a travs de poros en la clula

conidigena.
Ejm. Alternaria sp., Drechslera sp., Curvularia sp.

POROCONIDIA

SIMPODULOCONIDIA
Conidios que nacen por gemacin pero el
conidiforo sigue creciendo despus de formado
otras conidias dando el aspecto de ciempis. Ejm.
Sporothrix schenkii.

FIALOCONIDIA
Producida endgenamente por filide
a. sobre hifa (Phialophora sp.)
b. sobre conidiforo complejo (Aspergillus sp., Penicillium sp.,
Malassezia sp.)

ANELOCONIDIA
Producido como blastoconidio en secuencia baspeta
a partir de una clula conidigena dejando cicatriz
(anlido). Scopulariopsis sp., Scedosporium sp.,
Exophiala sp., Phaeoannellomyces sp.

ALEURIOCONIDIA
Producidos ensanchamiento del extremo de cel.
conidigena.
a. Unicelulares (microconidias)
b. Pluricelulares (macroconidias). Blastomyces
dermatitides, Dermatofitos,Chrysosporium,
Histoplasma.

ARTROSPOROS
Conidios producidos por la fragmentacin de
hifas en clulas individuales.
Ejm. Geotrichum sp., Coccidioides immitis.

Procedimientos en el diagnstico
micolgico
Lic. Roberto E. Rojas Len
rerojasle@yahoo.com

TIPOS DE MICOSIS
1.
2.
3.
4.
5.

MICOSIS SUPERFICIAL
MICOSIS CUTANEAS
MICOSIS SUBCUTANEA
MICOSIS SISTEMICA
MICOSIS OPORTUNISTA

Clasificacin clnica de patgenos fngicos observados en humanos

MOHOS

LEVADURAS
Hifas
septadas

Hifas
aseptadas

Mohos pigmentados
Mohos pigmentados

Mohos hialinos

Mohos hialinosseptados

Dermatofitos

Mohos dimrficos

Pediatric Infectious DiseasesRevisited

SCHROTEN 2007

IDENTIFICACION DE HONGOS DE
IMPORTANCIA MEDICA
TOMA DE MUESTRA

EXAMEN DIRECTO

AISLAMIENTO PRIMARIO

IDENTIFICACION

TOMA DE MUESTRA

TOMA DE MUESTRA
SUSPENSION DE TERAPIA ANTIFUNGICA
oTpico, 5 das
oSistmico, 30 das

RECOLECCION APROPIADA: FRASCO ESTERIL DE BOCA ANCHA,

ROTULADO, ETC.
PRONTO ENVIO AL LABORATORIO.
SI HAY ENVIO POR CORREO: PENICILINA 50,000 U,
ESTREPTOMICINA 100,000 ug CLORANFENICOL 0.2 ug, POR
MILILITRO DE MUESTRA.

TOMA DE MUESTRA
SECRECION RESPIRATORIA: ESPUTO, LAVADO
BRONQUIAL, ASPIRADO TRAQUEAL Y
TRANSTRAQUEAL Y LAVADO GASTRICO.

VIAS GENITO URINARIAS: ORINA, SECRECION

VAGINAL Y CERVICAL.

TOMA DEMUESTRA

SANGRE

3-5 ml

FLUIDOS CORPORALES ESTERILES: L.C.R., L.

PERITONEAL, LIQUIDO PERICARDICO Y LIQUIDO
SINOVIAL, HUMOR VITREO.

RASPADOS DE OJO EXTERNO

Coordinar con oftalmlogo, enviar placa con ASD 2%

TOMA DE MUESTRA
MUESTRAS CUTANEAS: PIEL, PELO, UA
Limpiar con alcohol 70%
No recipientes plsticos por atraccin
electrosttica
PLACAS PETRI DE VIDRIO

Piel
CURETA DERMICA
Bistur n 23, portaobjetos
Adicionalmente, cinta scoth, piel de nios (98.3%)

TOMA DE MUESTRA
Uas
Bistur n 23, cortaas, portaobjetos
Microdrilling, buena alternativa

TOMA DE MUESTRA
Pelo
Examen con lmpara de Wood (fluorescencia)
Verde clara, tia microsprica
Verde oscura, tia fvica
Sin fluorescencia, tia endotrhix, microide o megasprica

TOMA DE MUESTRA
Tapiz, alfombra o cepillos estriles (portadores asintomticos,
mascotas)

EXAMEN DE LOS ESPECIMENES

Macroscpicamente: seleccin apropiada
porcin.
Microscpicamente: alerta a mdico de
posible agente y al tecnlogo para usar
tcnicas de inoculacin y medios apropiados.
Especimenes no dermatolgicos
NBS 2

EXAMEN MICROSCOPICO DE
MUESTRAS CLINICAS
Examen directo
Rpida
Barata
Diagnostica presuntivamente una infeccin
fngica.

Coloraciones
Pocos minutos
Resultados en menos de 1 h.

Cultivos 1 o mas das

EXAMEN DIRECTO
SENSIBILIDAD: CULTIVO > EXAMEN DIRECTO
Falsos negativos, 5-15%

SENSIBILIDAD VARIA:

Sitio anatmico
Volumen de muestra examinada
Nmero de organismos
Calidad del examinador, etc.

Para buena localizacin de material drmico (piel, pelo y ua),

colocar la placa sobre cartulina negra.

Porqu un observador
experimentado?
1. Tratamiento largo si es requerido
2. No es barato
3. En una sociedad litigante (USA), la razn de la
terapia debe ser satisfactoriamente
documentada

Falso Negativos en onicomicosis

1. Material inapropiado o cantidad insuficiente

Evitar detritus, contaminantes

2. KOH vencido o defectuoso

Tiempo mximo 1 mes o cuando aparezca

precipitado

3. Examen con tiempo inadecuado

4. Estudios repetidos no son realizados cuando hay
fuerte sospecha clnica

Guardar en cmara hmeda los negativos hasta el

da siguiente, para nueva lectura

EXAMEN DIRECTO
A. Montajes directos
I.

KOH 10-40%

II. Fluorescentes: Blankophor P, Blanco de

Calcofluor, Uvitex 2B
III. Tinta china (clsica o modificada)

B. Coloraciones
I.
II.
III.
IV.

Gram
Coloracin de Kinyoun modificada
Wright o Giemsa
Mucicarmin de Mayer modificada o Alcian blue

KOH, 10-40%
Barato, accesible
Digiere la queratina y moco (aclarante)
Con dimetil sulfoxido (DMSO), acelera su accin
Con tinta Parquer Quick Permanent Black-Blue,
colorea pared fngica

Alternativamente NaOH 10%

Calor suave acelera el proceso

Hifas
ramificadas y
ondulantes
en raspado
de piel con
KOH 20%

Infeccin tipo ectothrix,

KOH 20%

Infeccin tipo
endothrix, KOH 20%

Artefactos
Fungus mosaico
Depsitos de colesterol
Semejan hifas tabicadas
angulosas

Artefactos
Glbulos de mielina

Colorantes fluorescentes
Blankophor P
Blanco de Calcofluor
Uvitex 2B, liga a quitina de pared fngica

Hifas aseptadas con dicotoma en 90, muestra de

pulmn coloreado con Blankophor P

A.Coloracin gram, muestra hifas y levaduras, reportado

como probable Candida spp.
B.Coloracin Blankophor P del mismo hemocultivo en (A),
hifas sepatads con microcinidias de origen monofialdicas,
consistente con Fusarium spp.. El cultivo dio positivo a F.
oxysporum.

TINTA CHINA MODIFICADA

Deteccin de Cryptococcus
neoformans
La cpsula polisacrida de
organismos capsulados,
repelan las partculas de
carbn

JOURNALOF CLINICALMICROBIOLOGY
34(9):22902291; 1996.

Material Fibrilar

Zona Clara
Estrato Lcido

COLORACION GRAM
Util para detectar bacterias
Para hongos, colorean pobremente,
ej. Cryptococcus spp.

Coloracin de Kinyoun Modificada

Util para deteccin de Nocardia spp.
Colorea ascosporas

Coloracin de Wright o Giemsa

Deteccin de hongos
incluyendo Histoplasma
spp., levaduras y
trofozoitos (no quistes)
de Pneumocystis
jiroveci

Coloracin para cpsula

Colorea mucopolisacridos cidos presentes en la
cpsula
Mucicarmn de Mayer modificado
Alcian Blue

Coloracin de Mucicarmn de Mayer Modificado para C.

neoformans
R. Rojas L.,Quadex; 1997, 1:1-3

Cryptococcus neoformans en bazo, coloracin de Alcian-Blue

Chlorazol Black E
Colorante anfotrico lipoflico
Coloracin vital, con KOH y DMSO
Colorea quitina
Excluye artefactos
Sensibilidad, 98.8%

(Sigma-Aldrich)

Hifas ramificadas y
ondulantes en
raspados de piel.
Coloracin PAS

Pitiriasis
Versicolor
Espagueti conAlbndigas

Placas confluentes por

dermatofito, cercana al
globo ocular

Nos veremos
as?

Nio difcil

Zona peligrosa
ALTERNATIVAS ?

COLORANTE DE KANE
Empleado en la demostracin de estructuras fngicas en raspados de
piel, especialmente en lesiones provenientes de la pitiriasisversicolor.

Glicerina
Tween 80
Fenol
Azul de metileno
Agua destilada

10.0 ml
10.0 ml
2.5 g
1.0 g
480.0 ml

Disolver la glicerina, el tween 80 y el fenol en el agua destilada

calentando ligeramente, luego aadir el azul de metileno hasta
disolver. Conservar en frasco color caramelo.

MEDIOS DE CULTIVO PARA

AISLAMIENTO PRIMARIO
Y SELECTIVO

Aislamiento Primario
Especimenes procesados (2 hrs) e inoculados sobre
medios de aislamiento.
Medios cuidadosamente seleccionados (tipo de
espcimen y agente sospechoso).
Contenedores:
Tubos tapa rosca, 25 x 150 mm, 20 ml, inclinar.
Muy Seguros, resisten deshidratacin y contaminacin
VS. Pequea Superficie.
Placas Petri, 15 x 100 mm, 25 ml, bolsas plsticas.
Gran Superficie y Dilucin de sustancias inhibitorias del
espcimen VS. Contaminacin, Deshidratacin, Poco
Seguros.

Aislamiento Primario
Especimenes sitios contaminados, adicionar
antibacterianos como cloranfenicol (16 ug/ml),
gentamicina (5-100 ug/ml ), penicilina (20 ug/ml),
estreptomicina (40 ug/ml), norfloxacina (5
ug/ml), y ciprofloxacina (5ug/ml), as como
tambin cicloheximida (actidione, 0.5 ug/ml),
inhibidor de muchos hongos saprfitos.
Especmenes de sitios normalmente estriles sobre
medios sin sustancias inhibitorias.

MEDIOS DE CULTIVO
Agar Sabouraud Dextrosa 2% (Modificacin de
Emmons)
Medio estndar, ligero cido (pH 6.5), medio original
(4%) poca recuperacin de B. dermatitidis.
Recuperacin y mantenimiento de hongos.

MEDIOS DE CULTIVO
Agar Mycobiotic (Difco) o Mycosel (BBL), Fungi
Selective, etc.
1% glucosa, cloranfenicol y cicloheximide.
Recuperacin selectiva de dermatofitos y hongos
dimrficos.

MEDIOS DE CULTIVO
Agar BHI
Medio enriquecido, incrementa recuperacin deC.
neoformans de especmenes estriles. Conversin de
Sporothrix y Paracoccidioides.

BHI+Cloranfenicol+Gentamicina+10% Sangre Carnero

Igual BHI pero de especmenes contaminados.

MEDIOS DE CULTIVO
Dermatophyte Test Medium (DTM)
Recuperacin de dermatofitos de especimenes muy
contaminados.

Agar Micobiotic - Rojo de Fenol

AMRF

Desarrollo de Levaduras sobre ASD 2%:

Gold Standar

Easy Steps Diagram

C. glabrata

C. albicans/C. dubliniensis

C. tropicalis

C. krusei

Agares Cromognicos.
Costo efectividad
$ 800

$ 1 X PLACA

$ 1000

$ 2 X PLACA

Mycoses. 2005; 48:378381

COINFECCION

Morfologa de levaduras:
Tcnica de Dalmau
Agar harina de maiz con tween 80
Agar arroz

Incubacion de 48-96 hrs, a temperatura ambiente

Dr.
Patricio
Godoy

Inoculacin del Agar Harina de

Maz con Tween 80

blastosporas

clamidosporas

pseudohifas

hifas

artrosporas

MEDIOS DE CULTIVO
Agar Mueller Hinton Suplementado
(MHS)
Fcil disponibilidad
Aceptable reproducibilidad lote a lote
Suplemento
o Glucosa 2%, apropiado crecimiento
o Azul de metileno 0,5 g/ml, incrementa
zona de definicin del halo
o Puede ser suplementado pre o pos
produccin

AGAR UREA
En levaduras
. positivo, basidiomicetas
. negativo, ascomicetas

Observacin directa del crecimiento fngico

Precausiones adicionales

Identificacin fenotpica de Hongos

Mohos
Combinacin de caractersticas Macroscpicas y
Microscpicas

Levaduras
Combinacin de caractersticas morfolgicas y
bioqumicas (fisiologa)

IDENTIFICACION DE HONGOS
Revisin organizada de morfologa in vitro.
Caractersticas culturales:
Textura: altura, estructura y densidad.
Topografa: elevaciones y depresiones.
Pigmentacin: anverso y reverso; debajo inmediato o por
difusin y soluble en el agar.

IDENTIFICACION DE HONGOS
Textura

Lanosas, micelio alto, laxo y tosco.

Algodonosas, micelio mas corto y mas denso o compacto.
Particuladas, finamente pulverulenta hasta toscamente granular.
Glabrosas, totalmente lisa o serosas.

Topografa

Planas, a nivel con la superficie del agar.

Monticulares, centro amontonado.
Plegadas, pocos o muchos pliegues o surcos.
Verrucosas o Cerebriformes, superficie plegada o surcadas
extensamente y convolutas.
Crateriformes, depresiones en forma de taza o crteres.

T
E
X
T
U
R
A

ALGODONOSA

ATERCIOPELADA

GRANULAR

GLABROSA

T
O
P
O
G
R
A
FI
A

RUGOSA

UMBELICADAS

VERRUCOSA

Examen microscpico de los

cultivos
1. Montaje hmedo (fragmentacin del talo)
2. Cinta scotch
3. Microcultivos

Montaje hmedo
(fragmentacin del talo)
Mas comn y rpida
Fragmenta porcin de colonia con asa en ngulo
Conidias o esporas pueden ser dislocadas de las clulas
conidigenas o esporgenas
Lquidos de montaje
Azul de lactofenol
Lactofenol de Amann
otros

 Este Mtodo usualmente

mantiene la posicin
original de las estructuras
fngicas caractersticas.
Sin embargo, el
organismo debe crecer
sobre medios plaqueados
adems de ser
examinados por este
mtodo
Mejor que el de
fragmentacin del talo

Cinta scotch

TECNICA DE
MICROCULTIVOS

MICROCULTIVOS FUNGICOS
OBJETIVO
Micro ambiente de crecimiento de un hongo,
proporcionndonos caractersticas microscpicas.
Utilidad, identificacin definitiva de gnero y
especie.

MONTAJES
Para la demostracin de los micro cultivos se
proponen montajes, semipermanentes y
permanentes.
Semipermanentes: azul de lactofenol
Desventaja, no pueden ser continuamente
manipulados, como a 100x, deterioran estructuras
fngicas.

Permanentes:
Excelentes en la enseanza, por su manipulacin,
pero el riguroso procedimiento de coloracin,
deteriora de estructuras fngicas.

MATERIALES
Sistema estril: horno 180 C x 1 hora
Placa petri

1 Lmina portaobjetos
2 cubreobjetos
Codo de vidrio de (45-50), encaje en placa
Papel filtro encaje en placa

ASG 2% o APD, en placa con espesor de no

ms de 2 mm.

PROCEDIMIENTO
Papel filtro humedecido

Codo de vidrio doblado

Portaobjetos

Bloque de
Agar
Inculo

Cubreobjetos

PROCESAMIENTO
1. Retirar cubreobjetos
ALF en
portaobjetos.
2. Portaobjetos, retirar los
bloquecitos, fenol 5 %, montar
idem.

Incubacin, T Amb. 20 25 C
Tiempo 3 30 das.
Controlar con microscopio sin
destapar placa, buena esporulacin.
Coloraciones alternativas, Gram,
Giemsa, entre otras.

PRESERVACION DE HONGOS
PARAQU?
Investigacin
Docencia
Control de calidad
Otro

Mtodos de conservacin
Agua destilada

Suspensin de levaduras o hifas y conidias

Viales con 5 ml de agua destilada estril
Conservacin a temperatura ambiente
Viabilidad estimada, 5 aos

Caldo Sabouraud-glicerol
Suspensin de estructuras fngicas
Conservacin a -20C -70
Viabilidad estimada, 20 aos

Cultivos sumergidos en aceite mineral

Colonias desarrolladas sobre APD

Cubrir aspticamente con aceite mineral estril
Conservacin a temperatura ambiente
Viabilidad estimada, 20 aos

FICHA NUMERICA - MICOTECA

Laboratorio de Micologa
Servicio de Microbiologa
Inatituto Nacional de Salud del Nio

Codigo:

Identificacin: GENERO/ESPECIE

Sinonimia
Remitente:

Fecha Recepcion:

Identificado por (Taxonomista):

si

no

Congelamiento -70 C

Aceite mineral

Agua Destilada CBS

Congelamiento -20 C

Subcultivo mensual

Otro:

Pureza Verificada:

Metodo Mantenimiento:

Numero de Referencia:
Requerimiento de Cultivo ( T, pH ,etc)
Datos de Coleccin (cdigo de aislamiento, etc)

Notas/Comentario

Uso (QC, docencia,etc)

Antifngicos

Micologa Medica:
Ultimos 50 aos
# de drogas
14
12
10
8
6
4

5-FC

L-AmB
ABCD
ABLC
Terbinafine
Itraconazole
Fluconazole
Ketoconazole
Miconazole

2
0

1950

1960

1970

1980

1990

2000

Micologa Medica:
Grupo de pctes. como
demanda
14
12
10
8
6
4

5-FC

UCI

2
0

1950

L-AmB
ABCD Otros!
ABLC
Terbinafine
Quimioterapia
Itraconazole
Fluconazole
HIV
Infeccin Ketoconazole
Miconazole

1960

1970

1980

1990

2000

cul es el Blanco Bioqumico

de los Antifngicos

Membrana
Celular
Polienos

Anfotericina B
AB-FL
Triazoles
Fluconazol
Itraconazol
Voriconazol
Posaconazol
Ravuconazol

Pared Celular
Equinocandinas
Caspofungina
Anidulafungina
Micafungina

Acidos
Nucleicos
Flucitosina

Costo Directo de Infecciones Fngicas, USA

1998

International Journal of Antimicrobial Agents 23 (2004) 105112

Promedio del costo diario de terapia

antifngica

Clula

Membrana celular y Pared celular

fngica
Mannoproteinas
b-(1,6)-glucano
b-(1,3)-glucano
Quitina
Bicapa fosfolipdica de
menbrana celular
b-(1,3)-glucano sintetasa
Ergosterol

Via de sntesis
de Ergosterol

Sntesis DNA/RNA

Escualeno

Membrana Celular del hongo: un blanco

teraputicamente relevante
Membranas celulares de hongos y mamferos
contienen diferentes esteroles
Esteroles son crticos para el apropiado
funcionamiento de muchas enzimas de la
membrana celular y sistema de transporte inico
Membrana celular de mamferos contiene
colesterol mientras que en los hongos contienen
ergosterol

Drogas Antifngicas
Polienos (Anfotericina B, Nistatina)
Liga el Ergosterol, rompiendo integridad de la membrana
(baja afinidad por colesterol). Activo contra muchos hongos;
toxicidad significativa

Azoles (Fluconazol, Itraconazol, Ketoconazol, etc.)

Inhibe demetilasa Cit P450-dependiente requerida para
sntesis de ergosterol. Activo contra muchos hongos

Antimetabolitos: 5-Fluorcitosina
Inhibe sntesis RNA/DNA. Resistencia desarrolla
rpidamente. Usado en combinacin.

Griseofulvina
Inhibe mitosis. Actividad limitada a dermatofitos

Antifngicos
Clasificacin segn su estructura
Polienos

nistatina, natamicina, anfotericina B

Azoles
Imidazoles

miconazol, clotrimazol

Triazoles

fluconazol, itraconazol, ketoconazol

Triazoles de 2 generacin

voriconazol, ravuconazol, posaconazol

Pirimidinas fluoradas

flucitosina

Alilaminas

terbinafina, naftifina

Lipopptidos

papulacandinas
triterpenos glicosilados

Equinocandinas

caspofungina, anidulafungina, micafungina

Otros

YK, ciclopirox, tolnaftato, griseofulvina

Antifngicos
Clasificacin por su uso

Sistmicos

Superficiales

Antifngicos segn mecanismos de

accin y resistencia
GRUPO
Polienos

NOMBRE
Afotericina B
Nistatina

Azoles

Clotrimazol
Miconazol
Fluconazol
Ketoconazol
Itraconazol
Voriconazol
Posaconazol
Ravuconazol

Equinocandinas

Caspofungina
inhibicin de la -1,3 glucano sintetasa
Anidulafungina requerida para la biosntesis del ergosterol
Micafungina

Reducida susceptibilidad a equinocandinas

Alilaminas

Terbinafina

Inhibicin de la escualeno epoxidasa

(codificada por ERG1) requerido para
la biosntesis del ergosterol

Alteracin del ERG1 o factor esencial para su

actividad

Pirimidinas

5-Fluorcitocina

Inhibicin de biosntesis de cidos

nucleicos

Disminucin de captacin de 5-FC;

Disminucin del metabolismo para formar
antimetabolitos txicos

MECANISMO DEACCION
Liga al ergosterol y rompe la funcin de la
membrana celular

Inhibicin de citocromo P-450 14-lanosterol

demetilasa (codificada por ERG11) requerido
para la sntesis de ergosterol

MECANISMOS DE RESISTENCIA
Alteracin o disminucin del ergosterol de
membrana
Bomba de eflujo incrementado por bombas de flujo
de membrana;
mutacion (es) en ERG11 conduciendo a
alteraciones de la interaccin del blanco de los
azoles;
sobrexpresin del ERG11;
alteracin en otros genes biosintticos de ergosterol

Mecanismos de accin de los

antifngicos que afectan la sntesis de
ergosterol. Las enzimas blanco, al
lado derecho, con sus genes
codificadores en parntesis.
Antifngicos, al lado izquierdo de las
flechas, que indican la secuencia de
la sntesis del esterol.

Biosntesis Ergosterol

Antibiticos Polinicos
Macrlidos polinicos
Formados por un anillo lactona de 26-38
tomos de carbono, cerrado por enlaces dobles
Mas de 60 compuestos
Nistatina
Anfotericina B
Pimaricina (natamicina), queratitis mictica

Nistatina
Hazen y Brown, 1950
S. noursei (tambin de S. albulus)

Etimologa, lugar de las investigaciones

New York State, NYSTATIN

Tetraeno con 46 tomos de carbono (C46H77O19H),

926 PM, cuatro enlaces dobles y una micosamina
Poco soluble en agua

Nistatina
Absorcin
GI nula o poca
Piel o mucosas nula

Acta por contacto

Fungisttico y fungicida

Nistatina
Mecanismo de accin
Inhibe respiracin celular
Altera metabolismo del fsforo inorgnico

Espectro reducido y especfico

Infecciones por Candida

No es txico

Anfotericina B
Gold y col., 1955
Streptomyces nodosus

Hapteno (C47H73NO17), 924 PM

7 enlaces no saturados y una nicosamida unida al
carbono 19 por enlace glucosdico

Polvo amarillo
insoluble en agua, alcohol y otros solventes
orgnicos
Soluble en DMSO

Anfotericina B
Estndar de oro del tto. de micosis sistmicas
Absorcin
Uso por va intravenosa (IV), 4-6 h
Va oral (VO), menos 5%
Va intramuscular (IM), nula

Vida media 24 h
Se une a protenas plasmticas, 95%
No atraviesa BHE, solo 2.5% de dosis IV
Eliminacin lenta, 4-5% por rin

Anfotericina B
Reacciones adversas
Local frecuente, tromboflebitis
Llave de dos vas, salina y antifngico

Fiebre (40C), cefalea, nusea, vmito

Toxicidad renal, 80%, reversible o irreversible
(dosis >3 g)
Vasoconstriccin
Lesin de membranas lisosomales de clulas tubulares
Urea y creatinina elevadas

En candidosis disaminada y criptococosis

Efecto sinrgico con 5FC

Anfotericina B
Con azoles, sinergismo o antagonismo
Se desconoce

Presentacin
Liofilizado, fcos. 50 mg, combinada con 41 mg de
desoxicolato de sodio
Diluyente, solucin glucosada 5% (precipita en solucin
salina)

Disminuye actividad despus de 24 h

Se inactiva por luz y calor

Anfotericina B
Actividad antifngica

Candida albicans
Cryptococcus neoformans
Histoplasma capsulatum
Coccidioides immitis
Blastomyces dermatitidis
Aspergillus fumigatus
P. brasiliensis
S schenckii
Mucor spp.

Resistencia intrnseca,
comn en:
C. lusitaniae
Trichosporon spp.

Anfotericina B
Mecanismo de accin
Se liga al ergosterol de la membrana celular fngica
Romper la membrana fngica (poros acuosos)
Permite fuga de pequeos iones, espec. K+, muerte celular

Medio
Extracelular

Amfotericina B
Ergosterol
Membrana
Celular

Liga al ergosterol, intercalacin

de membrana celular

Ca++
Na+

Ca++

Na+

K+

K+

Escape de cationes y proteinas intracelulares

citoplasma

La AFB acta unindose al ergosterol de la membrana celular fngica, crendole

agujeros, permitiendo la salida de iones de Na y K. Normalmente la clula fngica
mantiene una baja concentracin de Na+ dentro y baja concentracin de K+ fuera de
la clula, para crear una gradiente elctrica que cruzan los dos lados de la membrana.
Sin esta gradiente la clula muere. Los agujeros creados por laAFB destruyen esta
gradiente matando a la clula fngica.
Infectious Fungi Brock 2006

Anfotericina B
Mecanismo de resistencia
Se requiere de ergosterol para daar clula fngica
Alteracin de lpidos de MC, otros esteroles
Mutacin de C-5, 6 esterol desaturasa (gen ERG3)
Siempre acompaada de mutacion ERG11
resistencia cruzada con azoles
C. albicans, cepas resistentes
Falta de ergosterol
o Acmulo de otros esteroles tpicos
3-ergosta-7
22-dienol
3-ergosta-8-enol

S. cerevisiae
Defecto en el gen ERG3

Azoles

Fungistticos sintticos
Miconazol, 1979 marca el inicio, con licencia
Poseen anillo imidazlico
Clasifican segn nmero de tomos de N en anillo
imidazlico
o Imidazoles, dos tomos de N
Clotrimazol, miconazol, econazol, ketoconazol (1981)

o Triazoles, tres tomos de N

Fluconazol (1990), itraconazol (1992). 1ra. generacin.
Voriconazol, posaconazol y ravuconazol. 2da. generacin.

(Noxafil Schering)

Estructura qumica de azoles antifngicos

AZOLES
Accin antifngica depende de la inhibicin de la
reaccin de demetilacion C-14 en la biosntesis del
ergosterol
Enzima involucrada, 14- esterol demetilasa (protena citocromo
P450), tambin conocido como P450-Erg11P o Cyp51p, de
acuerdo a diferentes nomenclaturas segn base de genes
Inhiben la enzima por formacin de complejo con el hierro del
componente hemo de la enzima
El hierro heme interacta con el par solitario de electrones en
uno de los nitrgenos del anillo, y el complejo se estabiliza
adicionalmente por las interacciones entre restos hidrfobos en el
ligando azol y la enzima

Azoles
Mecanismo de accin
1. Inhiben enzimas oxidativas asociadas al Citocromo
P450, bloqueando la conversin de lanosterol en
ergosterol
Acumula esteroles 14-metilados, txicos para
S. cerevisiae y C. albicans
Altera permeabilidad y fluidez de MC
2. Producen acumulacin de perxido de hidrgeno
Lesionando organelas intracelulares

Azol

Membrana
celular
Ergosterol
Va de sntesis
de Ergosterol

Escualeno

Acumulacin de
esteroles txicos
en membrana
celular
Esteroles txicos
Inhibicin de
14-alfa-demetilasa

Azoles
Mecanismos de resistencia, 4 categoras
1. Alteracin de calidad y cantidad de enzima
blanco
Mutacin del gen ERG11
2. Eflujo incrementado del antifngico
Sobreexpresin o activacin de genes
3. Mutacin de un segundo gen biosinttico de
ergosterol (ERG3)
4. Cambio en la fluidez y asimetra de la MC

Mecanismo de supervivencia en los hongos durante

la exposicin a inhibidores de C14-demetilasa
* Indica mutacin del gen ERG3; las lineas
punteadas indican reducida actividad de la va,
mientras que las lneas slidas indican va
bioqumica preferencial

Azoles
Actividad antifngica
Candida spp.
Paracoccidiodes brasiliensis
Cryptococcus neoformans
Blastomyces dermatitidis
Epidermophyton floccosum
Microsporum spp.
Trichophyton spp.
Malassezia spp.

Fluocitosina (5-FC)
Pirimidina fluorinada sinttica
Antimetabolito interfiere en sntesis de purinas
Altamente soluble en agua, bajo peso molecular
Via oral (USA) e intravenoso (otros pases)

Amplia distribucin en tejidos y LCR (60-80%

de niveles sricos)
Excrecin inalterada principalmente por los
riones
Poca toxicidad a clula de mamferos

Fluocitosina efectos adversos

Mielosupresin (monitorear recuento
sanguneo semanalmente)
Funcin heptica anormal (cerca del 5% de
pctes.; usualmente reversible)
Piel rash, alopecia, nuseas y vmitos,
enterocolitis

Fluocitosina
Actividad antifngica
Candida spp., C. neoformans, S. cerevisiae y algunos
demateceos

Resistencia intrnseca principalmente para

Aspergillus spp. y C. krusei
Combinaciones con:
Anfotericina B, Candida spp.
Anfotericina B o Fluconazol, C. neoformans

Fluocitosina
Mecanismo de accin
Llevada al interior de la clula fngica
especficamente por la enzima citosina permeasa y
convertida en el citoplasma por la citosina
deaminasa a 5-fluoracil, la cual causa error en la
codificacin de RNA e inhibe la sntesis de DNA

Mecanismo de
accin de 5-FC

Cytosine permease
5-FC
5-FC

5-FC

Cytosine deaminase

5-FU

Fosforilacin

Conversion a
deoxynucleosides

FdUMP

FdUMP

FUTP

dUMP
dTMP

Substitucin del uracil

Inhibicin de sntesis de proteinas
Inhibicin de timidilato sintetasa
Inhibicin de la sntesis de DNA

Clula
fngica

5-FC, 5-fluorocytosine; 5-FU, 5-fluorouracil; FdUMP, 5-fluorodeoxyuridine;

FUMP, 5-fluorouridine monophosphate; FUDP, 5-fluorouridine diphosphate;
FUTP, 5-fluorouridine triphosphate; dUMP, deoxyuridine monophosphate;
dTMP, deoxythymidine monophosphate

Fluocitosina (5-FC)
Mecanismo de resistencia
Mutacin en enzimas necesarias para la
captacin, transporte o metabolismo clula
Sobre regulacin competitiva de sntesis de
pirimidinas

Equinocandinas

La Pared Celular Fngica

Funciones
Da forma y rigidez a la clula
Control permeabilidad celular
Protege de cambios osmticos

Diana muy importante de accin de

antifngicos
Difiere de pared celular vegetal la cual tiene
celulosa principalmente

La Pared Celular Fngica

Composicin
Polisacridos
Quitina
Glucano
Manano o galactomanano

Protenas asociadas a polisacridos

(glicoprotenas)

La Pared Celular Fngica

Glucano
Polisacrido estructural mas importante
50-60% del peso seco de la pared

Compuesto por unidades de glucosa con uniones

-1,3 (65-90%)
-1,6 (Candida pero no en Aspergillus)
Otros

La Pared Celular Fngica

Glucano
-1,3-D-glucano
Sintetizada por complejo de enzimas (MC)
Glucano sintetasas
Catalizan la formacin de cadenas lineales de glucano
Aprox. 1500 residuos de glucosa unidos por enlaces -1,3
En estas cadenas, cada 40-50 residuos de glucosa se unen a
nuevas unidades de glucosa por enlaces -1,3, ESTRUCTURA
RAMIFICADA
Dichas ramificaciones, se pueden unir a
Glucanos
Quitina
Manoprotenas

La Pared Celular Fngica

Glucano
-1,3-D-glucano sintetasa
Codificada por genes FKS1 y FKS2 (S. cerevisiae)
Hay genes anlogos en otras especies (Candida, Aspergillus,
Cryptococcus y Pneumocystis)

FKS1
Codifica protena de MC (215 kDa)
Subnidad principal de la glucano sintetasa

Equinocandinas
Lipopptidos semisintticos
Equinocandinas de 2da. gen.
Caspofungina (CancidasTM)
Micafungina (MycamineTM)
Anidulafungina (EcaltaTM y EraxisTM)

Estructura qumica de equinocandinas

Equinocandinas
Mecanismo de accin
Especie-dependiente
Fungicida para Candida spp. y fungisttico para Aspergillus
spp.

Inhibicin no competitiva de la sntesis de (1 3)-d-glucano (polisacrido de pared celular)

La diana, glucano sintetasa

Mannoproteinas
(1,6)-glucano
(1,3)-glucano
Quitina
Bicapa fosfolipdica
de membrana celular
(1,3) glucano sintetasa
Inhibidor de sntesis de glucano

Deplecin de (1,3) glucanos

en pared celular

Inhibicin de
(1,3) glucano sintetasa

Equinocandinas
Mecanismo de resistencia
Muy rara
Mutacin del gen FKS1

Los hongos desarrollan seis

Mecanismos Resistencia
(1,2) cambiando la forma del
ergosterol o Citocromo P450 para que
5

4
2
1
6

estas no se liguen al antifngico;

(3) produciendo copias extras de
Citocromo P450, haciendo que la
concentracin del antifngico sea
letal para el paciente
(4) disminuyendo la produccin de
protenas permeasas en la membrana
celular haciendo que poco
antifngico ingrese
(5) produciendo mas bombas de
protenas en su membrana para
remover el antifngico que entr; y
(6) crear ms enzimas catalticas para
la degradacin ms rpida del
antifngico una vez adentro

Infectious Fungi Brock 2006

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
ANTIFUNGICA PARA LEVADURAS
POR DISCO DIFUSION
M44-A2, M44-S3 (2009)

Lic. ROBERTO E. ROJAS LEON

Instituto Nacional de Salud del Nio
rerojasle@yahoo.com
2014

EVOLUCION TAXONOMICA DE LAS LEVADURAS

Fuente

Ao

Referencia

N
Gneros

Increment
o%

N
Especies

Increment
o%

Epidemiologa
Levaduras en IIH del torrente sanguneo
41.4%, comunicacin personal (INSN, 20062008)

Entre 1999 y 2000, casos de sepsis por

hongos se incrementa en 207% (USA)
Candida spp, Aspergillus spp y Cryptococcus
spp

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007

Normas CLSI
Incremento de IFI y de antifngicos
Pruebas de susceptibilidad antifngica
GANAN reconocimiento

Mtodos de referencia tanto macro y

microdilucin de CLSI
Levaduras, M27
P (1992); T (1995); A (1997); A2 (2002)

Mohos, M38
P (1998); A (2002)

P 2003
A 2004

Mtodo disco difusin

Solo para levaduras
Solo para Candida spp.
No abarca otros gneros de levaduras ni
dimrficos en su fase de levadura

Azoles y equinocandinas
Resultados, 20 a 24 h. de incubacin
Mueller-Hinton en lugar de RPMI
Disponibilidad
Bajo costo

Mtodo disco difusin

Punto de corte
Caspofungina
Fluconazol
voriconazol

Mtodo disco difusin

Parmetros de QC
Caspofungina
Fluconazol
Posaconazol
voriconazol

Seleccin de los antimicrobianos en

disco para pruebas de rutina y reporte
Pese a criterios interpretativos, no
recomendado en rutina:
Decisin tomada por mdico infectlogo,
comit de farmacia y teraputica, personal de
microbiologa clnica y el comit IIH.

Para minimizar confusin, emplear

nombres genricos.
Nmero de agentes testados, deben ser
limitados, an con pocos antifngicos.

Equipo y materiales
Incubadora a 35 C (2 C), con ambiente
aerbico.
Estndar de turbidez McFarland 0.5
Hisopos de algodn estriles
Solucin salina fisiolgica estril (8.5 g/L
NaCl; 0.85%).

Reactivos
Medio Agar Mueller-Hinton + Glucosa 2%
+ Azul de Metileno 0.5 g/mL (MHS)
Fcil disponibilidad
Aceptable reproducibilidad lote a lote
Suplemento
Glucosa 2%, apropiado crecimiento
Azul de metileno 0.5 g/mL, incrementa zona de
definicin

Puede ser suplementado ya sea pre o pos

produccin

Preparacin del medio de Mueller-Hinton agar suplementado

(1) y suplementacin de las placas de MHA (2).

Gua Prctica de Identificacin y Diagnstico en Micologa Clnica, Pemn. 2007

Reactivos
pH de MHS
7.2 7.4, T amb. despus de solidificado
Macerar medio para sumergir el electrodo
Dejar que una pequea cantidad de agar se
solidifique alrededor del electrodo en un recipiente
de vidrio
Usar electrodo de superficie calibrado

Humedad
Exceso en la superficie, secar en incubadora
o cabina de flujo laminar, tapa entreabierta
(10-30 min).

Reactivos
Almacenamiento de discos
Refrigerar los recipientes a 8 C o
congelacin a -14 C, hasta ser utilizados.

Preparacin del estndar de turbidez

Estndar de turbidez McFarland 0.5

PROCEDIMIENTO
Preparacin del inculo
Cepas subcultivadas, sobre AS ASD
(pureza y viabilidad). T 35 C (2 C)
Inculo preparado picando 5 colonias
distintas de aprox. 1 mm de , 24 h, 5 ml de
SSF estril
Agitar por 15 s y ajustar turbidez (1x106 a
5x106 cel/mL

Preparacin inculo levaduras

(M44-A2).

Gua Prctica de Identificacin y Diagnstico en Micologa Clnica, Pemn. 2007

Desarrollo de Levaduras sobre ASD 2%:

Gold Standar

Verificar pureza del aislamiento:

evita dolores de cabeza

bacterias

Chrom Agar: excelente alternativa

Coinfeccin

PROCEDIMIENTO
Inoculacin de las placas
Dentro de los 15 min despus de ajustar la
turbidez del inculo, embeber el hisopo en la
suspensin, rotar varias veces y presionar
firmemente contra la pared interna del tubo
evitando el nivel del fluido.
Agar MHS es inoculado por estriado uniforme
del hisopo en toda su superficie, dos o mas
veces, rotando la placa aprox. 60 cada vez,
finalmente el borde del agar.
Tapa entreabierta, 3-5 min., no mas de 15 min

PROCEDIMIENTO
Aplicacin de los discos
Los discos son dispensados sobre la
superficie de la placa inoculada, ligera presin,
aproximacin entre discos no menor de 24
mm de centro a centro
Invertir las placas e incubar dentro de los 15
min despus que los discos son aplicados

DISCOS DE
FLUCONAZOL
25 g

DISCOS DE
VORICONAZOL
1 g

PROCEDIMIENTO
Lectura de las placas e interpretacin
Examinar despus de 20-24 h de incubacin
Zonas de inhibicin uniformemente circulares y
desarrollo semiconfluente
Sobre fondo negro no reflejante, iluminado
Medir el dimetro de prominente reduccin de
crecimiento
Ignorar microcolonias en los bordes o grandes
colonias dentro de la zona de inhibicin.
Leer a las 48 h solo cuando insuficiente
desarrollo es observado a las 24 h

INTERPRETACION

M44-S3
2009

J Clin Microb; 2008, 46(6):1927-1929

CONTROL DE CALIDAD
Propsito (monitorear)
Precisin (repetitibilidad) y exactitud
Performance de reactivos

Performance de la persona que realiza la

prueba y lee los resultados

CONTROL DE CALIDAD
Utilizar cepas de referencia para el QC
Candida albicans ATCC 90028

Candida parapsilosis ATCC 22019

Candida tropicalis ATCC 750
Candida krusei ATCC 6258.

CONTROL DE CALIDAD
Almacenamiento de cepas para el QC
Minimizar posibilidad de mutacin
APD a -70 C
Cepas de trabajo, AS o ASD a 2-8 C,
subcultivadas cada semana, no mas de tres
semanas
Cepas congeladas o liofilizadas,
subcultivadas al menos dos veces antes de
su uso

CONTROL DE CALIDAD
Dimetros lmites del control de calidad
Diario, si es satisfactorio semanal