Anda di halaman 1dari 44

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL SEDIAAN TABLET DENGAN

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA


TINGGI (KCKT)

I.

TUJUAN

1.1

Melakukan penetapan kadar parasetamol dari tablet parasetamol dengan


metode analisis HPLC

1.2

Melakukan validasi data dari metode analisis yang digunakan pada


penetapan kadar

II.

DASAR TEORI

2.1

Parasetamol
Parasetamol (C8H9NO2) atau asetaminofen berupa serbuk hablur, putih,

tidak berbau, rasa sedikit pahit. Mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak
lebih dari 101,0 % C8H9NO2, dihitung terhadap zat anhidrat. Kelarutannya larut
dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N serta mudah larut dalam
etanol. BM parasetamol adalah 151,16. Parasetamol memiliki khasiat sebagai
analgetikum dan antipiretikum (Depkes RI, 1995).

Gambar 1. Rumus Struktur Paracetamol


(Sumber: Moffat et al., 2005)
Absorbansi parasetamol pada max 245 nm dalam larutan asam adalah
sebesar 668a sedangkan dalam larutan alkali atau basa absorbansinya sebesar
715a pada max 257 nm. Identifikasi: Sistem HDk 0.1; sistem HWk 0.32;
sistem HXRI 264; sistem HYRI 241; sistem HZwaktu retensi 1.9 menit;

sistem HAAwaktu retensi 5.6 menit; sistem HAMwaktu retensi 2.0 menit;
sistem HAXwaktu retensi 4.8 menit; sistem HAYwaktu retensi 3.7 menit
(Moffat et al., 2005).

2.2

High Performance Liquid Chromatography HPLC


High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang sering

disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang
penggunaannya paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan
pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam
sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga digunakan untuk identifikasi
kualitatif senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu retensi senyawa obat
standar serta senyawa obat dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2012). Kegunaan
HPLC antara lain:
-

Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun


senyawa biologis

Analisis ketidakmurnian (impurities)

Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile)

Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion

Isolasi dan pemurnian senyawa

Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama

Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace


element), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.
(Gandjar dan Rohman, 2007)

2.3

Parameter HPLC
Parameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu

kromatogram adalah Resolusi (Rs), Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas (),
Efisiensi dan jumlah lempeng teoritis (N).
-

Resolusi (Rs)
Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam waktu

yang minimum. Nilai resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua puncak akan

memberikan nilai pemisahan yang baik. Resolusi dipengaruhi oleh beberapa


parameter diantaranya: Selectivity, Effieciency, dan Retention.
-

Faktor Retensi (k)


Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu

komponen dari dalam kolom kromatografi. Nilai k yang tinggi mengindikasikan


sampel memerlukan waktu dalam berinteraksi dengan fase diam terlebih dahulu
hingga keluar dari kolom saat tepat dalam konsentrasi maksimum.
-

Faktor selektifitas ()
Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-

senyawa dalam campuran untuk mendapat selektifitas yang maksimum diperlukan


interaksi yang sesuai (partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Apabila
kedua senyawa memiliki k atau nilai = 1 kedua senyawa tidak dapat dipisahkan.
akibat waktu retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai
selektivitas () harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai maka
pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara,
mengubah fasa gerak (misalnya dengan memperbesar polaritas), mengubah fasa
diam, mengubah temperatur karena pada umumnya kenaikan temperatur akan
memperkecil waktu retensi, dan mengubah bentuk komponen
-

Efisiensi
Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang

diinginkan dengan memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Hasil yang idel
kolom yang efisien akan menghasilkan puncak yang tajam. Efisiensi sangat
dipengaruhi oleh kapasitas dari kolom.
-

Lempeng teoritis (N)


Merupakan

parameter

yang

menghitung

efisiensi

kromatografi.

Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat
yang dibawa oleh fase gerak selama elusi. Dimana semakin besar harga N akan
memberikan puncak yang lebih efisien.
(Crawford, 2011)

2.4

Instrumen

Gambar 1. Skema Alat HPLC

a.

Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak
melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja
konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant
displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:
pompa

reciprocating

dan

pompa

syringe.

Pompa

reciprocating

menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena


itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk,
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor
sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir
tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut,
tetapi reservoirnya terbatas (Putra, 2004).

b.

Injektor (Injector)
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan:

1)

Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,


sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

2)

Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang


digunakan pada Kromatografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada
kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan

semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang


terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
3)

Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi


volume lebih besar dari 10 L dan dilakukan dengan cara otomatis
(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil
dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfer, bila valve difungsikan, maka sampel
akan masuk ke dalam kolom (Putra, 2004).

c.

Kolom (Column)
Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok, yaitu :

1)

Kolom analitik: Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung


pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang
yang digunakan adalah 50 - 100 cm. Untuk kemasan poros
mikropartikulat, 10 - 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2)

Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar


dan panjang kolom 25 -100 cm (Putra, 2004).

d.

Detektor
Detektor dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu sebagai berikut:

1)

Detektor spektrofotometri UV-Vis


Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak
digunakan dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena
kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat menyerap
sinar UV-Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi
UV dan sinar tampak pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh
spesies solut yang mempunyai struktur atau gugus kromoforik. Sel
detektor umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan panjang
celah optiknya 10 mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu
menghilangkan pengaruh indeks bias yang dapat mengubah absorbansi
yang terukur.

2)

Detektor Indeks Bias


Detektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu
detektor universal yang memberi tanggap pada setiap zat terlarut, asalkan
indeks biasnya jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak. Kelemahan
utamanya adalah bahwa indeks bias ini peka terhadap suhu. Karena itu
suhu fase gerak, kolom, dan detektor harus dikendalikan dengan
seksama, bila pengukuran yang cermat dilakukan pada kepekaan tinggi.

3)

Detektor Elektrokimia
Banyak molekul organik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau
direduksi secara elektrokimia pada elektrode yang cocok. Arus yang
dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat untuk menghasilkan tenaga
yang sesuai. Meskipun detektor elektrokimia cukup peka, namun ada
pula kelemahannya. Adanya timbrungan listrik dan goncangan arus juga
harus diperhatikan.

4)

Detektor Photodiode-Array (PDA)


Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai
keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram
secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali
proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada
panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190-400) dapat
ditampilkan. Dengan demikian, PDA memberikan banyak lebih banyak
informasi komposisi sampel disbanding dengan detector UV-Vis.
Dengan detektor ini, juga diperoleh spectrum UV tiap puncak yang
terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk
memilih panjang gelombang maksimal untuk sistem KCKT yang
digunakan. Dan akhirnya dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji
kemurnian puncak dengan membandingkan antara spectra analit dengan
spectra senyawa yang sudah diketahui.
Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan pada detektor PDA
ini dapat ditampilkan sebagai plot 3 dimensi absorbansi, panjang
gelombang, dan waktu sehingga data ini dapat dimanipulasi dan

diplotkan kembali pada layar (monitor) lalu dibandingkan dengan data 3


dimensi senyawa lain dari perpustakaan data yang ada di sistem
komputernya sehingga bisa digunakan untuk tujuan identifikasi (Gandjar
dan Rohman, 2007).

2.5

Metode Validasi
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan


bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita,
2004). Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan
untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan
pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman,2007).
Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa
parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis,
karenanya suatu metode harus divalidasi ketika :
a.

Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis


tertentu.

b.

Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan atau karena


munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku
tersebut harus direvisi.

c.

Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah


berubah seiring dengan berjalannya waktu.

d.

Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, atau


dikerjakan dengan alat yang berbeda.

e.

Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar dua metode, seperti


antara metode baru dan metode baku.
(Gandjar dan Rohman, 2007)

a. Linierity (Linieritas)
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasilhasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran
yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva

kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x).


Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi
yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode
kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope),
intersep, dan koefisien korelasinya (r) (Gandjar dan Rohman, 2012).

b. Kisaran (Range)
Kisaran suatu metode didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan
tertinggi yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi, dan
linieritas yang mencukupi. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada
jenis metode dan kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama (mayor), maka
konsentrasi baku harus diukur di dekat atau sama dengan konsentrasi kandungan
analit yang diharapkan. Suatu strategi yang baik adalah mengukur baku dengan
kisaran 25, 50, 75, 100, 125, dan 150% dari konsentrasi analit yang diharapkan
(Gandjar dan Rohman, 2012).
Sebagaimana telah direkomendasikan ICH, kisaran umum yang digunakan
untuk uji potensi senyawa obat atau produk obat adalah 20% dari target atau
nominal konsentrasi; sementara untuk uji keseragaman kadar adalah 20% dari
target atau nominal konsentrasi (Gandjar dan Rohman, 2012).

c. Stabilitas
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menunjukkan bahwa sampel dan
larutan standar yang disiapkan sesuai dengan metode masing-masing adalah stabil
setidaknya selama durasi normal urutan analitis (itu adalah rekomendasi biasanya
untuk melakukan stabilitas larutan pada 24, 48, dan 72 jam). Kriteria dapat
ditentukan selama tahap pengembangan metode jika pengencer cocok untuk
sampel persiapan dan pengencer tidak bereaksi dengan aktif dan / atau eksipien
dalam matriks (Kazekevich dan LoBrutto, 2007).

d. Kekasaran
Definisi dalam hal ketidakrataan diberikan oleh USP adalah sebagai
berikut: "Kekasaran dari metode analisis adalah tingkat kemampuan untuk
memproduksi hasil tes yang diperoleh oleh analisisis dari sampel yang sama
dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium yang berbeda, analisis
instrumen yang berbeda berbeda, hari yang berbeda, dll. Ketidakrataan biasanya
dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh pada hasil tes dari variabel operasional
dan lingkungan dari metode analisis. Kekasaran adalah ukuran kemampuan untuk
memproduksi hasil tes dalam kondisi normal kondisi operasional yang diharapkan
dari laboratorium - laboratorium ke dan dari Analis ke analis". Praktis berbicara,
kekasaran. adalah nama lain untuk presisi menengah, di mana dua analis, dari dua
laboratorium yang berbeda, pada dua hari yang berbeda, menggunakan
instrumentasi yang berbeda, jumlah kolom banyak, reagen, pelarut, dan bahan
kimia, ikuti metode uji identik dengan menguji sampel identik (Kazekevich dan
LoBrutto, 2007).

e. Kecermatan (accuracy)
Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil
analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai
persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan
ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) yaitu
memasukkan analit ke dalam matriks blanko atau metode penambahan baku
(standard additionmethod) yaitu penambahan baku pada matriks sampel yang
mengandung analit (Harmita, 2004).

f. Keseksamaan (precision)
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara
hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika
prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari
campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau
simpangan baku relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai

keterulangan (repeatability) atauketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah


keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada
kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek (Harmita, 2004).

g. Selektivitas (Spesifisitas)
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang
hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya
komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas metode
ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung
cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa
plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi
(Harmita, 2004).

h. LOD dan LOQ


Batas deteksi (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan
blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi (LOQ)
merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.
LOD dan LOQ dapat dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:

(Harmita, 2004)

10

III.

ALAT DAN BAHAN

3.1. Alat
a. Timbangan analitik
b. Batang pengaduk
c. Sendok tanduk
d. Beaker glass
e. Erlenmeyer
f. Labu ukur
g. Pipet ukur
h. Mortir dan stamper
i. Botol vial
j. Bulb filler
k. Pipet tetes
l. Kertas perkamen
m. Membran filter
n. Alat ultrasonik
o. Syringe
p. HPLC dengan kolom reversed phase C18

3.2. Bahan
a. Tablet sampel (Pamol)
b. Serbuk baku parasetamol
c. Metanol dan air (70:30 v/v)

11

IV.
4.1

PROSEDUR KERJA
Pembuatan Larutan Standar Parasetamol 100 g/mL dari
larutan Stok Paracetamol 1 mg/mL
Diketahui : Konsentrasi larutan stok (M1) = 1 mg/mL
Konsentrasi larutan yang dibuat = 100 g/mL
Volume larutan yang dibuat (V2) = 10 mL
Ditanya

: Volume larutan stok yang diambil (V1)....?

Jawab

:
M1 x V1 M 2 x V2

1 mg/mL x V1 100 g x 10 ml
1000 g/ml x V1 100 g x 10ml

V1 = 1 mL
Pembuatan Larutan Stok Parasetamol
Parasetamol ditimbang menggunakan beaker glass sebanyak 50 mg
kemudian dilarutkan dengan sedikit metanol dan air (70:30 v/v).
Larutan ini kemudian dimasukan kedalam labu ukur 50 mL. Setelah
itu ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas.
Larutan ini digojog homogen. Larutan ini memiliki konsentrasi
sebesar 1 mg/mL. Larutan stok ini dipipet sebanyak 1 mL kemudian
dimasukan kedalam labu ukur 10 mL. setelah itu ditambahkan
metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas. Larutan kerja yang
dimiliki memiliki konsentrasi parasetamol sebesar 100 g/mL (godze,
2009).

4.2

Pembuatan Seri Larutan Standar Parasetamol


Larutan kerja parasetamol 100 g/mL dipipet masing-masing 0,5
mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL untuk dimasukan kedalam labu
ukur 10 mL. Setelah itu metanol dan air (70:30 v/v) ditambahkan pada
setiap labu ukur tersebut sampai tanda batas, kemudian digojog

12

homogen. Larutan seri parasetamol yang yang dihasilkan masingmasing sebesar 5 g/mL; 10 g/mL; 15 g/mL; 20 g/mL; 25 g/mL.
a. Larutan standar seri volume 0,5 mL
100 g/mL 0,5 mL = M2 10 mL
M2 = 5 g/mL
b. Larutan standar seri volume 1 mL
100 g/mL 1 mL = M2 10 mL
M2 = 10 g/mL
c. Larutan standar seri volume 1,5 mL
100 g/mL 1,5 mL = M2 10 mL
M2 = 15 g/mL
d. Larutan standar seri volume 2 mL
100 g/mL 2 mL = M2 10 mL
M2 = 20 g/mL
e. Larutan standar seri volume 2,5 mL
100 g/mL 2,5 mL = M2 10 mL
M2 = 25 g/mL

4.3

Pembuatan Larutan Sampel


Tablet parasetamol sebanyak 3 buah digerus menggunakan stamper

dan mortir. Kemudian serbuk yang dihasilkan ditimbang sehingga diperoleh


serbuk yang ekivalen dengan 100 mg parasetamol. Serbuk tablet ini
kemudian dimasukan ke dalam beaker glass, setelah itu serbuk ini
dilarutkan menggunakan metanol dan air (70:30 v/v) sebanyak 20 mL.
Larutan ini kemudian dimasukan kedalam labu ukur 100 mL. Setelah itu
metanol dan air (70:30 v/v) ditambahkan kedalam labu ukur tersebut sampai
tanda batas. Larutan digojog homogen sehingga diperoleh sampel larutan
parasetamol dengan konsentrasi 1 mg/mL. Larutan sampel parasetamol 1
mg/mL kemudian diencerkan menjadi 100 g/mL.Larutan sampel ini
dipipert sebanyak 10 mL ke dalam labu 100 mL. Setelah itu metanol dan air
(70:30 v/v) ditambahkan pada labu ukur tersebut hingga tanda batas dan

13

larutan digojog homogen. Larutan sampel 100 g/mL kemudian diencerkan


menjadi 15 g/mL. Larutan sampel 100 g/mL dipipet sebanyak 1,5 mL
lalu dimasukan ke dalam labu ukur labu 10 mL. Setelah itu metanol dan air
(70:30 v/v) ditambahkan kedalam labu tersebut sampai tanda batas. Larutan
digojog homogen sehingga diperoleh larutan sampel parasetamol dengan
konsentrasi 15 g/mL.

Penyiapan sampel
Perhitungan:
Dik : kadar parasetamol dalam tablet

= 500 mg

massa serbuk 20 tablet

= ..... mg

massa parasetamol yang diinginkan = 100 mg


Dit : massa serbuk parasetamol yang setara dengan 100 mg serbuk
parasetamol = ...?
Jawab :
Kadar parasetamol dalam 3 tablet

= 3 500 mg
= 1500 mg

Massa yang setara 100 mg parasetamol =

100 mg
x ........mg
1500 mg

= .... mg
-

Sejumlah serbuk sampel yang setara dengan 100 mg kadar parasetamol


dibuat dengan volume 100 mL.
Perhitungan :
Dik : Massa paracetamol
Volume paracetamol
Dit : C paracetamol
Jawab : C =

= 100 mg
= 100 mL
= ?

massaparacetamol 100mg
=
volumeparacetamol 100mL

= 1mg/mL
= 1000 g/mL

14

Dibuat konsentrasi larutan sampel paracetamol 100 g/mL


Perhitungan :
M1 x V1

= M2 x V2

1000 g/mL x 10 mL = M2 x 100 mL

1000 g/mL x 10 mL
100 mL

M2

M2

= 100 g/mL

Dari konsentrasi 100 g/mL sampel diencerkan kembali sampai 15 g/mL


M1 x V1

= M2 x V2

100 g/mL x V1

= 15 g/mL x 10 mL

V1

V1

= 1,5 mL

4.4

15 g/mL x 10 mL
100 g/mL

Pengkondisian Kolom HPLC


Larutan pencuci

kolom

(metanol dan air (70:30 v/v)) difiltrasi

melalui membran. Metanol dan air (70:30 v/v) sebanyak 10 L kemudian


diinjeksi ke alat melalui selang pelarut dengan kecepatan alir 1 mL/menit.
Metanol dan air (70:30 v/v) akan secara otomatis didegassing dalam
instrumen.

4.5

Pembuatan Kurva Kalibrasi


Larutan seri parasetamol konsentrasi terendah difiltrasi sebanyak 20

L diinjeksikan pada injektor HPLC (godze, 2009). Setelah itu larutan seri
di-scan pada 200 nm - 300 nm. Panjang gelombang maksimum yang sudah
diperoleh kemudian digunakan sebagai panjang gelombang dalam
pengukuran nilai AUC untuk setiap larutan seri lainnya. Masing-masing
AUC yang akan didapat dicatat sebagai bahan pembuatan kurva kalibrasi
parasetamol y = bx + a, dengan y = AUC dan x = konsentrasi (g/mL).

15

4.6

Penetapan Kadar Parasetamol


Setiap larutan sampel parasetamol difiltrasi kemudian sebanyak 20 L

larutan sampel ini diinjeksikan pada injektor HPLC. Larutan di-scan pada
panjang gelombang maksimum parasetamol yang sudah diperoleh
sebelumnya. Masing-masing AUC yang akan didapat dicatat sebagai bahan
penetapan kadar dengan cara mensubstitusikan nilai AUC ke dalam kurva
kalibrasi parasetamol yang sudah diperoleh sebelumnya. Setelah itu
ditentukan nilai perolehan kembali kadar parasetamol terhadap kadar pada
kemasan sampel (godze, 2009).

4.7

Validasi Metode analisis

4.7.1 Penetuan akurasi metode analisis


Data AUC yang diperoleh dimasukan kedalam persamaan regresi
linier. Dihitung presentasi perolehan kembali (recorvery).

4.7.2 Penentuan Presisi metode analisis


Dihitung dengan menggunakan data penentuan akurasi metode
analisis. Dihitung dengan menggunakan persamaan :

4.7.3

Penentuan nilai nilai LOD dan LOQ


Dibuat 5 variasi larutan parasetamol dengan konsentrasi yang
berbeda. Ditentukan nilai absorbansi dari kelima variasi parasetamol.
Dibuat persamaan regresi liniernya, y = bx + a dengan y adalah
absorbansi dari kelima variasi konsetrasi larutan parasetamol dan x
adalah konsentrasi larutan parasetamol. Ditentukan nilai y" yaitu
nilai absorbansi suatu konsentrasi larutan parasetamol setelah
dimasukkan kedalam persamaan liniernya. Ditentukan selisih dari yy" dan kuadrat dari selisih y-y". Ditentukan nilai simpangan baku
residual (Sy/x) dengan rumus :

16

Ditentukan nilai LOD dan LOQ dari larutan parasetamol dengan


persamaan :
LOD = (3 x Sy/x) / b
LOQ = (10 x Sy/x) / b

V.

SKEMA KERJA

5.1

Pengkondisian Kolom HPLC


Larutan pencuci kolom (metanol dan air (70:30 v/v)) difiltrasi melalui
membran
Metanol dan air (70:30 v/v) difiltrasi.

Diinjeksikan metanol dan air (70:30 v/v) sebanyak 10 L ke alat


melalui selang pelarut dengan kecepatan alir 1 mL/menit.
5.2

Pembuatan Larutan Stok Parasetamol 100 g/mL


Ditimbang parasetamol menggunakan beaker glass sebanyak 50 mg.

Dilarutkan dengan sedikit metanol dan air (70:30 v/v), dimasukkan ke


dalam labu ukur 50 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas, digojog
hingga homogen.

Dipipet sebanyak 1 mL, dimasukan kedalam labu ukur 10 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas.

Digojog hingga homogen.


17

5.3

Pembuatan Seri Larutan Standar Parasetamol 5 g/mL; 10 g/mL; 15


g/mL; 20 g/mL; 25 g/mL
Larutan stok parasetamol 100 g/mLdipipet 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2
mL; 2,5 mL dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) hingga tanda batas.

Digojog hingga homogen.

5.4

Pembuatan Larutan Sampel 1 mg/mL


Digerus tablet parasetamol sebanyak 3 buah menggunakan stamper dan
mortir.

Ditimbang serbuk mengandung sebanyak 100 mg parasetamol.

Dimasukan ke dalam beaker glass, setelah itu serbuk ini dilarutkan


dengan metanol dan air (70:30 v/v), dimasukan kedalam labu ukur 100
mL.
Ditambahkan pelarut hingga tanda batas kemudian digojog hingga
homogen.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) ke dalam labu ukur sampai
tanda batas.

Digojog hingga homogen.

5.4.1 Pengenceran Larutan Sampel 1 mg/mL menjadi 100 g/mL


Dipipet larutan parasetamol 1 mg/mL sebanyak 10 mL, dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) hingga tanda batas.


18

Digojog homogen.
5.4.2 Pengenceran Larutan Sampel 100 g menjadi 15 g/mL
Dipipet larutan sampel 100 g/mL sebanyak 1,5 mL, dimasukan ke
dalam labu ukur 10 mL.

Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas.

Digojog hingga homogen.

Diulangi sebanyak 2 kali.

5.5

Pembuatan Kurva Kalibrasi


Diinjeksikan larutan seri parasetamol konsentrasi terendah diinjeksikan
ke membran (difiltrasi) sebanyak 20 L pada injektor HPLC.
Larutan seri di-scan pada panjang gelombang 200 nm-300 nm.

Ditentukan panjang gelombang maksimumnya.

Larutan standar lain diukur pada panjang gelombang maksimum.

Dibuat kurva kalibrasi standar parasetamol dan persamaan regresi linier


y = bx + a, y = AUC dan x = kadar sampel (g/mL).

5.6

Penetapan Kadar Parasetamol


Setiap larutan sampel parasetamol di-degassing dan difiltrasi.
Diinjeksikan sebanyak 20 L larutan sampel pada injektor HPLC.

19

Larutan discan pada panjang gelombang maksimum parasetamol yang


sudah diperoleh sebelumnya.
Masing-masing AUC yang akan didapat dicatat sebagai bahan penetapan
kadar dengan cara mensubstitusikan nilai AUC ke dalam kurva kalibrasi
parasetamolyang sudah diperoleh sebelumnya.
Ditentukan nilai perolehan kembali kadar parasetamol terhadap kadar
pada kemasan sampel.

5.7 Validasi Metode analisis


5.7.1

Penetuan akurasi metode analisis


Data AUC yang diperoleh dimasukan kedalam persamaan
regresi linier

Dihitung presentasi perolehan kembali (recorvery).

5.7.2 Penentuan Presisi metode anlaisis


Dihitung dengan menggunakan data penentuan akurasi metode
analisis dan pennetuan kadar sempel PCT

Dihitung dengan menggunakan persamaan :

5.7.3

Penentuan nilai nilai LOD dan LOQ


Dibuat persamaan regresi linier 5 larutan seri konsentrasi, y =
bx + a dengan y adalah absorbansi dari kelima variasi
konsetrasi larutan parasetamol dan x adalah konsentrasi larutan
parasetamol
20

Ditentukan nilai y" yaitu nilai absorbansi suatu konsentrasi


larutan parasetamol setelah dimasukkan kedalam persamaan
liniernya

Ditentukan selisih dari y-y" dan kuadrat dari selisih y-y"

Ditentukan nilai simpangan baku residual (Sy/x) dengan rumus

Ditentukan nilai LOD dan LOQ dari larutan parasetamol


dengan persamaan:
LOD = (3 x Sy/x) / b ; LOQ = (10 x Sy/x) / b

21

VI. HASIL PENGAMATAN


6.1

Bobot Masing-Masing Tablet


6.1.1 Sampel A
Tablet

Bobot

Tablet 1

0,7254 gram

Tablet 2

0,7222 gram

Tablet 3

0,7265 gram

Bobot total

2,1741gram

6.1.2 Sampel B
Tablet

Bobot

Tablet 1

0,7217 gram

Tablet 2

0,7196 gram

Tablet 3

0,7192 gram

Bobot total

2,1605 gram

6.1.3 Sampel C
Tablet

6.2

Bobot

Tablet 1

0,7189 gram

Tablet 2

0,7204 gram

Tablet 3

0,7115 gram

Bobot total

2,1508 gram

Data AUC dan waktu retensi


Bahan

AUC

Waktu Retensi

Standar 1 (5 g/ml)

639368

1,569

Standar 2 (10 g/ml)

1214010

1,581

Standar 3 (15 g/ml)

1734344

1,579

Standar 4 (20 g/ml)

2332255

1,586

22

6.3

Standar 5 (25g/ml)

2708478

1,581

Sampel A

1737360

1,571

Sampel B

2152647

1,582

Sampel C

1623583

1,594

Spektrum
6.3.1 Standar 1 (5 g/ml)

6.3.2 Standar 2 (10 g/ml)

23

6.3.3 Standar 3 (15 g/ml)

6.3.4 Standar 4 (20 g/ml)

24

6.3.5 Standar 5 (25g/ml)

6.3.6 Sampel A

25

6.3.7 Sampel B

6.3.8 Sampel C

26

VII. ANALISIS DATA


7.1

Larutan Standar
Bahan

AUC

Waktu Retensi

Standar 1 (5 g/ml)

639368

1,569

Standar 2 (10 g/ml)

1214010

1,581

Standar 3 (15 g/ml)

1734344

1,579

Standar 4 (20 g/ml)

2332255

1,586

Standar 5 (25g/ml)

2708478

1,581

Sampel A

1737360

1,571

Sampel B

2152647

1,582

Sampel C

1623583

1,594

Dari data diatas, dapat ditentukan persamaan regresi linear dari larutan
standar seri konsentrasi.

Bahan

AUC

Standar 1 (5 g/ml)

639368

Standar 2 (10 g/ml)

1214010

Standar 3 (15 g/ml)

1734344

Standar 4 (20 g/ml)

2332255

Standar 5 (25g/ml)

2708478

27

3000000
2500000

y = 105129,3x + 148751,5
R = 0,997

2000000
Series1

1500000

Linear (Series1)
1000000
500000
0
0

10

15

20

25

30

Regresi linear yang diperoleh:


y = 105129,3x + 148751,5 R = 0,997

7.2

Sampel
Bahan

AUC

Waktu Retensi

Sampel A

1737360

1,571

Sampel B

2152647

1,582

Sampel C

1623583

1,594

Perhitungan kadar sampel:


a. Sampel A
Diketahui: y

= 105129,3x + 148751,5

AUC1 = 1737360
Ditanya

: Konsentrasi= ......g/mL

Jawab

= 105129,3x + 148751,5

1737360

= 105129,3x + 148751,5

105129,3x

= 1588608,5

= 15,11 g/mL

28

b. Sampel B
Diketahui: y

= 105129,3x + 148751,5

AUC2 = 2152647
Ditanya

: Konsentrasi= ......g/mL

Jawab

= 105129,3x + 148751,5

2152647

= 105129,3x + 148751,5

105129,3x

= 2003895,5

= 19,06 g/mL

c. Sampel C
Diketahui: y

= 105129,3x + 148751,5

AUC3 = 1623583

7.3

Ditanya

: Konsentrasi= ......g/mL

Jawab

= 105129,3x + 148751,5

1623583

= 105129,3x + 148751,5

105129,3x

= 1474831,5

= 14,02 g/mL

Perhitungan Konversi Sampel


a. Sampel A
Diketahui

: Kadar sampel A

= 15,11 g/mL

Kadar sampel primer = 1 mg/mL


Volume sampel primer = 100 mL
Kadar sampel sekunder = 15 g /mL
Ditanya
Jawab

: kadar sampel= ......mg


:

Konversi dari kadar sampel (g/ml) sebanding 1000 g/ml


15,11 g/mL
x1000 g/ml 1007,3 g/ml 1,0073 mg/ml
15g/ml

29

Konversi sebanding 100 mg sampel


1,0073 mg/ml 100 ml

= 100,73 mg

Jadi, untuk sampel A kadar sampel 15,11 g/mL setara 100,73 mg

b. Sampel B
Diketahui

: Kadar sampel B

= 19,06 g/mL

Kadar sampel primer = 1 mg/mL


Volume sampel primer = 100 mL
Kadar sampel sekunder = 15 g /mL
Ditanya
Jawab

: kadar sampel= ......mg


:

Konversi dari kadar sampel (g/ml) sebanding 1000 g/ml


19,06 g/mL
x1000 g/ml 1270,6 g/ml 1,2706 mg/ml
15g/ml

Konversi sebanding 100 mg sampel


1,2706 mg/ml 100 ml

= 127,06 mg

Jadi, untuk sampel B kadar sampel 19,06 g/mL setara 127,06 mg

c. Sampel C
Diketahui

: Kadar sampel C

= 14,02 g/mL

Kadar sampel primer = 1 mg/mL


Volume sampel primer = 100 mL
Kadar sampel sekunder = 15 g /mL
Ditanya
Jawab

: kadar sampel= ......mg


:

Konversi dari kadar sampel (g/ml) sebanding 1000 g/ml


14,02 g/mL
x1000 g/ml 934,6 g/ml 0,9346 mg/ml
15g/ml

Konversi sebanding 100 mg sampel


0,9346 mg/ml 100 ml

= 93,46 mg

Jadi, untuk sampel C kadar sampel 14,02 g/mL setara 93,46 mg


30

7.4

Perhitungan kadar paracetamol dalam sampel


Kadar rata- rata

X1 X 2 X 3
3

100,73 mg 127,06 mg 93,46 mg


3

107,08 mg

x - x

( x x )2

100,73 mg

107,08 mg

-6,35

40,32

127,06 mg

107,08 mg

19,98

399,20

93,46 mg

107,08 mg

-13,62

185,50

(x x)

Standar Deviasi

625,02

(x x)

n -1
625,02
17,67 mg
2

100 x D

RSD

= x rata-rata
= (100 x 17,67)/107,08
= 16,51 %

Kadar Paracetamol dalam sampel = SD


= 107,08 mg 17,67 mg

7.5

Perhitungan Kadar Paracetamol dalam Tablet


a.

Sampel A

Diketahui : Kandungan parasetamol 1 tablet yang diambil (ka)= 100 mg


Kandungan paracetamol diperoleh (ks) =100,73 mg
Kandungan parasetamol 3 tablet secara teoritis= 1500 mg

31

Kandungan parasetamol 1 tablet secara teoritis= 500 mg


Ditanya : Kandungan parasetamol 1 tablet dari analisis = ...?
Jawab

Kandungan parasetamol 3 tablet

ks
1500 mg
ka

100,73 mg
1500 mg
100 mg

= 1510,95 mg
Kandungan parasetamol 1 tablet

1510,95mg
3

= 503,65 mg

b.

Sampel B

Diketahui : Kandungan parasetamol 1 tablet yang diambil (ka)= 100 mg


Kandungan paracetamol diperoleh (ks) =127,06 mg
Kandungan parasetamol 3 tablet secara teoritis= 1500 mg
Kandungan parasetamol 1 tablet secara teoritis= 500 mg
Ditanya : Kandungan parasetamol 1 tablet dari analisis = ...?
Jawab

Kandungan parasetamol 3 tablet

ks
1500 mg
ka

127,06 mg
1500 mg
100 mg

= 1905,9 mg
Kandungan parasetamol 1 tablet

1905,9 mg
3

= 635,3 mg

c.

Sampel C

Diketahui : Kandungan parasetamol 1 tablet yang diambil (ka)= 100 mg


Kandungan paracetamol diperoleh (ks) = 93,46 mg

32

Kandungan parasetamol 3 tablet secara teoritis= 1500 mg


Kandungan parasetamol 1 tablet secara teoritis= 500 mg
Ditanya : Kandungan parasetamol 1 tablet dari analisis = ...?
Jawab

Kandungan parasetamol 3 tablet

ks
1500 mg
ka

93,46 mg
1500 mg
100 mg

= 1401,9 mg
Kandungan parasetamol 1 tablet

1401,9 mg
3

= 467,3 mg

7.6

Perhitungan Perolehan Kembali


a.

Sampel A

Diketahui : Massa parasetamol 1 tablet yang diambil (ka)= 100 mg


Massa sampel yang diperoleh (ks)= 100,73 mg
Ditanya : Perolehan kembali = ...?
Jawab

% perolehan kembali =
=

Massa sampel yang diperoleh


100 %
Massa sebenarnya
100,73 mg
100% = 100,73 %
100 mg

b. Sampel B
Diketahui : Massa parasetamol 1 tablet yang diambil (ka)= 100 mg
Massa sampel yang diperoleh (ks)= 127,06 mg
Ditanya : Perolehan kembali = ...?
Jawab

% perolehan kembali =

Massa sampel yang diperoleh


100 %
Massa sebenarnya

33

c.

127,06 mg
100% = 127,06 %
100 mg

Sampel C

Diketahui : Massa parasetamol 1 tablet yang diambil (ka)= 100 mg


Massa sampel yang diperoleh (ks)= 93,46 mg
Ditanya : Perolehan kembali = ...?
Jawab

% perolehan kembali =
=

Massa sampel yang diperoleh


100 %
Massa sebenarnya
93,46 mg
100% = 93,46 %
100 mg

Perhitungan perolehan kembali rata-rata


% perolehan kembali rata- rata =

7.7

X1 X 2 X 3
3

100,73% 127,06% 93,46%


3

107,08%

Perhitungan LOD dan LOQ


Diketahui

Konsentrasi standar 1 = 5 g/mL


Konsentrasi standar 2 = 10 g/mL
Konsentrasi standar 3 = 15 g/mL
Konsentrasi standar 4 = 20 g/mL
Konsentrasi standar 5 = 25 g/mL
AUC standar 1

= 639368

AUC standar 2

= 1214010

AUC standar 3

= 1734344

AUC standar 4

= 2332255

34

AUC standar 5

= 2708478

Ditanya

: Nilai AUC dalam persamaan (y) = .....?

Jawab

AUC 1
y

= 105129,3x + 148751,5

= 105129,3(5) + 148751,5
= 674398

AUC 2
y

= 105129,3x + 148751,5

= 105129,3(10) + 148751,5
= 1200044,5

AUC 3
y

= 105129,3x + 148751,5

= 105129,3(15) + 148751,5
= 1725691

AUC 4
y

= 105129,3x + 148751,5

= 105129,3(20) + 148751,5
= 2251337,5

AUC 5
y

= 105129,3x + 148751,5

= 105129,3(25) + 148751,5
= 2776984

7.8 Simpangan Baku (SD)


Diketahui
C (g)

:
y

y-y

(y-y)2

639368

674398

-35030

1227100900

10

1214010

1200044,5

13965,5

195035190

15

1734344

1725691

8653

74874409

35

20

2332255

2251337,5

80917,5

6547641806

25

2708478

2776984

-68506

4693072036

(y-y)2
Ditanya

: Nilai Simpangan Baku (

12737724342

Sy
x

) = .........?

Jawab :

y y' '

Sy
x
Sy
x
Sy
x

n2
1273772434 2
32

= 112861,5

7.9 LOD dan LOQ

Sy
Diketahui

x = 112861,5

Dari persamaan y= 105129,3x + 148751,5 diketahui b =105129,3


Ditanya

: LOD dan LOQ = ......?

Jawab

Sy

LOD

x
Slope (b)

LOD

3 112861,5
105129,3

LOD

= 3,22 g/mL

10

Sy

LOQ

x
Slope (b)

LOQ

10 112861,5
105129,3

LOQ

= 10,735 g/mL

36

VIII. PEMBAHASAN
Praktikum Analisis Farmasi II pada kesempatan kali ini dilakukan analisis
kuantitatif penetapan kadar Parasetamol dalam sediaan tablet dengan metode High
Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Prinsip dari metode ini pada umumnya sama dengan metode kromatografi,
yaitu didasarkan pada perbedaan kecepatan migrasi solut yang dipengaruhi oleh
perbedaan afinitas solut terhadap fase gerak dan fase diam (Gandjar dan Rohman,
2007). Metode HPLC ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan
biologi, karena sederhana, dan kepekaannya tinggi (Munson, 1984).
Instrumen HPLC memiliki 2 jenis kolom berdasarkan jenis fase gerak dan
fase diam yang digunakan, yaitu kolom normal phase dan kolom reverse phase.
Dalam praktikum ini digunakan instrumen HPLC dengan jenis kolom reverse
phase. Kolom reverse phase kolom yang fase diamnya bersifat nonpolar
sedangkan fase geraknya bersifat polar, kebalikan dari fase normal. Fase diam
nonpolar yang paling banyak digunakan adalah jenis C18, C8, dan C2 (Mulja dan
Suharman, 1995).
Fase diam yang digunakan pada kolom reverse phase HPLC pada praktikum
ini adalah C18. Penggunaan kolom reverse phase karena parasetamol merupakan
senyawa polar sehingga parasetamol mampu dipisahkan oleh kolom reverse phase
karena kolom reverse phase memiliki gugus oktadesil silika (ODS atau C18) yang
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007). Selain itu, kolom C18 memiliki
jumlah C yang banyak sehingga mengakibat sifat fase diam ini cenderung bersifat
non polar, akibatnya pemisahan terhadap parasetamol akan semakin baik. Selain
itu dengan kolom reverse phase, fase gerak yang digunakan bersifat polar. Fase
gerak yang digunakan pada kolom reverse phase HPLC adalah metanol-air yang
memiliki drajat pro-analisis. Sehingga, dalam penggunaannya pada metode HPLC
harus disaring terlebih dahulu dengan pompa vakum yang berisi membran filter
untuk menyaring pengotor-pengotor bahkan yang berukuran mikro dari fase
gerak. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem
kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau

37

dalam tabung yang sempit, sehingga dapat menyebabkan suatu kekosongan pada
kolom atau tabung tersebut (Gandjar dan Rohman, 2007). Pemilihan metanol-air
sebagai fase gerak karena metanol-air merupakan pelarut universal yang dapat
mengelusi senyawa-senyawa yang bersifat polar,

hal ini disebabkan karena

struktur dari metanol memiliki susunan unik dimana gugus OH dan metil
berdeketan menjadikkan metanol bersifat semipolar, sehingga bila dipakai sebagai
fase gerak, metanol mampu mengelusi senyawa baik yang polar maupun
nonpolar. Selain itu metanol memenuhi persyaratan sebagai fase gerak yaitu
murni, tidak terdapat kontaminan (karena metanol telah disaring sebelum
digunakan), tidak bereaksi dengan wadah (packing), dapat melarutkan sampel,
memiliki visikositas rendah, tidak merusak sampel, dan seperti yang telah dibahan
di atas salah satu syarat suatu fase gerak adalah diperdagangan dapat diperoleh
dengan harga murah (reasonable price). Air merupakan pelarut universal yang
bersifat polar, reasonable price. Sehingga dikombinasikan dengan metanol untuk
dapat memperoleh hasil pemisahan yang efisien.
Sebelum dilakukan proses analisis parasetamol dengan metode HPLC.
Pertama-tama dilakukan pengkondisian kolom. Pengkondisian kolom HPLC
meliputi pengaturan tekanan kolom, laju alir fase gerak, serta pencucian kolom
dengan menggunakan metanol-air. Proses ini dilakukan untuk meningkatkan
kepekaan kolom dan menghindari pengotor atau sisa analit yang masih tertahan
pada kolom pada analisis sebelumnya agar tidak mengganggu analisis dan
merusak kolom. Setelah dilakukan pengkondisian kolom. Selanjutnya dilakukan
analisis sampel.
Fase gerak maupun larutan yang dianalisis dialirkan dengan menggunakan
sistem pompa. Pompa dibutuhkan untuk mengalirkan fase gerak dengan tekanan
sehingga dapat mengalir secara terus menerus melalui kolom secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Proses elusi dilakukan dengan
cara isokratik diamana elusi dengan menggunakan komposisi fase gerak yang
sama tanpa ada perubahan perbandingan fase gerak yang digunakan.
Semua larutan sebelum dialirkan ke sistem harus disaring terlebih dahulu
dengan membran filter dengan tujuan yang sama seperti saat menyaring fase gerak

38

yaitu untuk menyaring pengotor-pengotor bahkan yang berukuran mikro dari


pelarut. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada
sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat terkumpul dalam kolom
atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat menyebabkan suatu kekosongan
pada kolom atau tabung tersebut (Gandjar dan Rohman, 2007).
Injeksi larutan standar dan sampel ke dalam HPLC harus dilakukan dengan
hati-hati dan dijaga agar tidak ada gas yang terinjeksikan sebab adanya gas dapat
menimbulkan gelembung dan pengumpulan gas pada komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Sehingga hasil
analisisnya tidak baik.
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop). Pada saat
pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya
dikeluarkan ke pembuang. Sampel yang melewati keluk ini adalah 20 L. Pada
saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk
sampel dan menggelontor sampel ke kolom (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada saat praktikum larutan standar dan sampel-sampel cair disuntikan
sebesar 40 L. Hal ini dilakukan untuk mengantisipasi cairan yang mungkin
tertinggal saat diinjeksikan, sehingga sampel yang masuk tidak kurang dari 20 L.
Larutan standar yang pertama dielusi adalah larutan standar dengan konsentrasi
terkecil untuk mengantisipasi jika ada larutan yang tertinggal saat elusi. Dimana
bila kita mengukur dari konsentrasi yang paling besar, kemungkinan adanya sisa
konsentrasi dari larutan ini lebih besar. Sehingga akan mempengaruhi konsentrasi
larutan yang lebih kecil yang diukur selanjutnya. Kemungkinan jika konsentrasi
larutan yang tertinggal tadi ikut terbaca maka AUC yang dihasilkan oleh larutan
dengan konsentrasi yang lebih kecil, menjadi lebih besar dibandingkan dengan
AUC larutan dengan konsentrasi lebih tinggi.
Detektor yang digunakan pada HPLC ini adalah detektor photodiode array
(PDA). Detektor ini merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan.
Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada

39

panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses
berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan dapat
ditampilkan. Dengan detektor ini akan diperoleh spektrum UV tiap puncak yang
terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang penting untuk memilih
panjang gelombang maksimal untuk sistem HPLC yang digunakan. Dengan
detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak (similiarity factor)
dengan membandingkan antara spektra analit dengan spektra senyawa yang sudah
diketahui atau berada dalam library HPLC (Gandjar dan Rohman, 2007).
Setelah pengkondisian alat dilakukan pembuatan larutan standar eksternal
parasetamol dengan konsentrasi 5 g/mL; 10 g/mL; 15 g/mL; 20 g/mL; 25
g/mL. Rentang ini dipilih karena kadar sampel yang akan dianalisis berkisar 15
g/ml. Suatu strategi yang baik adalah mengukur baku dengan kisaran 25, 50, 75,
100, 125 dan 150% dari konsentrasi analit yang diharapkan (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Sebelum diinjeksikan, larutan standar disaring terlebih dahulu. Perlu
diperhatikan pada saat penyuntikan larutan ke dalam injektor tidak boleh terdapat
gelembung pada syringe karena dapat mengganggu pengamatan dan gas dapat
menimbulkan gelembung dan pengumpulan gas pada komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Untuk analisis kuantitatif penetapan kadar Parasetamol dalam sediaan tablet
dengan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Dibuat 3
buah sampel dengan cara sembilan (9) buah tablet dengan kandungan parasetamol
500 mg ditimbang. Dan bobot masing-masing tablet ditimbang. Selanjutnya 3
tablet digerus dan ditimbang bobotnya setara dengan 100 mg parasetamol. Hal ini
dilakukan 3 kali. Untuk sampel 1, 2 dan 3. Selanjutnya serbuk yang telah
ditimbang setara dengan 100 mg parasetamol. Dilarutkan dengan metanol-air, dan
dilakukan pengenceran agar diperoleh konsentrasi masing-masing sebesar 15
g/mL.
Sebelum

dilakukan

penginjeksian

sampel,

terlebih

dahulu

dilakukan

penginjeksian larutan standar eksternal parasetamol dengan kosentrasi 5 g/mL;


10 g/mL; 15 g/mL; 20 g/mL; 25 g/mL. Berdasarkan hasil pengamatan

40

terhadap nilai AUC, diperoleh data yang menunjukan bahwa pada larutan standar
parasetamol 5 g/mL diperoleh nilai AUC sebesar 639368 dengan waktu retensi
1,569. Pada larutan standar parasetamol 10 g/mL diperoleh nilai AUC sebesar
1214010 dengan waktu retensi 1,581. Pada larutan standar parasetamol 15 g/mL
diperoleh nilai AUC sebesar 1734344 dengan waktu retensi 1,579. Pada larutan
standar parasetamol 20 g/mL diperoleh nilai AUC sebesar 2332255 dengan
waktu retensi 1,586. Pada larutan standar parasetamol 25 g/mL diperoleh nilai
AUC sebesar 2708478 dengan waktu retensi 1,581. Larutan standar eksternal ini
akan digunakan untuk membuat persamaan regresi linier dan dapat dibuat kurva
kalibrasi sebagai berikut :
3000000
2500000

y = 105129,3x + 148751,5
R = 0,997

2000000
1500000

Linear (Series1)

1000000
500000
0
0

10

15

20

25

30

Dari semua larutan standar yang diukur diperoleh persamaan regresi dengan
menggunakan kelima larutan standar yaitu konsentrasi diperoleh nilai korelasi
(R2) yang cukup tinggi yaitu sebesar 0,997. Berdasarkan perhitungan diperoleh
persamaan regresi y = 105129,3 + 148751,5 dengan y = AUC dan x = kadar
sampel (g/ml). Persamaan ini sudah memenuhi parameter linieritas sehingga
dengan persamaan linier ini, maka dapat digunakan untuk menentukan kadar
parasetamol sampel.
Setelah diperoleh persamaan regresi linier dari larutan standar eksternal
parasetamol. Selanjutnya dilakukan penginjeksian sampel. Elusi dari masing-

41

masing berkisar antara 1,582 menit. Penginjeksian sampel dilakukan sebanyak 3


kali untuk memperoleh keseksamaan.
Uji kualiatif adanya parasetamol dalam tablet dilakukan dengan cara
mencocokan batas spektrum yang diperoleh dengan spektrum standar parasetamol
yang telah tersedia. Berikut adalah spektrum dari ketiga sampel yang diinjeksikan
:

Gambar 2. Spektrum sampel A

Gambar 3. Spektrum Sampel B

42

Gambar 4. Spektrum Sampel C


Secara kuantitatif berdasarkan perhitungan diperoleh kadar sampel rata-rata
dari 3 kali penyuntikan adalah 107,08 mg. Kadar yang diperoleh dari hasil analsis
adalah 535,41 mg dengan perolehan kembali sebesar 107,08%.
Hasil yang diperoleh melebihi 100 % dari kadar sebenarnya. Hal ini
kemungkinan karena ketidaktepatan pemipetan pada saat pembuatan larutan
sampel.
Setelah penetapan kadar parasetamol dilanjutkan dengan menetapkan batas
deteksi (LOD) dan batas kuantisasi (LOQ) dari suatu sampel paracetamol. LOD
dan LOQ merupakan dua di antara 8 parameter yang menentukan validitas suatu
metode analis (Gandjar & Rohman, 2007). Dari hasil perhitungan diperoleh batas
deteksi (LOD) sebesar 3,22 g/mL dan batas kuantisasi (LOQ) sebesar 10,735
g/mL. Hal ini menunjukan bahwa jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan
blangko adalah 3,22 g/mL. Dan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang
masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama adalah 10,735 g/mL.

43

IV. KESIMPULAN
Kadar parasetamol yang diperoleh 535,41 mg dengan perolehan kembali
sebesar 107,08%. Dan dari validasi metode diketahui jumlah terkecil analit dalam
sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan
dibandingkan dengan blangko adalah 3,22 g/mL. Dan kuantitas terkecil analit
dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama adalah
10,735 g/mL.

44