C.

Peralatan Khusus yang Digunakan dalam PCR

PCR memerlukan alat khusus dalam prosesnya, alat-alat tersebut antara lain:

1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)

Gambar 1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Sumber:

http://www.hoeferinc.com/)
2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
Perkin-Elmer/Cetus

Thermal

Cycler

adalah peralatan

laboratorium yang

digunakan untuk analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan DNA tertentu.

Gambar 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler

(sumber:

http://www.sci-support.com )
3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest
Scientific). Alat ini memiliki sebuah thermal block dengan lubang-lubang untuk
memasukkan tabung campuran PCR.

Gambar 3. Thermocycler microfuge tubes

D. Tahapan dan Pengembangan Teknik PCR
1. Tahapan Proses PCR

Gambar 4. Tahapan PCR (Campbell, 2002)

Berdasarkan gambar diatas, Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga
proses, yaitu:

A. Denaturasi
Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal.
Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 95 oC.
Denaturasi awal dilakukan selama 1 3 menit diperlukan untuk meyakinkan
bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal.
Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas
DNA terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya
aktivitas enzim polimerase.
2. Annealing
Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer
merupakan tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan
pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA
yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing
dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya
pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat
meningkatkan kespesifikan amplifikasi.
Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70740C bertujuan
untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer
(tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC, yaitu suhu optimal untuk
TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke
suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak
spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah.
Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak
spesifik semakin banyak.
3. Extension
Extension merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau
sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan
pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini
akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan
konsentrasi DNA.

Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan
(template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat
dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara
eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA
target. Jumlah relatif molekul yang dihasilkan pada setiap siklus dapat dilihat pada
tabel berikut (Fatchiyah, 2012):
Deteksi Produk Hasil PCR
Setelah selesai melakukan PCR, produk PCR bisa dilihat dengan cara meloading pada DNA Elektroforesism gel agarosa. Namun sebelum itu, kita harus
membuat gel (agarose) yang mengandung Ethidium bromide (EtBr) berdasar cetakan
yang tersedia dalam perangkat tersebut. EtBr adalah pewarna fluorescent yang
interkalasi ke dalam DNA.Untuk kebutuhan deteksi, biasanya cukup menggunakan 35 ul saja dari total produk PCR 50 ul. Jadi, pipet sample sebanyak volume tersebut,
campurkan dengan loading buffer, dan running selama kira-kira 15 menit.
Setelah itu angkat gel dari tank, dan tempatkan pada UV Transilluminators.
Visualisasi hasil PCR akan tampak seperti gambar berikut.

Gambar 4 . Visualisasi hasi PCR (Sumber: http://biotektanaman.wordpress.com)

Pada gambar tersebut ada no. 1 sampai 4 yang terletak pada sumur (well) gel
agarose. Nomor 1 (line 1) bukan merupakan hasil PCR, namun sebuah
penanda (marker). Marker DNA tersebut memiliki ukuran yang telah diketahui yang
kisarannya antara 100 bp sampai 21 kilo bp. Pada gambar tersebut tampak ukurannya
yaitu 100, 200, sampai 500 bp. Line 2 adalah kontrol negatif, yaitu hanya
menggunakan loading buffer, sedangkan line 3 dan 4 adalah produk PCR. Dari
gambar tersebut kita bisa menyimpulkan bahwa produk PCR tersebut berukuran 450
bp.

E. Faktor-faktor yang terlibat dalam PCR

Keberhasilan

PCR

sangat

ditentukan

oleh

beberapa

faktor

yaitu:

(1)Deoksiribosanukleotida triphospat (dNTP); (2) Oligonukleotida primer; (3) DNA

template; (4) DNA Polimerase; (5) Komposisi larutan buffer; (6) Jumlah siklus reaksi
dan (7) suhu.
1. Deoksiribosanukleotida triphospat (dNTP)
Larutan dNTP yang akan digunakan dalam PCR sebaiknya dinetralkan
menjadi pH 7,0 dan untuk menentukan konsentrasinya sebaiknya digunakan
metode spektroskopi. Konsentrasi masing-masing dNTP yang diperlukan dalam
PCR berkisar antara 20-200 M dan keempat dNTP yang digunakan sebaiknya
mempunyai konsentrasi yang sama untuk memperkecil kesalahan penggabungan
nukleotida selama proses polimerase (Triwibowo, 2006:18). . Konsentrasi yang
tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang
pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi
tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan
tidak akan merubah secara bebas.
2. Primer
Susunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan PCR. Di dalam
proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang
diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Konsentrasi primer yang optimal dalam

PCR berkisar antara 0,1 0,5 M. Konsentrasi primer yang lebih tinggi dari 1,0
M dapat menyebabkan hasil polimerasi nonspesifik terakumulasi. Panjang
oligoneukleotida yang digunakan sebagai primer umumnya 18-28 nukleotida dan
mempunyai G+C sebesar 50-60%.
Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah
diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Dalam melakukan perancangan
primer harus dipenuhi kriteria-kriteria sebagai berikut:
a. Panjang primer
Di dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akan
dipilih. Umumnya panjang primer berkisar antara 18 30 basa. Primer dengan
panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah. Untuk
ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan
primer di tempat lain yang tidak diinginkan) tinggi, ini akan menyebabkan
berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh
pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. Sedangkan untuk panjang primer lebih
dari 30 basa tidak akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna dan
ini akan menyebabkan lebih mahal.
b. Komposisi primer.
Dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya. Rentetan
nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan spesifisitas
primer yang dapat memungkinkan terjadinya mispriming di tempat lain.
Kandungan (G+C)) (% jumlah G dan C) sebaiknya sama atau lebih besar dari
kandungan (G+C) DNA target. Sebab primer dengan % (G+C) rendah
diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif
pada tempat yang dituju dengan demikian akan menurunkan efisiensi proses
PCR. Selain itu, urutan nukleotitda pada ujung 3 sebaiknya G atau C.
Nukleotida A atau T lebih toleran terhadap mismatch dari pada G atau C, dengan
demikian akan dapat menurunkan spesifisitas primer.
c. Melting temperature (Tm)
Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda
DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer

akan berpengaruh sekali di dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Tm

berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Secara teoritis Tm
primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus [2(A+T) + 4(C+G)].
Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50 65oC.
d. Interaksi primer-primer
Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus
dihindari. Demikian juga dengan terjadinya mispriming pada daerah lain yang
tidak dikehendaki, ini semua dapat menyebabkan spesifisitas primer menjadi
rendah dan di samping itu konsentrasi primer yang digunakan menjadi
berkurang selama proses karena terjadinya mispriming. Keadaan ini akan
berpengaruh pada efisiensi proses PCR.
3. DNA Cetakan (DNA template)
Kualitas dan kuantitas DNA template sangat berpengaruh pada PCR. Salah
satu parameter dan kualitas DNA dapat dilihat dari kemurnian dan ukuran genom
DNA. Kemurnian yang rendah, misalnya karena adanya metabolit sekunder, akan
menghambat penempelan primer pada susunan basa pada rantai DNA . Ukuran
DNA tempalte yang kecil dapat mengurangi peluang penempelan primer pada
template (Dadan S dan Imron, 2010:561).
Selain itu,

jumlah DNA dalam reaksi PCR perlu dioptimalkan untuk

mendapatkan hasil amplifikasi yang optimal. DNA cetakan yang digunakan

sebaiknya berkisar antara 105 106 molekul dan yang digunakan dapat berupa
DNA yang sudah dimurnikan dengan sentrifugasi gradien CsCl maupun dengan
menggunakan sel yang dicampur dengan komponen PCR yang lain (Triwibowo,
2009:19).
4. Enzim yang digunakan
Proses PCR menggunakan beberapa macam enzim dan secara umum konsentrasi
enzim yang dianjurkan untuk melakukan PCR adalah 2,5 unit/reaksi. Pada siklus
yang lebih banyak maka sebaiknya digunakan unit yang lebih besar dan tidak
melebihi 2,5 unit karena konsentrasi enzim yang terlalu tinggi akan menurukan
spesifitasnya,

Apabila jumlah enzim berlebihan akan mengakibatkan akumulasi produk non

spesifik, sedangkan jika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produk yang
diinginkan. Triwibowo (2009:20) menyatakan bahwa untuk siklus yang lebih
banyak sebaiknya digunakan unit yang lebih besar juga dan tidak melebihi 2,5 unit
karena konsentrasi enzim yang terlalu tinggi akan menurunkan spesifitasnya.
5. Larutan Buffer
Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh
karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di
sini adalah untuk menjamin pH medium. Buffer PCR yang digunakan berkaitan
dengan pH dan kapasitas buffernya. Dalam perdagangan ada dua jenis buffer PCR
yaitu Low-salt buffer (pH 8,75 dan kapasitas buffer rendah) dan High-salt
buffer (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Umumnya buffer PCR tersedia sesuai
dengan jenis polimerase DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung pada
DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 5
kilobasa biasanya diperlukan low-salt buffer sedangkan untuk panjang DNA
target lebih besar dari lima kilobasa digunakan high-salt buffer.
Menurut Triwibowo (2009: ) buffer yang dianjurkan untuk melakukan PCR
adalah 10-50 mM Tris-HCl, pH 8,3 8,8 ( pada suhu 20 0 C). Untuk membantu
proses penempelan primer, dapat juga ditambahkan KCl sampai konsentrasi 50
mM. Jika konsentrasi KCl lebih dari 50mM, maka akan menghambat aktivits Taq
DNA polimerase. Komponen Larutan Buffer lain yang perlu ditambahkan adalah
gelatin atau BSA sebanyak 0,1 % dan detergen non-ionik yang berfungsi untuk
mempertahankan kestabilan enzim Taq DNA polimerase.
6. Jumlah Siklus Reaksi
Pada

umumnya

PCR

dilakukan

dengan

mengulangi

siklus

reaksi

pelipatgandaan sebanyak 20 -30 siklus. Banyaknya siklus yang diperlukan

tergantung terutama pada konsentrasi awal molekul DNA target yang akan
dilipatgandakan. Siklus yang terlalu banyak justru akan meningkatkan konsentrasi
produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi
kuantitas produk yang diharapkan. Pada tabel 1 dapat digunakan sebagai patokan
untuk menentukan banyaknya siklus yang diperlukan.

7. Suhu
Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah
satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini suhu berkaitan
dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Suhu
denaturasi DNA templat berkisar antara 93 95oC, ini semua tergantung pada
panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target.
Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA
yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA
templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi
DNA templat tidak sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan
adalah 94oC (Darmo & Ari, 2000).
Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 - 60 oC.
Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk
proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm
5)oC sampai dengan (Tm + 5)oC. Dalam menentukan suhu annealing yang
digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan nontarget,
dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh eksperimen.
Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada suhu 72 oC karena
suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan
untuk proses PCR.
F. Aplikasi PCR dalam Kehidupan Sehari-hari
PCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada
penelitian biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA
dari berbagai macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba
(mammoth) berbulu yang telah membeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit
darah;, jaringan, atau air

mani yang ditemukan di tempat kejadian perkara

kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk diagnosis kelainan genetik
sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh virus yang sulit
terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk., 2004:395).

Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang
dengan modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan
banyak sekali aplikasi praktis. Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat
disebutkan sebagai berikut: kloning hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian
evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit genetik; determinasi seks pada sel
prenatal; kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka ayah pada kasus paternal);
dan masih banyak lainnya.
Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh
Sunarto (1996) yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat
diagnosis penyakit thalesemia. Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan
analisis DNA dilakukan dengan prosedur yang panjang dan rumit, yaitu pertamatama membentuk perpustakaan (library construction) melalui digesti dengan
endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping, subkloning dan
terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak
pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah
dapat ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik
molekular yang terbukti sangat akurat.
Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini
berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu
antara lain sebagai berikut:
1.
2.
3.
4.

Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah
Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi
Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami
kelainan sebelum dilahirkan.

5. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat

menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen.
6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui
dari mana spesies tersebut berasal.
7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan finger print