Anda di halaman 1dari 8

1.

Metode Spektrofotometri
Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi
radiasi elektromagnet. Cahaya terdiri dari radiasi terhadap mana mata manusia peka,
gelombang dengan panjang berlainan akan menimbulkan cahaya yang berlainan
sedangkan campuran cahaya dengan panjang-panjang ini akan menyusun cahaya putih.
Cahaya putih meliputi seluruh spektrum nampak 400-760 mm.
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan
spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual
dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu
sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk
menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.
Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari tingkat
energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan elektron tidak diikuti
oleh perubahan arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan tereksitasi singlet (Khopkar,
2003).
Spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya penyerapan energi cahaya
oleh suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari panjang gelombang radiasi, demikian
pula pengukuran penyerapan yang menyendiri pada suatu panjang gelombang tertentu
(Underwood, 1986).

Dalam analisis spektrofotometri digunakan suatu sumber radiasi yang menjorok


ke dalam daerah ultraviolet spektrum itu. Dari spektrum ini, dipilih panjang-panjang
gelombang tertentu dengan lebar pita kurang dari 1 nm (Anonim, 1979).
2. Hukum Lambert-Beer
Radiasi elektromagnetik yang dikenakan pada suatu molekul atau atom, sesuai
dengan struktur molekul atau atom tersebut. Sistem atau gugusan yang mengabsorbsi
radiasi elektromagnetik UV-Vis disebut gugus kromofor. Hampir semua gugus kromofor
merupakan ikatan kovalen yang tidak jenuh. Menurut hukum Lambert, absorban
berbanding lurus dengan ketebalan lapisan yang disinari, dan menrurut hukum Beer, yang
berlaku hanya untuk cahaya monokromatik dan larutan sangat encer dimana absorban (A)
dan konsentrasi (C) adalah proposional dan adalah absortifitas molar (g/molar). Sehingga
hukum Lambert-Beer sebagai berikut :
A= c.b
Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :

A=

log ( Io / It )

= abc

Keterangan :
Io = Intensitas sinar datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
a = Absorptivitas
b = Panjang sel/kuvet
c = konsentrasi (g/l)
A = Absorban
3. Spektrofotometri Berdasarkan Filter Fotometri
Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter
fotometri sebagai berikut :
a. Daerah jangkauan spektrum
Filter fotometr hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak
(400-750 nm). Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah
tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm).
b. Sumber sinar
Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer
menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak,
UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak.
c. Monokromator
Filter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro
digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.
d. Detektor
- Filter fotometer menggunakan detektor fotosel

- Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.


4. Pembagian Spektrofotometri
Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang
digunakan. Diantaranya adalah sebagai berikut:
a. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)
Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah
cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat
ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai
750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru,
hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke
dalam sinar tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah
lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur
kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi
(3422 C) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai
sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii
warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat
berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa
berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan

analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan
harus benar-benar stabil.
b. Spektrofotometri UV (ultraviolet)
Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan
interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm.
Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.
Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Merupakan isotop hidrogen yang stabil
yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu
proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak
memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti
dua, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat
menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening
dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun
tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan
filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih
dan

larut

sempurna.

Tidak

ada

partikel

koloid

apalagisuspensi.

Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan
spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin,
maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa.

Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang
sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi
tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.
c. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan
hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi
dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample
berwarna juga untuk sample tak berwarna.
Derivatif merupakan metode manipulatif terhadap spektra pada spektrofotometri
UV-Vis (Connors, 1982). Metode spektrofotometri derivatif dapat digunakan untuk
analisis kuantitatif zat dalam campuran dimana spektrumnya mungkin tersembunyi
dalam suatu bentuk spektrum besar yang saling tumpang tindih dengan mengabaikan
proses pemisahan zat terlebih dahulu. Spektrum yang dialih bentuk ini menghasilkan
profil yang lebih rinci yang tidak terlihat pada spektrum normal (Connors,1982;
Willard,1988).
Kegunaan spektrofotometri derivatif adalah (Mulja, 1995):
1. Apabila menghadapi campuran dua komponen yang spektrumnya saling tumpang
tindih, maka analisis kuantitatif cara derivatif menjadi metoda yang terpilih.
2. Analisis kuantitatif campuran dua komponen yang keruh.

3. Analisis kuantitatif campuran dua komponen yang merupakan isomeri (kecuali


isomer optis aktif atau rasemik).
4. Spektra derivatif dapat dipakai untuk maksud kualitatif atau sebagai data
pendukung.
d. Spektrofotometri IR (Infra Red)
Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh.
Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang
mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m.
Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun
biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk
mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap
serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi
spesifik.

Dari pembagian daerah spektrum elektromagnetik tersebut diatas, daerah


panjang gelombang yang digunakan pada alat spektrofotometer infra merah adalah
pada daerah infra merah pertengahan, yaitu pada panjang gelombang 2,5 50 m
atau pada bilangan gelombang 4.000 200 cm-1. Satuan yang sering digunakan dalam
spektrofotometri infra merah adalah Bilangan Gelombang (

) atau disebut juga

sebagai Kaiser.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR
terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan
dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus
dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan
mengganggu signal kurva yang diperoleh.
Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada
penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared
Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan
pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.