Genmica y sus aplicaciones en Biotecnologa

Actualmente se cuenta con el acceso a las secuencias de miles de millones de

nucletidos que proporcionan las bases moleculares para diversos organismos,
desde bacterias y plantas hasta insectos, seres humanos y otros mamferos. Con
la revolucin de esta tecnologa se desarrollaron diferentes mtodos para
manipular el DNA; por lo que surgi la tecnologa del DNA recombinante, lo que
posibilit la creacin de cromosomas con combinaciones de genes distintos. La
tecnologa del DNA recombinante tuvo una gran influencia sobre muchos
aspectos, entre ellos las Biotecnologa, que ha estado creciendo en los ltimos
aos e incluyendo ciencias como la genmica, inmunologa, el desarrollo de
terapias farmacuticas, pruebas de diagnstico, agricultura y alimentos.
El genoma es el grupo total de diferentes molculas de DNA que se encuentran en
las clulas de una especia particular; en seres humanos el genoma comprende 25
molculas de DNA diferentes: un tipo nico de DNA mitocondrial y 24 molculas
de DNA nuclear diferentes; este est organizado en cromosomas. La genmica se
dedica a identificar los genes presentes en los cromosomas y determinar cual es
su funcin.
El cdigo gentico es la base de la informacin del DNA, esta informacin est
organizada en unidades llamada genes, que es una unidad funcional que consiste
en un segmento del DNA localizado en un sitio especfico del genoma y que
codifica para una protena especifican. Ciertas aplicaciones biotecnolgicas
implican hacer genes artificiales sintetizando cadenas de DNA que son puestas
dentro de otras clulas.
Marco Histrico
En los aos 70s surgi la era de la ingeniera gentica. En 1972 Paul Berg aisl
una enzima de restriccin que corta el DNA. Berg despus us esa enzima de
restriccin con otra enzima llamada ligasa para cortar y pegar dos cadenas de
DNA. l cre la primera molcula de DNA recombinante.
En 1977, el primer producto hecho por un organismo genticamente modificado
fue creado. Genentech, Inc. produjo la protena humana somatostatina (hormona
de crecimiento humano) en una bacteria. El trmino transgnico describe a un
organismo que tiene genes de otro organismo que son puestos en su genoma por
medio de tcnicas de DNA recombinante.
En 1982, Eli Lilly Company fue capaz de fabricar insulina humana colocando el
gen de la insulina dentro de las bacterias.

La biotecnologa en los aos 70s y 80s asisti el nacimiento de Louise J. Brown

en Inglaterra en Julio de 1978. Ella fue el primer bebe del mundo con xito nacido
mediante la fertilizacin in vitro.
En 1989 la Exxon Oil Company patent un microorganismo come-petrleo que
fue usado para limpiar el derrame de petrleo en Alaska.
En 1984 Kary Mullis invent la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) para multiplicar secuencias de DNA fuera de una clula. La PCR abri las
puertas para la clonacin de genes sintticos y provoc la produccin de muchos
animales y plantas transgnicos.
De 1990 al 2000 surgi la era de la terapia gnica cuando el primer paciente
recibi clulas genticamente alteradas para tratar una enfermedad que debilitaba
el sistema inmunitario. La biotecnologa actualmente est haciendo lo posible para
desarrollar tratamientos farmacogenticos que se adapten al material gentico de
una persona. Estos tratamientos proporcionaran ms beneficios y reducirn los
riesgos respecto a los medicamentos tradicionales.

Aplicaciones
Farmacogentica
La farmacogentica es una disciplina biolgica que estudia el efecto de la
variabilidad gentica de un individuo en su respuesta a determinados frmacos,
mientras la farmacogenmica estudia las bases moleculares y genticas de las
enfermedades para desarrollar nuevas vas de tratamiento.
La teraputica gentica de una afeccin tiene varias facetas:

Genotipificacin de individuos para predecir su patrn de respuestas

favorables y adversas a los tratamientos farmacolgicos
Uso del conocimiento de la gentica y biologa celular para reconocer
nuevos blancos para el desarrollo de frmacos.
Uso de tcnicas genticas para producir frmacos, vacunas y otros agentes
para el tratamiento de enfermedades

La farmacogentica promete incrementar la efectividad de los medicamentos y

reducir los efectos secundarios peligrosos.

15 a 35% de los individuos no reacciona a los bloqueadores beta o slo de

forma inadecuada

7 a 28% de los enfermos no muestra respuesta, o es inapropiada, a los

inhibidores de la enzima conversora de angiotensina
9 a 23% de los individuos responde de manera inadecuada a los inhibidores
selectivos de la recaptacin de serotonina
20 a 50% de las personas reacciona de modo inadecuado a los
antidepresivos tricclicos

Estas variaciones dependen de combinaciones de polimorfismos comunes en un

nmero limitado de genes. Esto surge de la observacin clnica de que existan
pacientes con muy baja o muy altas concentraciones del frmaco en plasma u
orina a los que seguidamente se les realizaban pruebas bioqumicas y metablicas
que mostraban que estas variaciones eran heredadas. Tiempos ms tarde se
descubren las enzimas metabolizadoras de frmacos y a los genes que las
codifican, se determina que variaciones en las secuencias de estos, se encuentran
asociadas con respuestas interindividuales a ellas y que pueden provocar
disminucin y/o prdida del efecto teraputico o agravar la respuesta clnica.
Procedimiento:
Los individuos pueden ser estudiados para encontrar los polimorfismos genticos
por la observacin del fenotipo o el genotipo. El estudio del fenotipo en los
polimorfismos de las enzimas metabolizadoras de frmacos se realiza mediante
un anlisis indirecto de la variacin gentica, examinando la capacidad metablica
individual. Con este mtodo se procede a la administracin de un medicamento,
se determinan los metabolitos para examinar de forma bioqumica las variaciones
farmacogenticas y poder clasificar al individuo como metabolizador pobre,
intermedio o ultra rpido (Brockmoller J y cols 2000).
Las desventajas de este sistema incluyen:

Especificidad limitada de los frmacos "sondas".

Efectos potenciales adversos de la administracin del frmaco "sonda".
El hecho de que el fenotipo puede estar influido por varios factores como,
otros frmacos que se administran concurrentemente, alteraciones en los
niveles hormonales y enfermedades.

Hasta estos momentos han sido identificados polimorfismos en ms de 30

enzimas que metabolizan frmacos en humanos, varias de ellas con sustanciales
diferencias tnicas y muchas de las cuales, causan cambios funcionales en las
protenas que codifican y por lo tanto en el metabolismo de drogas. (Evans WE y
cols 1999).

Enzima CYP450
Las enzimas citocromo P450 representan una superfamilia de enzimas
microsomales metabolizadoras de drogas que se encuentran en el hgado y
metabolizan ms medicamentos que ninguna otra familia de enzimas (Wilkinson
GR, 2001). Un miembro de esta familia, el citocromo P-450 2D6(CYP2D6) es
probablemente el polimorfismo gentico mejor caracterizado entre las enzimas
citocromo P450 y representa la primera enzima metabolizadora de drogas humana
en ser clonada y caracterizada a nivel molecular. (Gonzlez FJ, 1988).
Esta enzima es el principal catalizador en la biotransformacin de gran nmero de
agentes teraputicos, entre los que se encuentran drogas utilizadas en el
tratamiento de enfermedades psiquitricas, neurolgicas y cardiovasculares. En la
actualidad ms de 75 alelos para CYP2D6 han sido descubiertos.
Por ejemplo, se ha estimado que una dosis diaria de 10-20 mg de nortriptilina es
suficiente para un paciente metabolizador pobre CYP2D6 y, sin embargo, un
metabolizador ultrarrpido que herede mltiples copias del gen requerira ms de
500 mg al da. (Daln P y cols. 1988).

Drogas para el
tratamiento
psiquitrico y
enfermedades
neurolgicas

Amitriptilina, clomipramina, clozapina, desipramina,

desmetilcitalopram,fluvoxamina,fluoxetina,
haloperidol
imipramina,levomepromazina,maprotilina,mianserin,
nortriptilina, olanzaopina, paroxetina, perfenazina,
risperidona, tioridazina,tranilcipromina,venlafaxina,
zuclopentizxol

Drogas para el
tratamiento de Alprenolol, amiodarona, flecainida, indoramin,
enfermedades mexiletina, oxprenolol,propanolol,timolol
cardiovasculares
Algunas drogas sustratos del citocromo P450 CYP2D6

Glutatin S-transferasas
El glutatin se conjuga a muchos xenobiticos, lo cual incluye medicamentos
cuyos metabolitos oxidativos son potencialmente dainos (Ketterer B. 1988). Esta
conjugacin inactiva estos metabolitos reactivos. Estas reacciones son catalizadas
por la familia de las enzimas glutatin S-transferasas humanas (GST).
Los genes que codifican estas enzimas son altamente polimrficos. Por ejemplo,
los genes GST-M1 y GST-T1 aparecen completamente delecionados entre el 50 y
el 25 % en la mayora de las poblaciones, respectivamente. (Stanulla M y cols.
2000).

Numerosos estudios reportan asociacin entre los polimorfismos en los genes

GST y la eficacia y/o toxicidad en la quimioterapia del cncer. En pacientes con
cncer de mama la delecin del gen GST-M1 o el GST-T1 ha sido asociada con
una mayor supervivencia principalmente cuando ambos genes estn
delecionados. (Ambrosone CB y cols. 2001).
Enzima Tiopurina Metiltransferasa (TPMT)
El polimorfismo gentico de TPMT constituye uno de los mejores ejemplos
desarrollados de farmacogentica clnica. La TPMT es una enzima citoslica que
cataliza la metilacin de los compuestos sulfidrlicos heterocclicos y aromticos
incluyendo los agentes tiopurnicos azatioprina, mercaptopurina y tioguanina.
(Yates CR y cols. 1997). Estas drogas se usan como antineoplsicos e
inmunosupresores en el tratamiento de enfermedades como la leucemia
linfoblstica aguda, enfermedades reumticas y en el transplante de rganos
slidos (ciclosporina).
El principal mecanismo de citotoxicidad de estos frmacos es por la va de
incorporacin de nucletidos tioguaninas (TGN) en el ADN. La actividad de esta
enzima se considera altamente variable y polimrfica en todos los estudios
realizados hasta la fecha, cerca del 90 % tienen actividad alta; el 10 %, actividad
intermedia y el 0,3 %, baja o una indetectable actividad enzimtica. (Evans &
Relling 1991).
Tres alelos (TPMT*2, TPMT*3A y TPMT*3C) estn involucrados en el 95 % de los
casos de actividad enzimtica baja o intermedia. La presencia de estos 3 alelos es
predictiva del fenotipo. Los pacientes heterocigticos que tengan un alelo salvaje y
una de estas variantes allicas, presentan una actividad intermedia de la enzima
TPMT, mientras que los homocigticos que heredan dos de los alelos mutados
son deficientes de la enzima.(Relling MV y cols. 1983).
Utilizando la tcnica de PCR alelo especfica o por PCR utilizando enzimas que
crean fragmentos polimrficos de longitud variable (RFLP), es posible detectar
ms del 90 % de todos los alelos mutados, lo que permite diagnosticar la
deficiencia TPMT y el estado de heterocigtico en base al genotipo.(Almuete VI,
2000).

Los avances en la farmacogentica ofrecen un mecanismo que permite prescribir

frmacos apartndose de la experiencia, y no solo identificar el mejor frmaco sino
realizar recomendaciones de la dosis ms segura y efectiva segn el genotipo
individual de cada paciente. Esto reducir la necesidad de hospitalizacin y los
costos asociados.

Microorganismos
Protenas recombinantes y vacunas
Muchas protenas teraputicas que se extraan con anterioridad de fuentes de
animales o humanas pueden elaborarse como protenas recombinantes mediante
clonacin de expresin (Rusell y Clarke, 1999).
Las bacterias son huspedes ms simples para clonacin de expresin. Es posible
desarrollar grandes volmenes de cultivos y pueden definirse y controlarse los
medios para evitar la contaminacin. Sin embargo, los polipptidos que se
producen en las bacterias no son idnticos a las protenas humanas naturales.
Casi todas las protenas humanas teraputicas estn glucosiladas y las bacterias
no reproducen los patrones de glucosilacin.
En la tecnologa del DNA recombinante se utilizan ciertas enzimas como
endonucleasas de restriccin, DNA ligasas, transcriptasas inversas; para cortar y
aislar un gen determinado que tiene informacin para producir una protena en
particular e introducirlo en las clulas de un organismo distinto del inicial. Por lo
que este organismo tendr DNA recombinante a partir del cual fabricar una
nueva protena. Por lo tanto la protena producida se denomina protena
recombinante (PR).
La recombinacin de genes humanos en el DNA de bacterias es una de las
posibilidades que ofrece la biotecnologa y posibilita obtener protenas humanas
con fines teraputicos. La primer PR aprobada para uso en humanos fue la
insulina humana producida en Escherichia coli. Esta tcnica es de gran valor
porque las bacterias se reproducen rpidamente y pueden duplicar su nmero
cada 20 minutos; por lo que se pueden obtener en poco tiempo muchas copias del
gen humano inserto en el DNA bacteriano y producir grandes cantidades de PR.
Hasta el ao 2010, el nmero de productos biofarmacuticos aprobados por la
FDA sumaba ms de 200, de los cuales la gran mayora son PR (Walsh, 2010).
A escala industrial, la produccin de protenas recombinantes involucra las
siguientes etapas:

Fermentacin: las bacterias son cultivadas en bioreactores que contienen

un medio de cultivo nutritivo.
Extraccin: las clulas son centrifugadas para recuperar las protenas de su
interior.
Purificacin: se separa la PR de las otras protenas bacterianas

Formulacin: la PR es modificada para conseguir una forma estable y

estril que puede administrarse teraputicamente.

La bacteria E. coli sigue siendo una plataforma ampliamente usada para la

produccin de PR, ya que presenta una serie de ventajas importantes (Demain y
Vaishnav, 2009): i) su genoma es conocido desde hace varios aos, lo que amplia
considerablemente las posibilidades de su manipulacin gentica, ii) existe una
gran cantidad de conocimiento acumulado sobre su fisiologa y metabolismo, iii) se
tienen varios vectores bien establecidos para la produccin de PR, iv) puede
crecer rpido en medios muy simples, con altos niveles de produccin de PR.
Actualmente, cerca del 30% de las PR de uso teraputico son producidas
empleando E. coli (Ferrer-Miralles y col; 2009).
Uso de vectores de expresin:
La informacin gentica de la protena a producir, generalmente se inserta en un
vector (plsmido) de expresin. Se emplean plsmidos de alto nmero de copias
(por arriba de 500 copias por clula). El nmero de copias es, en principio, funcin
del origen de replicacin del plsmido; aunque las condiciones ambientales del
cultivo y el estado fisiolgico de la bacteria tienen una fuerte influencia sobre el
nmero de copias (Syadi y col; 1989).
Se asume que un alto nmero de copias del plsmido resulta en un alto nmero
de copias del gen de inters, y por lo tanto, la cantidad de PR producida ser
mayor.
Seleccin de la cepa de produccin:
Para alcanzar altas productividades se toma en cuenta la seleccin de la cepa
adecuada. Se deben considerar aspectos cinticos, el genotipo y fenotipo de las
cepas, el tamao de la PR a producir y la presencia de enlaces disulfuro. En
general se buscan cepas con baja tasa de mutacin o de insercin de secuencias
provenientes del plsmido. Las cepa derivadas de E. coli K-12y E. coli B son las
ms empleadas.
La cepa BL21 es preferida en el mbito industrial. Adems de carecer de las
proteasas Lon y Omp-t (lo cual reduce la degradacin de la PR dentro de la
bacteria), produce bajas cantidades de acetato (subproducto indeseable) (Phue y
col; 2005).
Las bacterias Gram-positivas como Bacillus subtilis y Bacillus megaterium tambin
se han usado para la produccin de PR. B. subtilis es importante en la produccin
industrial de proteasas y algunas vitaminas. Al carecer de membrana externa,

estas bacterias pueden secretar gran cantidad de protenas plegadas al medio

extracelular y contienen una baja cantidad de pirgenos (Fu y col; 2007).
Cultivo bacteriano:
Para maximizar la productividad de PR, se prefiere alcanzar altas densidades
celulares en el biorreactor. El medio de cultivo debe estar balanceado para la
produccin de biomasa y PR. Los principales componentes son C, N, P, S, K y
Mg; cofactores como Mb, Co, Ni, Fe, Ca, Cu, Mn. En cultivos de matraz agitado se
agrega mono y di fosfato de potasio como amortiguador de pH; en cultivos en
biorreactor el pH se controla adicionando cido o base (Shiloach y Fass, 2005).
Transferencia de oxgeno al biorreactor:
Los cultivos de E. coli para la produccin de PR llevados bajo condiciones
aerobias, por lo que se obtienen mayores rendimientos de biomasa y producto
debido a que la generacin de energa es mayor que bajo condiciones anaerobias.
Purificacin de PR:
La purificacin de las PR producidas por E. coli depende de la localizacin de la
misma. Si la PR fue acumulada en el citoplasma, el primer paso es la ruptura
celular mediante medios mecnicos o qumicos. La acumulacin de PR en el
citoplasma con frecuencia lleva a la acumulacin de cuerpos de inclusin, por lo q
es deseable ya que protegen a la PR de la protelisis y pueden ser separados por
centrifugacin continua.
Algunos cuerpos de inclusin pueden tener agregadas contaminantes como DNA,
RNA y chaperonas, haciendo que la proporcin de PR en el cuerpo de inclusin
llegue a ser baja (Singh y col; 2006).
La purificacin final de la protena puede hacerse mediante mtodos
cromatogrficos como: intercambio aninico y catinico, interaccin hidrofbica y
cromatografa de fase reversa.
La PR purificada debe tener un contenido mnimo de endotoxinas. La adicin de
polietilnglicol (PEGilacin) a la protena permite reducir reacciones
inmunognicas adversas (Kumagai y col; 2010).
Tambin pueden producirse antgenos y anticuerpos como PR, que se emplean en
la confeccin de kits o en el diagnstico de diversas enfermedades. Los
anticuerpos teraputicos que se producen de modo artificial estn diseados para
ser monoespecficos. Estos son anticuerpos monoclonales secretados por
hibridomas. Los hibridomas se propagan como clonas individuales, cada una de

las cuales puede proporcionar una fuente permanente y estable de un anticuerpo

monoclonal nico.

El mercado de PR producidas por bacterias es muy importante a nivel mundial; los

avances en esta rea han logrado mantener el inters en lograr sistemas de
expresin y de cultivo bacterianos cada vez mejores. Conociendo la fisiologa de la
bacteria durante su expresin y la produccin industrial se puede incrementar los
rendimientos y procesamientos de protenas recombinantes.

Referencias:
1. Brockmoller J, Kierchheiner J, Meisel C. Pharmacogenetic diagnostics of
cytochrome P450 polymorphisms in clinical drug development and in drug
treatment. Pharmacogenomics 2000;1:125-51.
2. Evans WE, Relling PV. Pharmacogenomics: translating functional genomics
into rational therapeutics. Science 1999;286:487-91.
3. Wilkinson GR. Farmacocintica: la dinmica de la absorcin, distribucin y
eliminacin de drogas. En: Hardman JG, Limbird LE, Gilman AG, eds.
Goodman & Gilman, Las bases farmacolgicas de la teraputica. 10 ed.
Mxico DF: McGraw-Hill; 2001. p.7-33.
4. Yates CR, Kriynetski EY, Loennechen T. Molecular diagnosis of thiopurine Smetiltransferases deficiency: genetic basis for azathioprine and mercaptopurine
intolerance. Ann Intern Med 1997;126:608-14.
5. Evans WE, Horner M, Chu YQ. Altered mercaptopurine metabolism, toxicity
and dosage requirements in a thiopurine methyltransferase-deficient child with
acute lymphocytic leukaemia. J Pediatr 1991;119:985-9.
6. Relling MV, Hancock Ml, Rivera GK. Mercaptopurine therapy intolerance and
heterozygosity at the thiopurine S-metyltransferase gene locus. J Natl Cancer
Inst 1999;23:1983-5.
7. Almuete VI. Drug therapy and pharmacogenomics. APhA 2000-American
Pharmaceutical
Association
Annual
Meeting.
Disponible
en:
http:www.medscape.com/medscape/CNO/2000/APHA/APHA-03.html.
8. Ingelman-Sundberg, Magnus, et al. "Influence of cytochrome P450
polymorphisms on drug therapies: pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and
clinical aspects." Pharmacology & therapeutics 116.3 (2007): 496-526.
9. Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espn, J., Corchero, J.L., Vazquez, A. y
Villaverde, A. (2009). Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.
Microbial Cell Factories 8,17

10. Fu, L.L., Xu, Z.R., Li, W.F., Shuai, J.B., Lu, P. y Hu, C.X. (2007). Protein
secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of
heterologous protein secretion. Biotechnology Advances 25, 1-12.
11. Fuchs, C., Kostera, D., Wiebuscha, S., Mahrb, K.,Eisbrennerb, G. y Markla, H.
(2002). Scaleup of dialysis fermentation for high cell density cultivation of
Escherichia coli. Journal of Biotechnology 93, 243 251.
12. Graumann, K. y Premstaller, A. (2006). Manufacturing of recombinant
therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal 1,164-186.
13. Heebll-Nielsen, A., Choe, W.S., Middelberg, A.P. y Thomas, O.R. (2003).
E_cient inclusion body processing using chemical extraction and high gradient
magnetic fishing. Biotechnology Progress 19, 887-898.
14. Hu, S.Y., Wu, J.L. y Huang, J.H. (2004). Production of tilapia insulin-like growth
factor-2 in high cell density cultures of recombinant Escherichia coli. Journal of
Biotechnology 107, 161-171.