Anda di halaman 1dari 9

PENGENDAPAN PROTEIN PLASMA

Dasar teori
Penelitian farmakokinetik melibatkan penentuan kadar obat dalam sampel biologis. Metode
analisis yang digunakan untuk penentuan kuantitatif kadar obat dalam suatu sampel biologis merupakan
hal yang sangat penting dalam evaluasi dan interpretasi data farmakokinetika.
Berbagai sampel biologis dapat diambil untuk penentuan kadar dalam tubuh untuk penelitian
farmakokinetik, sebagai contoh darah, urine, feses, saliva, jaringan tubuh, cairan blister, cairan spinal
dan cairan sinovial.
Penentuan kadar suatu obat dalam sampel biologis merupakan hal yang kompleks disebabkan
sampel biologis pada umumnya merupakan suatu matriks yang kompleks. Jika suatu obat atau
metabolitnya dalam sampel biologis dapat dianalisa langsung tanpa perlu dilakukan perlakuan awal
terhadap sampel yang diperoleh maupun pemisahan obat atau metabolit yang ditentukan maka hal ini
merupakan suatu hal yang menguntungkan. Akan tetapi perlakuan awal sampel maupun isolasi obat
atau metabolit yang akan ditentukan dari matriks biologis yang diperoleh harus dilakukan.
Hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan perlakuan awal sampel maupun metode untuk
memisahkan atau mengisolasi obat dan/atau metabolitnya adalah tahapan dari prosedur yang dipilih
harus seminimal mungkin untuk menghindari kehilangan obat dari obat atau metabolit yang akan
ditentukan. Semakin panjang tahapan prosedur untuk perlakuan awal maupun untuk memisahkan atau
mengisolasi obat atau metabolitnya makin besar kemungkinan hilangnya obat atau metabolit yang akan
ditentukan sepanjang prosedur yang dilakukan.
Darah merupakan sampel biologis yang paling umum digunakan dan mengandung berbagai
komponen seluler seperti sel darah merah, sel darah putih, platelet,dan berbagai protein seperti
albumin dan globulin. Pada umumnya bukan darah utuh (whole blood) tetapi plasma ataupun serum
yang digunakan untuk penentuan kadar obat. Serum diperoleh dengan membiarkan darah untuk
menggumpal dan supernatant yang dikumpulkan setelah sentrifugasi adalah serum. Sedangkan plasma
diperoleh dengan penambahan antikoagulan pada darah yang diambil dan supernatant yang diperoleh
setelah sentrifugasi merupakan plasma. Jadi, plasma dan serum dibedakan dari protein yang
dikandungnya.

Adapun kandungan protein dalam sampel biologis yang akan dianalisa menyebabkan
dibutuhkannya suatu tahap perlakuan awal dan/atau penyiapan sampel sebelum penentuan kadar obat
dapat dilakukan. Hal ini untuk mengisolasi atau memisahkan obat yang akan diteliti dari matriks sampel
yang diperoleh. Protein, lemak, garam dan senyawa endogen dalam sampel akan mengganggu
penentuan kadar obat yang bersangkutan dan selain itu dalam hal analisa menggunakan metode seperti
HPLC adanya zat-zat tersebut dapat merusak kolom HPLC sehingga usia kolom menjadi lebih singkat.
Berbagai prosedur untuk mendenaturasi protein dapat digunakan sebagai perlakuan awal sampel
biologis yang diperoleh dari suatu oenelitian farmakokinetik, meliputi penggunaan senyawa yang
disebut sebagai zat pengendap protein (protein precipitating agent) seperti asam tungstat, amonium
sulfat, asam trikoroasetat (tricloro acetic acid, TCA) asam perklorat, methanol dan asetonitril.
Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya
perubahan pH, temperature, dan penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum
digunakan adalah dengan penambahan precipitating agent. Protein dapat diendapkan karena memiliki
berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1
molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein memiliki muatan yang
berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana
protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana
jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini
akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga
potein dapat mengendap.
Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino
dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar
sehingga potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifa lain yang berhubungan dengan
presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen.
Penggunaan pelarut organik seperti methanol dan asetonitril sebagai zat pengendap protein
sangat umum digunakan terutama yang melibatkan metode analisis HPLC. Pengendapan ini berkaitan
dengan pI protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin meningkat
dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan
organik seperti metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurunkan Kd
(Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan
memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan menggantikan

beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan
protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan
menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. Penggunaan methanol dan asetonitril
mempunyai suatu keuntungan karena kompabilitasnya dengan berbagai eluen yang digunakan dalam
metode HPLC.
Metode isolasi atau pemisahan obat yang banyak digunakan dalam penelitian farmakokinetik
adalah ekstraksi padat-cair (solid-phase extraction) dan ekstraksi cair-cair. Ekstraksi padat-cair
menggunakan cartridge khusus untuk memisahkan obat dari sampel dengan volume relatif lebih kecil
(0.5-1mL) yang tersedia secara kom ersial dengan harga yang cukup mahal. Ekstraksi cair-cair
merupakan suatu metode yang paling banyak digunakan karena relatif cepat,simpel, dan murah
dibandingkan dengan ekstraksi padat-cair. Baik metode ekstraksi cair-cair maupun padat-cair pada
umumnya diikuti dengan proses pemekatan obat yang akan dianalisa. Pemilihan pelarut pengekstraksi
dalam ekstraksi cair-cair harus didasarkan pada sifat fitokimia obat maupun metabolit yang akan
diisolasi. Berbagai faktor dapat menjadi pertimbangan dalam seleksi pelarut yang akan digunakan antara
lain:

Immisible (tidak bercampur) dengan air.


Mempunyai kemampuan melarutkan obat yang diinginkan dalam jumlah yang besar sehingga

memberikan nilai recovery yang besar.

Mempunyai titik didih yang relatif rendah sehingga waktu evaporasi pelarut dapat lebih singkat.

Sedapat mungkin volume yang digunakan untuk ekstraksi adalah minimal sehingga akan menekan

biaya yang dikeluarkan.

Jika memungkinkan gunakan pelarut dengan berat jenis yang lebih kecil dari berat jenis air

sehingga proses pemisahan pelarut organik akan lebih mudah karena pelarut organik akan berada pada
lapisan atas.
Dalam proses ekstraksi tentu saja diharapkan perolehan kembali (recovery) obat yang akan diteliti
dari matriks sampel yang diperoleh adalah sebesar mungkin, jika mungkin adalah 100%. Berbagai
pendekatan dapat digunakan untuk mendapatkan perolehan kembali yang sempurna, seperti
penggunaan volume pelarut pengekstraksi dalam jumlah yang besar ekstraksi berulang (repeat
extraction) atau ekstraksi bertahap (multistep extraction). Pada ekstraksi berulang sampel yang sama

diekstraksi beberapa kali menggunakan pelarut baru sampai seluruh obat terekstraksi. Sedangkan pada
ekstraksi bertahap dilakukan beberapa tahap ekstraksi menggunakan pelarut dengan pH yang berbeda.
Akan tetapi 100% perolehan kembali pada umumnya tidak dapat diperoleh sehingga perlu ditentukan
perolehan kembali yang optimal dengan mempertimbangkan jumlah obat telah cukup terekstraksi untuk
memenuhi sensitifitas analisa, jumlah pelarut yang digunakan berkaitan dengan biaya yang dikeluarkan
dan juga waktu untuk melakukan keseluruhan proses ekstraksi termasuk evaporasi pelarut organik yang
diperoleh. Perolehan kembali obat dari matriks biologis sampai serendah 50% masih dapat diterima
dengan catatan parameter lain seperti sensitifitas, presisi, akurasi dan selektifitas memenuhi standard
umum yang berlaku.
Alat dan bahan
Alat :
1.

Vortex

2.

Sentrifus

3.

Rotari evaporator vakum

4.

Tabung ependorf

5.

L Pipet

Bahan :
1.

Zat pengendap protein (TCA, Metanol, Asetonitril)

2.

Plasma

Prosedur Kerja
A. Presipitasi Protein I
a.

Pipet 500 L plasma blanko ke dalam tabung ependorf.

b.

Tambahkan zat pengendap protein yang tersedia dengan perbandingan yang sesuai

c.

Vortex selama 15 detik

d.

Sentrifus dengan kecepatan 10.000 g selama 2 menit

e.

Amati supernatant dan endapan yang diperoleh dan bandingkan hasil yang diperoleh

menggunakan berbagai zat pengendap protein yang digunakan.


f.

Pisahkan supernatant yang diperoleh.

B.

Ekstraksi cair-cair

a.
b.

Pipet 500 L olasma balanko ke dalam 3 tabung sentrifus


Tambahkan pelarut pengekstraksi : asetonitril sebanyak 1 ml ke dalam tabung 1 dan metanol

sebanyak 1 ml ke dalam tabung 2 kemudian vortex 15 detik.


c.

Sentrifus dengan kecepatan 3500 g selama 5 menit.

d.

Pisahkan supernatant yang diperoleh ke dalam tabung sentrifus yang baru.

e.

Tambahkan TCA kesetiap tabung sebanyak 1 mL.

f.

Sentrifus dengan kecepatan 3500 g selama 5 menit.

g.

Uapkan pelarut organik di bawah vakum.

Data Pengamatan
A. Presipitasi Protein
Semple
Absoban
Panjang
Gelombang
Metanol
2,5

B. Exraksi Cair-cair

229 nm
Asetonitril
2,32
214 nm
TCA
1,29
273 nm
Semple
Absoban
Panjang
Gelombang
Metanol
0.4
272 nm
dan TCA
Asetonitril
0.3
270 nm
dan T
Pembahasan
Pada percobaan kali ini, digunakan sampel plasma blanko dan zat pengendap protein atau pelarut
organik yaitu metanol, TCA (tri cloro asetat) dan asetonitril. Metode yang digunakan adalah ekstraksi

cair-cair. Langkah awal yang dilakukan dalam percobaan ini adalah presipitasi protein dengan
mencampurkan 100 L plasma blanko dengan ke tiga zat pengendap protein yang ada yaitu
metano,TCA, dan Asetonitril. Setelah dicampurkan ke dalam 3 tabung ependrof yang berbeda lalu
sediaan itu divortex selama 15 menit dan disentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 g
dengan tujuan ketika disentrifuga (dipusingkan) dengan kecepatan tinggi, maka komponen-komponen
penyusun darah itu akan terpisah ke dalam lapisan-lapisan. Komponen lebih berat (bagian padat seperti
sel-sel darah) didorong ke dasar tabung. Sementara yang lebih ringan seperti plasma terapung di lapisan
atas. Lalu pisahkan supernatan yang diperoleh dengan tabung yang baru lagi, selanjutnya dihitung nilai
absorban dari tiap tabung dengan spektrofotometer.

Selanjutnya langkah berikut dengan metode ekstraksi cair-cair,pipet 500 L plasma lalu masukkan ke
dalam tabung sentrifuge, tambahkan dengan zat pengekstraksi 1 mL Asetonitril ke dalam tabung 1 dan 1
mL metanol ke dalam tabung 2. Sediaan tersebut divortex selama 15 menit dan disentrifuge dengan
kecepatan 3500 g selama 5 menit, pisahkan supernatan ke dlam tabung baru lalu tambahkan TCA ke
setiap tabung sebanyak 1 mL, sentrifuge lagi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Selanjutnya
dipisahkan lagi supernatan yang diperoleh ke dalam tabung yang baru. Selanjutnya dihitung nilai
absorbannya dengan spektrofotometer.
Setelah dihitung nilai absorbansinya diperoleh data sebagai berikut ; plasma adalah dengan zat
pengendap protein tricloro asetat karena mempunyai niali absorbansi yang paling kecil yaitu 1,3
sedangkan untuk metanol nilai absorbansinya 2,5 dan asetonitril nilai absorbansinya 2,31. Untuk yang
ekstraksi cair-cair diperoleh nilai absorbansi metanol + TCA yaitu 0,4 sedangkan Asetonitril +TCA adalah
0,3.
Hal ini membuktikan bahwa, semakin tinggi nilai absorbansinya maka makin banyak kadar protein yang
ada di dalam sediaan tersebut. sedangkan pada praktikum kali ini diharapkan denaturasi pada protein
(yang menunjukkan nilai absorbansi yang paling rendah) dan dari data, bahwa TCA adalah pelarut
organik atau zat pengendap protein yang paling baik karena nilai absorbansinya paling kecil yaitu 1,3.
Karena TCA dapat menghentikan jalannya reaksi hidrolisis dengan cara mendenaturasi enzim karena
sifat TCA adalah asam. Reagen ini menghentikan reaksi enzimatis karena sifatnya yang asam sehingga
enzim menjadi inaktif dan kehilanagan fungsi katalitiknya. Sedangkan untuk ekstraksi cair-cair diperoleh
zat yang paling baik adalah asetonitril dengan TCA yaitu 0,3. Ini membuktikan pada praktikum ini bahwa
menggunakan 2 pelarut organic lebih efektif untuk mengendapkan protein

Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni
memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini
membuat protein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat
larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan
mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan
positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik
isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga potein dapat mengendap.
Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat
terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga
potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifat lain yang berhubungan dengan presipitasi
protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen. Karena
sesungguhnya TCA itu adalah agen presipitasi atau agen pengendapan yakni ion negatif dari TCA akan
bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi
asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang dihasilkan
tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk memisahkan protein dari
larutan. Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan
adanya penambahan basa (membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein).
Metanol dan Asetonitril juga merupakan pelarut organik yang dapat mengendapkan protein.
Pengendapan ini berkaitan dengan pH protein, dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan
akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin
menurun. Penambahan larutan organik seperti metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam
air akan menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekulmolekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga
akan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang
berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian
kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. Pada hasil percobaan
diperoleh bahwa keefektifan pelarut organik metanol lebih besar dibandingkan dengan asetonitril.
Ekstraksi cair-cair merupakan salah satu metode untuk melakukan pengendapan protein, Proses ini
digunakan secara teknis dalam skala besar misalnya untuk memperoleh vitamin, antibiotika, bahanbahan penyedap, produk-produk minyak bumi dan garam-garam, logam. Proses inipun digunakan untuk
membersihkan air limbah dan larutan ekstrak hasil ekstraksi padat cair.

Ekstraksi cair-cair terutama digunakan, bila pemisahan campuran dengan cara destilasi tidak mungkin
dilakukan (misalnya karena pembentukan aseotrop atau karena kepekaannya terhadap panas) atau
tidak ekonomis. Seperti ekstraksi padat-cair, ekstraksi cair-cair selalu terdiri atas sedikitnya dua tahap,
yaltu pencampuran secara intensif bahan pada saat pencampuran terjadi perpindahan massa, yaitu
ekstrak meninggalkan pelarut yang pertama (media pembawa) dan masuk ke dalam pelarut kedua
(media ekstraksi). Sebagai syarat ekstraksi ini, bahan ekstraksi dan pelarut tidak saling melarut (atau
hanya dalam daerah yang sempit). Agar terjadi perpindahan masa yang baik yang berarti performansi
ekstraksi yang besar haruslah diusahakan agar terjadi bidang kontak yang seluas mungkin di antara
kedua cairan tersebut. Untuk itu salah satu cairan distribusikan menjadi tetes-tetes kecil (misalnya
dengan bantuan perkakas pengaduk).
Kesimpulan
1.

Protein dapat mengganggu dalam penentuan kadar obat dalam proses analisa.

2.

Protein dapat merusak kolom HPLC.

3.

Semakin tinggi absorbansi maka semakin tinggi pula kadar protein di dalam larutan

4.

Zat pengendap protein paling baik adalah TCA (tricloro asetat) dengan nilai absorbansi sebesar 1,3.

5.

Campuran zat protein yang paling baik adalah asetonitril dengan TCA dengan nilai absorbansi 0,3.

6.

Campuran zat pengendap lebih efektif dalam mendenaturasi protein daripada menggunakan zat

pengendap secara tunggal.

Daftar Pustaka
Anna Poedjiadi, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Penerbit UI-Press: Jakarta.
Lehninger.A.L, 1995. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga, Jakarta
Winarno, F. G., 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Penerbit Gramedia: Jakarta