Anda di halaman 1dari 21

LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS INSTRUMEN

KELOMPOK 1D
Anggota :
Rahmi Sertiana N. A. 1111102000085

Ana Yuliana

1111102000109

Subhan Asfari

1111102000086

Hestiawati

1111102000110

Ambar Khaerinnisa

1111102000090

Niekha Zoelienna I.

1111102000111

Ichsana Eskha Widya 1111102000092

Raaflyan Wahyu P.

1111102000112

Nindya Nurfitriani A. 1111102000095

Khairunnisa

1111102000113

Sri Puji Astuti

1111102000097

Andis Saputra

1111102000119

M.A.W. Khairurrijal

1111102000102

Khairul Bahtiar A.

1111102000117

Beryl Zahyin Adyani 1111102000106

Program Studi Farmasi


Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta

Landasan Teori
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Kromatografi cair kinerja tinggi(KCKT) atau biasa disebut dengan HPLC(High Performance
Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini,
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer, dan industri-industri makanan.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa-senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian(impuritis); analisis senyawa-senyawa
yang tidak menguap(non-volatil); penentuan molekul-molekul netral,ionik, maupun zwitter ion;
isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama;
pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan
dalam skala proses industri.

Cara Kerja KCKT

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solut-solut ini di atur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.
Prinsip kerja instumentasi HPLC
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran
komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiap komponen dalam sampel
berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah
pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan
(pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8.
Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya :
air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok, yaitu: wadah fase
gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasaukan sampel, kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan suatu computer atau integrator atau
perekam.

Gambar KCKT secara umum

1. Wadah fase gerak


Wadah fase gerak harus bersih dan lembam(inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1-2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
degassing(penghilangan gas) yang ada fase gerak. Sebab adanya gas akan berkumpul dengan
komponen lain terutama di pompa dan detector sehingga akan mengacaukan analisis.
2. Fase gerak
Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Berfungsi untuk
membawa komponen-komponen campuran menuju ke detektor, selain itu juga dapat
berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu
faktor penetu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai
fasa gerak sebagai berikut:
a) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis
b)
Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat mengganggu
interpretasi kromatogram
c) Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom
d) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
e) Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor
Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikelpartikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi
campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase
normal, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon

dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding fase terbalik.
3. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan
dengan kecepatan 20mL/menit.
Tujuan pengggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah menjamin proses
penghantaraan fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
pengguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu :
a) Pompa Reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara
gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Gerakan piston memberikan aliran
eluen yang konstan, memiliki volume internal kecil (35-400 mL) menghasilkan tekanan tinggi
(sampai 10.000 psi). Piston berupa batang gelas dan berkontak lengsung dengan pelarut.
b) Pompa Displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran yang cenderung tidak
tergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Memiliki keterbatasan kapasitas
pelarut ( 250 mL) dan tidak mudah untuk pergantian pelarut.
c)

Pompa Pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini murah,
tetapi memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) kecepatan alir
bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.

4. Penyuntikan sampel pada KCKT/ injektor


Sampel-sampel cair dan larutan disuntukkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir
di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan
karat dan katup Teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel(sampel loop) internal atau
eksternal.

Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya
dikeluarkan ke pembuangan. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir
melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk
sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntikan ini mudah digunakan untuk otomatisasi
dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT.
5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Parameter
Kolom konvensional
Kolom mikrobor
Tabung kolom
Stenless steel
Stanless steel
Panjang 3, 10, 15, 20, dan 25 cm
Panjang 25 dan 50 cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 mm
Diameter dalam 1 tau 2 mm
Fase diam
Porous, silika ukuran kecil, silika Porous, silika ukuran kecil, silika
yang dimodifikasi secara kimiawi, yang dimodifikasi secara kimiawi,
atau polimer-polimer stiren/divinil atau polimer-polimer stiren/divinil
benzen.
benzen.
Rata-rata diameter partikel 3,5 Rata-rata diameter partikel 3,5
atau 10 m dengan kisaran sempit
atau 10 m dengan kisaran ukuran
partikel yang sempit
Tekanan operasional 500-3000 psi
1000-5000 psi
(35-215 bar)
(70-350 bar)
Fase gerak
Hidrokarbon+pelarut-pelarut
Hidrokarbon+pelarut-pelarut
terklorinasi atau alcohol untuk fase terklorinasi atau alcohol untuk fase
normal. Untuk fase terbalik normal. Untuk fase terbalik
digunakan
metanol
atau digunakan
metanol
atau
asetonitril+air atau buffer.
asetonitril+air atau buffer.
Kecepatan alir : 1-3 mL/menit
Kecepatan alir : 10-100 L/menit.
Modifikasi instrumen
Sistem penghantaran pelarut yang
mempu memberikan control aliran
di bawah 10 L/menit. Katup
injeksi sampel bervolume kecil; sel
detector bervolume kecil.
Kinerja
Efisiensi
meningkat
dengan Sangat efisien dan sensitif, akan
berkurangnya ukuran partikel fase tetapi lambat. Konsumsi fase gerak
diam, akan tetapi umur kolom hanya dari kolom konvensional.
dengan ukuran partikel 3 m lebih
pendek.
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang
tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol(Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini berekasi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugusgugus fungsional yang lainnya.

Oktadesil silika(ODS atau C18 ) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau
rantai alkil yang lebih pendek lebih sesuai untuk solute yang polar.
7. Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokan menjadi 2 golongan yaitu: detector universal(yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya
akan mendeteksi analit secara spesifik dan slektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi,
dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat
kecil
Stabil pada pengoprasiannya
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mempu meminimalkan pelebaran pita. Untuk
kolom konvensional, selnya bervolume 8 l atau lebih kecil, sementara kolom mikrobor
selnya bervolume 1 l atau lebih kecil lagi.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas(kisaran dinamis linier)
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
8. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan puncak
(kromatogram). Kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak
menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan
waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis
kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode
standar kalibrasi.

JENIS-JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar
dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding
dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan
menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi
ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya
solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. (Kealey and
Haines, 2002)

2. Kromatografi fase terikat


Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase
terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon nonpolar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer
digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan
bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena
kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya
spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah
dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami
ionisasi akan terelusi lebih cepat. (Kealey and Haines, 2002)
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu
fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut
organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar
garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing
dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. (Meyer, 2004)
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. (Meyer, 2004)
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus
(lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang
jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium,
dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar
tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam
pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti
tipe kromatografi yang lain. (Meyer, 2004)
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.
Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisikondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana
dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
kompleks. (Meyer, 2004)

PARACETAMOL (ACETAMINOPHEN)

Paracetamol mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0% C8H9NO2,
dihitung terhadap zat anhidrat
BM
: 151,16
Pemeriaan
: Serbuk hablur, putih, tak berbau, rasa sedikit pahit
Kelarutan
: Larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1N, mudah larut dalam etanol
Titik lebur
: 168-172oC
Penyimpanan : disimpan di dalam wadah tertutup rapat dan tidak tembus cahaya
(anonym, 1995)
Acetaminophen atau Parasetamol adalah obat analgetik dan antipiretik yang digunakan untuk
melegakan sakit kepala, sengal-sengal atau sakit ringan dan demam. Parasetamol digunakan dalam
sebagian resep obat analgetik selesma dan flu. Berbeda dengan obat analgetik yang lain seperti
aspirin dan ibuprofen, parastamol tidak memiliki sifat antiradang.
Parasetamol merupakan derivate dari asetanilida yang efek enalgetiknnya dapat diperkuat
dengan koffein dengan kira-kira 50% dan codein. Overdose dapat menimbulkan antara lain mual,
muntah dan anoreksia. Penanggulangannya dengan cuci lambung, juga perlu diberikan zat-zat
penawar (asam amino N-asetilsistein atau metionin) sedini mungkin, sebaiknya 8-10 jam setelah
intoksikasi. Penggunaan parasetamol dalam dosis besar dan dalam jangka waktu yang lama dapat
menyebabkan kerusakan pada hati, untuk itu parasetamol dikontraindikasikan untuk pasien dengan
gangguan fungsi hati berat. Wanita hamil dapat menggunakan parasetamol dengan aman, juga
selama laktasi walaupun mencapai susu ibu. Interaksi dengan dosis tinggi memperkuat efek
antikoagulansia dan pada dosis biasa tidak interaktif ( Tjay, 2000). Parasetamol adalah senyawa yang
memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap
sinar UV. (Sani Ali, 2012)

Metode Kerja
A. Judul Praktikum
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) / kromatografi cair kinerja tinggi
B. Tempat dan tanggal praktikum
Laboratorium PNA, 1 dan 8 Oktober 2013
C. Alat dan Bahan
- Beker glass
- HPLC
- Labu erlenmeyer
- Aquadest
- Labu ukur
- Paracetamol
- Mikropipet
- Coffein
- Membran filter
- KPOH4
- Syringe
- Dapar fosfat
- Pipet tetes
- Etanol
- Gelas vial
D. Prosedur Kerja
1. Pembuatan larutan standar campuran kafein dan parasetamol
- Buat pengenceran dari larutan induk masing-masing larutan parasetamol dan kafein.
- Labu ukur 10 ml disiapkan sebanyak dua buah. Lakukan pengenceran untuk
mendapatkan 6 ppm kafein dan 10 ppm parasetamol.
- Lalu kedua larutan dicampur hingga homogen.
- Larutan campuran dianalisis menggunakan HPLC, dengan optimasi yang sesuai.
- Diamati waktu retensi standar dan luas area dibawah kurva kromatogram.
2. Analisis kualitatif larutan kafein dan parasetamol
- Ditimbang masing-masing 5,0 mg kafein dan parasetamol
- Dimasukkan ke dalam labu terukur 50 mL
- Ditambahkan aquadest hingga batas tanda, sehingga didapat larutan kafein dan
larutan parasetamol dengan konsentrasi 100 g/mL (larutan induk)
- Encerkan masing-masing larutan induk, hingga diperoleh larutan dengan konsentrasi
10 g/mL.
- Lalu masing-masing larutan dianalisis menggunakan HPLC, dengan optimasi yang
sesuai.
- Diamati waktu retensi standar dan luas area dibawah kurva kromatogram.
3. Pembuatan larutan standar Kafein dan Parasetamol untuk kurva kalibrasi
- Buat 5 seri standar yang terdiri dari campuran parasetamol dan kafein dengan
konsentrasi tertentu.
Larutan standar
Parasetamol
Kafein
1
10
6
2
12
8
3
14
10
4
16
12
5
18
14
4. Penetapan kadar sampel dalam sediaan yang beredar
- Ditimbang satu tablet sediaan yang mengandung paracetamol dan kafein. Lalu
digerus.

Serbuk dilarutkan menggunakan pelarut yang sesuai (air), cukupkan hingga 100mL.
Dibuat larutan dengan konsentrasi 14 ppm untuk mengukur kadar PCT
Dibuat larutan dengan konsentrasi 10 ppm untuk mengukur kadar kafein
Lalu masing-masing larutan dianalisis menggunakan HPLC, dengan optimasi yang
sesuai.
Hasil kromatorgram berupa waktu retensi dan luas area dibawah kurva diamati.

Hasil dan Pembahasan


KUALITATIF
Hasil
Standar Eksternal
No
1
2

Nama Peak
Standar Parasetamol (10 ppm)
Standar Kofein (10 ppm)

Waktu Retensi
(menit)

Tinggi
(mAU)

Area
(mAU x menit)

1,63
4,34

27,942
46,713

2,463
9,372

Sampel Campuran
No

Nama Peak

Waktu Retensi
(menit)

Tinggi
(mAU)

Area
(mAU x menit)

1
2

Senyawa 1
Senyawa 2

1,72
3.73

37,602
47,751

3,232
15,231

Perhitungan Kadar
Karena waktu retensi senyawa 1 hampir sama dengan parasetamol, maka senyawa 1
dianggap parasetamol.

Serta karena waktu retensi senyawa 2 hampir sama dengan kofein, maka senyawa 2
dianggap dianggap.

Pembahasan
Pada praktikum ini digunakan HPLC/KCKT untuk analisis paracetamol, coffein, serta sampel
campuran dari paracetamol dan coffein secara kualitatif. Fase gerak yang digunakan adalah
campuran KH2PO4, metanol, dan asetonitril dengan perbandingan 90 ml: 6 ml : 4 ml. Sedangkan Okta
Desil Silan (C18) digunakan sebagai fase diam. Penggunaan campuran eluen atau fase gerak yang

sedemikian rupa merupakan hasil dari pengalaman pemisahan campuran parasetamol dengan
kofein. Dapar fosfat (KH2PO4) pH 4,5 digunakan karena kedua senyawa tersebut stabil dalam kondisi
yang sedikit asam. Campuran metanol dengan asetontril akan mengkondisikan sistem eluen bersifat
semi polar, hal tersebut terkait sifat kepolaran senyawa yang dianalisis. Parasetamol dan kofein
bersifat semi polar karena mengandung gugus yang memiliki elektron bebas (sehingga bersifat
polar), sekaligus memiliki struktur siklik yang bersifat nonpolar. Fase diam yang berupa okta desil
silan (C18) bersifat nonpolar. Kombinasi dari sistem eluent dan adsorban (fase diam) akan
menimbulkan proses tarik menarik solute pada sampel diantara keduanya sehubungan dengan
kemiripan dari sifat kepolaran solute dengan eluent dan adsorben. Hasilnya berupa waktu retensi
yang bersifat khas dari senyawa tertentu dalam solute terhadap sistem KCKT yang digunakan.

Parasetam

Kofein

Gugus yang menentukan sifat polar, Gugus yang menentukan sifat


nonpolar
Detektor yang digunakan berupa detektor UV-Vis dengan pertimbangan bahwa senyawa
yang dianalisis memiliki gugus kromofor. Panjang gelombang yang digunakan adalah 215 nm, suhu
27.30C-27.50C, dan volume alir 0,7 ml/menit. Pengkondisian sistem kromatografi ini diadaptasi dari
hasil pengalaman optimasi untuk memisahkan sampel campuran parasetamol-kofein serta
disesuaikan dengan campuran eluen dan adsorban yang digunakan. Sehubungan dengan telah
diketahuinya komponen dalam sampel, maka elusi digunakan dengan sistem isokratik, dimana
gradien persentasi komponen eluen selalu sama.
Sebelum dilakukan pengujan terhadap sampel campuran, dibuat larutan standar dari
komponen sampel tersebut. Metode analisis ini menggunakan standar eksternal karena kadar
komponen sampel cukup besar dan dalam rentang deteksi teliti instrument analisis yang digunakan.
Dibuat larutan standar parasetamol dan kofein dengan kadar masing-masing 10 ppm. Medium
pelarut yang digunakan untuk pembuatan standar adalah aquades terkait ketidaktersediaan
aquades. Untuk meminimalisasi keikutsertaan pengotor saat analisis, standar disaring terlebih
dahulu dengan penyaring mikro. Selanjutnya standar dianalisis menggunakan KCKT dengan sistem
instrument yang telah dipersiapkan sebelumnya, untuk menentukan waktu retensi masing-masing
senyawa. Diketahui bahwa waktu retensi parasetamol pada sistem KCKT ini adalah 1,63 menit
dengan luas area di bawah kurva 2,463 mAU*menit sedangkan kofein 4,34 menit dengan luas area di
bawah kurva 9,372 mAU*menit. Waktu retensi akan menjadi acuan untuk menentukan identitas
peak yang dihasilkan pada kromatogram hasil analisis sampel campuran. Dari hasil analisis larutan

standar, dihasilkan bentuk kromatogram berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing. Hal ini
disebabkan oleh terlalu banyak pengotor yang ikutserta dalam proses analisis dengan KCKT.
Selanjutnya dilakuan analisis sampel campuran parasetamol. Waktu retensi yang dihasilkan
pada peak 1 adalah 1.72 menit dengan luas area di bawah kurva 3.232 (mAU*min) dan peak 2
adalah 3.73 (menit) dengan luas area dibawah kurva 15.231 (mAU*min). Bentuk kromatogram yang
dihasilkan adalah bentuk berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing. Kemudian dibandingkan waktu
retensi standar dengan waktu retensi sampel. Dilihat dari kedekatan nilai (waktu retensi), diputuskan
bahwa peak 1 merupakan parasetamol dan peak 2 merupakan kofein. Dilihat dari perbandingan
waktu retensi standard dan sampel, terjadi perubahan yang cukup signifikan. Perubahan ini mungkin
terjadi karena terjadi reaksi antara komponen sampel dengan campuran eluen yang didukung
dengan kondisi sistem saat analisis. Reaksi tersebut mungkin menghasilkan produk yang secara
struktur kimia berbeda dengan senyawa sampel yang selanjutnya berimplikasi pada perubahan
waktu retensi. Selain itu ketidakstabilan temperature kolom meningkatkan viskositas eluent serta
kelarutan senyawa dalam sampel. Perubahan viskositas eluent serta kelarutan senyawa sampel
mendukung perubahan waktu retensi pada setiap kali analisis.
Selain melakukan uji kualitatif terhadap sampel, dilakukan pula uji kuantitatif terhadap kadar
komponen dalam sampel campuran. Penghitungan kadar dapat dilakukan dengan membandingkan
luas area dibawah kurva pada komponen sampel terhadap luas area kurva pada standar, dikali
dengan konsentrasi standar. Dengan cara tersebut, diperoleh kadar parasetamol pada sampel
campuran sebesar 13,122 ppm dan kofein sebesar 16,252. Untuk memastikan tingkat kepercayaan
analisis, perlu dilakukan uji validasi terhadap data hasil analisis.

KUANTITATIF
A. Pembuatan seri standar
Larutan induk 1000 ppm
1. Konsentrasi 4 ppm
M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 4 ppm X 5 mL
V1 = 0,2 mL = 200 L
2. Konsentrasi 6 ppm
M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 6 ppm X 5 mL
V1 = 0,3 mL = 300 L
3. Konsentrasi 8 ppm
M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 8 ppm X 5 mL
V1 = 0,4 mL = 400 L
4. Konsentrasi 10 ppm
M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 10 ppm X 5 mL
V1 = 0,5 mL = 500 L
5. Konsentrasi 12 ppm

M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 12 ppm X 5 mL
V1 = 0,6 mL = 600 L
Hasil Kromatogram
1. Optimasi
Volume injection : 10
Run time
: 7 menit
Panjang gelombang : 215 nm
Dtektor
: Uv-Vis
Jenis kolom
: Silika C18
Jenis pelarut
: - Kalium dihidrogen fosfat 90%
- Methanol 4%
- Asetonitril 6%
2. Uji Kualitatif (Data terlampir)
a. Parasetamol
Ret. Time Height
Area
(min)
(MAU) MAU*min
1.63
27.942
2.463

Rel.Area%

Type

66.69

BMB

b. Kafein
Ret. Time
(min)
4.34

Height
(MAU)
46.731

Area
MAU*min
9.372

Rel.Area%

Type

74.91

BM

c. Campuran
Ret. Time
(min)
1.72
3.73

Height
(MAU)
37.602
47.751

Area
MAU*min
3.232
15.231

Rel.Area%

Type

15.89
74.89

M
MB

3. Uji Kuantitatif kadar Sampel yang beredar (Data Terlampir)


a. Persamaan linier Parasetamol dan Kafein
Konsentrasi
Luas Area
Plates
(ppm)
(mAU*min)
Standar
PCT Kafein
PCT
Kafein PCT Kafein
1
10
6
10.487 3.592 2568 3681
2
12
8
14.231 8.531 1986 2405
3
14
10
21.170 6.520 2429 4386
4
16
12
23.613 12.344 2696 4450
5
18
14
29.763 13.309 2347 4153

Asym
PCT
2,97
3,10
3,30
3,44
3,33

Kafein
2,41
3,31
1,44
3,33
2,50

Resolusi
PCT
9,12
9.58
10,50
9,74
9,84

Cafeiin
-

Kurva Kalibrasi Parasetamol


35.000

Luas Area (mAU*min)

30.000
25.000

y = 2.3967x - 13.701
R = 0.9844

20.000
15.000
10.000
5.000
0.000
0

10

12

14

16

18

20

Konsentrasi (g/mL)

Kurva Kalibrasi Kafein


16.000
y = 1.1624x - 2.7643
R = 0.828

Luas Area (mAU*min)

14.000
12.000
10.000
8.000
6.000
4.000
2.000
0.000
0

10

12

14

Konsentrasi (g/mL)

b. Penetapan kadar parasetamol (10 ppm) dalam Panadol


Diketahui :
kadar pada etiket 500 mg
Luas area mAU*min = y = 90,208
Persamaan regresi untuk parasetamol y = 2,3967x 13,701
90.208 = 2,3967x 13,701

Konsentrasi sebelum pengenceran

= 43,355 ppm X faktor pengenceran


= 43,355 ppm x

16

= 21677,5 ppm

c. Penetapan kadar kafein (10 ppm) dalam Panadol


Diketahui :
kadar pada etiket 65 mg
Luas area mAU*min = y = 10,055
Persamaan regresi untuk kafein y = 1,1624 x 2,7643
10,055 = 1,1624 x 2,7643

Konsentrasi sebelum pengenceran

= 11.0283 ppm X faktor pengenceran


= 11.0283 ppm x
= 716,8395 ppm

d. Penetapan kadar parasetamol (14 ppm) dalam Bodrex


Diketahui :
kadar pada etiket 600 mg
Luas area mAU*min = y = 25,14
Persamaan regresi untuk parasetamol y = 2,3967x 13,701
25,142 = 2396,7x - 13701

Konsentrasi sebelum pengenceran

= 16,2069 ppm X faktor pengenceran


= 16,2069 ppm x
= 6945,814 ppm

e. Penetapan kadar kafein (10 ppm) dalam Bodrex


Diketahui :
kadar pada etiket 50 mg
Luas area mAU*min = y = 7,635
Persamaan regresi untuk kafein y = 1,1624 x 2,7643
7,635 = 1,1624 x 2,7643

Konsentrasi sebelum pengenceran

= 8,9464 ppm X faktor pengenceran


= 8,9464 ppm x
= 447.32 ppm

Pembahasan

Pada praktikum kali ini, dilakukan analisis kuantitatif kadar paracetamol dan coffein
pada sampel obat yang beredar yaitu Panadol dan Bodrex dengan instrument analisis
HPLC. Sebelum masuk tahap pengujian terhadap kadar paracetamol dan coffein, dilakukan
optimasi instrument analisis yang digunakan. HPLC/KCKT dioptimasi melalui studi
literature analisis sampel campuran paracetamol dan coffein. Berdasarkan hasil studi,
ditentukan bahwa fase gerak yang digunakan adalah campuran KH2PO4, metanol, dan
asetonitril dengan perbandingan 90 ml: 6 ml : 4 ml. Sedangkan Okta Desil Silan (C18)
digunakan sebagai fase diam. Detektor yang digunakan berupa detektor UV-Vis dengan
pertimbangan bahwa senyawa yang dianalisis memiliki gugus kromofor. Panjang gelombang
yang digunakan adalah 215 nm, suhu 27.30C-27.50C, dan volume alir 0,7 ml/menit.
Penggunaan campuran eluen atau fase gerak yang sedemikian rupa merupakan hasil
dari hasil uji peneliti lain terhadap campuran parasetamol dengan kofein. Dapar fosfat
(KH2PO4) pH 4,5 digunakan karena kedua senyawa tersebut stabil dalam kondisi yang sedikit
asam. Campuran metanol dengan asetontril akan mengkondisikan sistem eluen bersifat semi
polar, hal tersebut terkait sifat kepolaran senyawa yang dianalisis. Parasetamol dan kofein
bersifat semi polar karena mengandung gugus yang memiliki elektron bebas (sehingga
bersifat polar), sekaligus memiliki struktur siklik yang bersifat nonpolar. Fase diam yang
berupa okta desil silan (C18) bersifat nonpolar. Kombinasi dari sistem eluent dan adsorban
(fase diam) akan menimbulkan proses tarik menarik solute pada sampel diantara keduanya
sehubungan dengan kemiripan dari sifat kepolaran solute dengan eluent dan adsorben.
Hasilnya berupa waktu retensi yang bersifat khas dari senyawa tertentu dalam solute terhadap
sistem KCKT yang digunakan.
Setelah instrument analisis dioptimasi, dilakukan praperlakuan terhadap sampel.
Kedua jenis sampel digerus dalam lumpang yang berbeda, selanjutnya di larutkan dalam fase
gerak sampai 100 mL. Selanjutnya disaring dengan penyaring mikro untuk meminimalisasi
terbawanya esksipien yang tidak larut. Diprediksi bahwa kadar dalam larutan uji masih
terlalu tinggi untuk dilakukan analisis kadarnya dengan HPLC/KCKT, dan sehingga
diperlukan pengenceran. Prediksi kadar dilakukan dengan melihat komposisi sediaan yang

tertera pada brosur. Rata-rata, kedua sediaan tersebut mengandung 500 mg parasetamol dan
50 mg kafein. Pengenceran dilakukan dengan menambah sejumlah larutan fase gerak pada
sejumlah sampel uji. Karena kafein memiliki kadar yang paling kecil, maka pengenceran
dilakukan dengan bertolak pada kadar kaffein pada sediaan.
Sebelum dilakukan pengujan terhadap sampel, dibuat larutan standar dari komponen
sampel tersebut. Metode analisis ini menggunakan kruva standar yang berisi campuran
parasetamol dan kaffein dalam rentang tertentu. Digunakan larutan standar yang berisi
campuran senyawa komponen sampel karena kemungkinan pergeseran waktu retensi dapat
terjadi jika komponen standar dibuat dalam masig-masing larutan. Medium pelarut yang
digunakan untuk pembuatan standar adalah fase greak yang digunakan. Untuk
meminimalisasi keikutsertaan pengotor saat analisis, standar disaring terlebih dahulu dengan
penyaring mikro. Selanjutnya standar dianalisis menggunakan KCKT dengan sistem
instrument yang telah dipersiapkan sebelumnya, untuk menentukan waktu retensi masingmasing senyawa. Waktu retensi akan menjadi acuan untuk menentukan identitas peak yang
dihasilkan pada kromatogram hasil analisis sampel campuran. Dari hasil analisis larutan
standar, dihasilkan bentuk kromatogram berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing. Hal ini
disebabkan oleh terlalu banyak pengotor yang ikutserta dalam proses analisis dengan KCKT.
Dengan memplot luas area dibawah kurva pada masing-masing larutan standar sebagai y, dan
konsentrasi yang dibuat sebagai x, didapatkan persamaan regresi linier untuk parasetamol y =
2.3967x - 13.701 dengan nilai R = 0.99217 dan koffein y = 1.1624x - 2.7643 dengan nilai R =

0.909945. Dapat dilihat dari nilai R bahwa kurva regresi linier untuk kaffein tidak terlalu
linier.
Kemudian dilakukan pengujian terhadap kedua larutan sampel pada HPLC/KCKT.
Dari hasil pengujian, didapatkan luas area permukaan masing-masing komponen larutan uji.
Dengan mensubstitusi luas area permukaan sebagai y pada masing-masing persamaan linier,
maka didapat konsentrasi komponen tertentu dalam larutan. Lalu masing-masing kadar yang
diperoleh dikalikan faktor pengenceran dan volume pengenceran awal untuk mengetahui
jumlah masing-masing komponen. Diketahui dari larutan uji Panadol terdapat paracetamol
2167.75 mg dan koffein 71,683 mg, dan pada bodrex mengandung parasetamol 694,58 mg
dan kaffein 44,732 mg. Setiap komponen hasil uji memiliki jumlah berbeda dengan yang
tertera pada etiket. Hal ini mungkin terjadi karena masih terdapat pengotor yang ikut terbaca
pada HPLC/KCKT.

Untuk menguji kevalidan hasil analisis, maka dilakukan perhitungan terhadap %


recovery. Dari hasil perhitungan, didapatkan % recovery PCT 2,219% dan kaffein 10,863%.
Karena % recovery lebih dari 2%, maka disimpulkan bahwa hasil percobaan tidak valid.

Kesimpulan dan Saran

Kesimpulan
Waktu retensi parasetamol pada sistem KCKT menurut percobaan kali ini adalah 1,63 menit
dengan luas area di bawah kurva 2,463 mAU*menit, sedangkan waktu retensi kofein adalah 4,34
menit dengan luas area di bawah kurva 9,372 mAU*menit. Sementara itu waktu retensi yang
dihasilkan pada sampel campuran adalah peak 1 adalah 1.72 menit dengan luas area di bawah kurva
3.232 (mAU*min) dan peak 2 adalah 3.73 (menit) dengan luas area dibawah kurva 15.231
(mAU*min), dengan bentuk kromatogram yang dihasilkan adalah bentuk berbahu (shoulder) dengan
sedikit tailing. Menurut kami peak 1 merupakan parasetamol dan peak 2 merupakan kofein.
Sedangkan untuk uji kuantitatifnya, kadar parasetamol pada sampel campuran didapat sebesar
13,122 ppm dan kofein sebesar 16,252 ppm. Pada percobaan kali ini masih terdapat perbedaan
waktu retensi standard yang diperoleh dengan waktu retensi sampel, hal ini kemungkinan terjadi
karena adanya reaksi antara komponen sampel dengan campuran eluen yang didukung dengan
kondisi sistem saat dilakukan analisis, selain itu ketidakstabilan temperature kolom juga dapat
mempengaruhi waktu retensi, dan begitupula halnya dengan terjadinya human error.

Saran
Lakukanlah pengoptimalan instrumen terlebih dahulu sebelum melakukan percobaan, dan
lakukanlah percobaan secara hati-hati dan teliti untuk menghindari terjadinya human error.

Daftar Pustaka
th

Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4 Ed., John Wiley & Sons, New York.

Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publishers Limited, New York.

Sani Ali, Audu. et all 2012. Analysis of Different Brands of Paracetamol 500mg Tablets Used
In Maiduguri,. Using Ultra Violet Spectrophotometric and High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) Methods. Nigeria ; IRJP

Tjay, T.H. 2000. Obat-obat Penting. Edisi kelima. Cetakan Pertama. Jakarta ; PT. Elex Media
Computindo

Anonim, 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta ; Departemen Kesehatan Republik
Indonesia

Anda mungkin juga menyukai