I.

II.

TUJUAN PERCOBAAN
1. Mahasiswa memahami prinsip pemisahan dengan metode elektroforesis.
2. Mahasiswa dapat melaksanakan pemisahan dengan metode elektroforesis.
DASAR TEORI
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu
campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan
listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio
muatan dan massa. Sebagai contoh, jika dua molekul mempunyai masa dan
bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih
cepat ke elektrode. Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid
merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian
fragmen DNA. Selain itu elektroforesis gel poliakrilamid dapat juga digunakan
untuk pemisahan, identifikasi dan pemurnian protein. Teknik ini merupakan
teknik sederhana, cepat dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari
matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti
sentrifugasi gradien(Sudjadi,2008).
Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis fragmen
fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul
DNA yang telah dipotong-potong dapat dintetukan ukurannya dengan cara
membuat gel agarosa, yaitu suatu bahan semi padat berupa polisakarida yang
diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam
suatu buffer. Agar dapat larut dengan baik, pelarutan dibantu dengan
pemanasan, misalnya menggunakan oven gelombang mikro. Dalam keadaan
panas gel akan berupa cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng
(plate) yang biasanya terbuat dari Perspex. Sebelum mendingin dan mamadat,
pada ujung gel tersebut dibuat lubang lubang dengan menggunakan lembaran
Perspex tipis yang yang dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancapkan
pada salah satu ujung gel yang masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel
memadat dan sisirnya diambil terbentuklah lubang lubang kecil.Ke dalam
lubang lubang kecil itulah sampel molekul DNA dimasukan. Gel agarosa
yang sudah terbentuk kemudian dimasukan ke dalam suatu tanki yang berisi
buffer yang sama dengan yang digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat

dibuat misalnya dengan tris-asetat-EDTA (TAE) atau tris-borat-RDTA (TBE)

(Yuwono,2008).
DNA dimasukan dalam lubang sampel, arus listrik dialirkan. Kutub
yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan
kutub lainnya positif. Oleh karena DNA bermuatan negatif maka molekul
molekul DNA akan bergerak kearah kutub positif. Setelah beberapa waktu gel
kemudian direndam dalam larutan yang mengandung etidium bromida.
Etidium bromida akan menginterklasi (menyisip ke dalam ) DNA.
Pengguanaan etidium bromida dimaksudkan untuk membantu visualisasi
karena etidium bromida akan memendarkan sinar ultraviolet. Juga gel disinari
dengan ultraviolet dari bawah, maka akan tampak citra berupa pitapita pada
gel. Pitapita tersebut adalah molekulmolekul DNA yang bergerak sepenjang
gel setelah dielektroforesis. Molekul RNA dapat dianalisis dengan prinsip
yang sama, yaitu menggunakan buffer yang berbeda yaitu mengandung
formaldehid (Yuwono,2008).
Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas bergantung pada tanda
dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat ion, pH, temperature, viskositas,
adsortivitas zat terlarut dan sifat fisika kimia medium migrasi. Ion yang
berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang
bergerak pada arah yang berlawanan. Lintasan yang ditempuh oleh suatu
partikel bermuatan sesuai dengan:
d

Ut e Ut V

qk
L

Dimana V : tegangan
L : Panjang saluran
K : Konduktivitas
e : arus listrik
Ut : mobilitas ion pada saat t
q : luas penampang
d : lintasan yang ditempuh
(Widjaja, 2012)

Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan

berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita
protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai
berat molekul yang sama dengan yang berada pada posisi yang sama. Hal ini
sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul
bermuatan dapat bergerak bebas dibawah pengaruh medan listrik, molekul
dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita
yang sama atau berdekatan (Sudarmadji, 1996).
III.

ALAT DAN BAHAN

III.1
Alat
- Elektroforesis set
- Pipet mikro 200 l dan 20 l
- Chamber
- Mikrowave
- Tips (kuning dan putih)
- Magnetic stirer
- Stirer bar
- UV transluminator
- Cetakan
- Comb
III.2
Bahan
- Agarose 1,2 %
- TAE (Trisacetic Edta)
- Marker DNA Leader 100 Bp
- Loading buffer
- Sampel DNA
- EtBr dan Aquadest
IV. PROSEDUR KERJA
4.1 Pembuatan agarosa
V.
Ditimbang agarosa sebanyak 1,2 gram dan ditambahkan 100 ml buffer
VI.
TAE 1 kali
VII.
VIII.
Agarosa dipanaskan pada suhu tinggi sampai larut dengan sempurna,
IX.
suhu diturunkan sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer sampai
X.

suhunya 500 C.
Agarosa dituangkanpada cetakan yang digunakan, yang sebelumnya

diletakkan comb untuk mencetak sumur ( well ). Tinggi agar 50 75.

% dari tinggi sumur.

Ditunggu beberapa menit sampai agar yang dituang mengeras.

Tuangkan TAE pada cetakan tempat agarosa.

XI.
Angkat sisir ( untuk membuat sumur sampel ) kearah vertical secara
4.2 Penempatan sampel perlahan lahan.
Sumur dicuci dengan larutan TAE menggunakan pipet 200 L.
Dipipet 6 L sampel DNA marker yang telah ditambah dengan
loading bufferdengan pipet mikro 20L.

Sampel DNA dimasukkan sebanyak 6 L pada sumur yang lainnya

Diatur penempatan sampel DNA dan DNA marker pada sumur (well) dan
pelan-pelan untuk mencegah robeknya agarosa.
4.3 Caradilakukan
kerja elektroforesis

Agarosa ditempatkan pada kotak elektroforesis yang berisi buffer TAE.

Hubungkan tangki elektroforesis dengan sumber arus. Kutub negative
berada dekat dengan sumur. Hidupkan sumber arus dengan voltase 110
volt dan dijaga agar tetap konstan. Elektroforesis selama 25 menit
tettetap

Mesin elektroforesis dimatikan dan agarosa diangkat.

Agarosa direndam dalam larutan ethidium Bromida selama 2 x 10 menit.

Angkat agarose dan dicuci dengan aquadest selama beberapa menit

(destining agar kelebihan EtBr tercuci)
Permukaan plat UV dicuci dengan air, kemudian agarosa ditempatkan
pada plat tersebut
Pita kemudian dilihat di UV (transliminator), dan dianalisi hasilnya.

V. HASIL
Berdasarkan hasil visualisasi gel agarosa pada UV transluminator
setelah dilakukan elektroforesis, terlihat band-band yang dihasilkan oleh DNA
marker dan sampel poduk PCR DNA bakteri asam laktat yang ditunjukan pada
gambar 5.1 berikut :
7

Gambar 5.1 Hasil Visualisasi Elektroforesis

Keterangan :
A

: Sumur (wells)

: Sampel 1

: Sampel 2

: Sampel 3

: Sampel 4

: Sampel 5

: Sampel 6

: Sampel 7

: DNA marker

Lingkaran merah menunjukkan band yang dihasilkan molekul DNA)

5

Band-band yang dihasilkan DNA marker tidak lengkap karena

konsentrasi gel agarosa yang digunakan adalah 1,2% sedangkan seharusnya
untuk mendapatkan visualisasi band-band DNA yang lengkap sesuai petunjuk
penggunaan seharusnya digunakan gel agarosa dengan konsentrasi 2%.
Berdasarkan hasil visualisasi dan pencocokan gambar visualisasi standar
DNA marker yang dilakukan di laboratorium, band DNA marker yang terlihat
jelas hanya sebanyak empat band yaitu sebagai berikut.
Tabel 5.1 Band DNA standar yang dihasilkan beserta ukuran molekulnya
Band
1
2
3
4

Ukuran molekul (base pairs)

500
600
700
800

Berdasarkan band-band DNA marker tersebut dapat diidentifikasi berat

molekul sampel DNA dengan membandingkan band yang dihasilkan sampel
dengan band DNA marker. Karena sampel DNA merupakan produk PCR,
maka band yang dihasilkan adalah satu sehingga yang dianggap sebagai
band DNA adalah band yang terlihat paling jelas yang ditunjukkan dengna
lingkaran merah pada gambar 5.1. Sedangkan band lain yang tampak tidak
jelas merupakan jejak DNA primase yang terdapat pada sampel. Sampel
yang menghasilkan band adalah sampel 3, 4, dan 6. Sedangkan sampel 1, 2,
5, dan 7 tidak menghasilkan band. Hasil pembandingan band yang
dihasilkan sampel dengan band DNA marker ditunjukkan pada tabel 5.2
berikut.
Tabel 5.2 Hasil pembandingan band sampel dengan band DNA marker
Band Sampel
1
2
3
4
5
6
7

Ukuran molekul (base pairs)

500
500
500
-

VI. PEMBAHASAN
Pada praktikum elektroforesis ini, metode elektroforesis yang digunakan
adalah elektroforesis gel. Elektroforesis gel adalah suatu teknik yang
menggunakan medan listrik untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran.
Karena mengandung gugus fosfat yang bermuatan negatif, di dalam medan listrik
DNA akan bergerak menuju elektroda positif. Molekul yang lebih pendek
bermigrasi lebih cepat melalui pori-pori gel daripada molekul yang lebih panjang,
sehingga

pemisahan

didasarkan

pada

panjang.Gel

yang

tersusun

dari

poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA yang perbedaan

panjangnya hanya satu nukleotida dan digunakan untuk menentukan urutan basa
DNA. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang memiliki
perbedaan ukuran lebih besar (Marks, 1996).
Elektroforesis gel dilakukan dengan memisahkan molekul DNA yang dibuat
dalam tujuh jenis sampel dari bakteri asam laktat yang telah di PCR yaitu sampel
1, 2, 3, 4, 5, 6, dan 7. Medium injeksi untuk pemisahan dengan elektroforesis
yang digunakan adalah gel agarose dengan konsentrasi 1,2%. Agarosa yang disari
dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar struktur D-galaktosa dan 3,6anhidro L-galaktosa (Watson, 2007). Agarosa dipilih karena dengan menggunakan
gel agarosa teknik yang digunakan cukup sederhana dan mudah penanganannya,
selain itu gel agarosa mempunyai kemampuan pemisahan dengan range yang
cukup luas yaitu mulai dari 50 basa sampai 50 kilo basa dengan berbagai
konsentrasi agarosa (Sudjadi, 2008). Gel agarosa biasanya dilakukan dalam
konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap (Watson,
2007). Adapun tahapan yang harus dikerjakan dalam praktikum elektroforesi gel
adalah penyiapan gel, penyiapan sampel, dan elektroforesis.
Tahap pertama yang dilakukan adalah penyiapan gel, gel yang digunakan
yaitu agarosa 1,2%. Pembuatan agarose tidak dilakukan karena telah tersedia.
Lapisan agar yang telah mengeras ditambahkan buffer TAE agar weel tidak robek
saat comb diangkat. Comb (sisir) yang berfungsi untuk membuat sumur (well)
diangkat

ke arah vertikal secara perlahan-lahan. Setelah mengeras, agarosa

membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa.

Jika medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan
negatif pada pH netral, akan bergerak ke katoda (+). Kecepatan migrasi ini
ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa,
dan besaran tegangan yang digunakan(Watson, 2007).Comb harus diberikan jarak
1 cm dari dasar cetakan agar sumur yang terbentuk baik. Caranya, kedua ujungnya
dipegang. Mediumnya diangkat dari cetakan dengan cara memegang kedua
sisinya, sambil bagian bawahnya dibersihkan dengan menggesekkan pada pinggir
tray agar sisa-sisa agar (pengotor) tidak terangkat yang akan dapat

merusak

medium utuhnya. Medium yang telah diangkat dipindahkan ke dalam chamber

elektroforesis yang telah diisi dengan buffer TAE. Buffer TAE (Tris-asetat-EDTA)
digunakan sebagai running buffer dalam gel agarosa. Penggunaannya dalam
denaturing metode gradien elektroforesis gel untuk analisis mutasi. TAE telah
digunakan pada berbagai konsentrasi untuk mempelajari mobilitas DNA dalam
larutan dengan dan tanpa klorida natrium. Namun, konsentrasi tinggi dari natrium
klorida (dan garam lainnya) dalam sampel DNA menghambat mobilitasnya. Hal
ini dapat mengakibatkan interpretasi yang salah dari

pola pita DNA yang

dihasilkan. Bagian sumur ditempatkan pada sisi kutub negatif.

Tahap selanjutnya adalah penyiapan sampel, sebelum sampel disiapkan
sumur dicuci terlebih dahulu. Pencucian dilakukan dengan menggunakan buffer
TAE secara perlahan-lahan dengan pipet mikro dengan tips kuning 200 L.
Tujuan dari pencucian ini adalah untuk membersihkan sumur dari sisa-sisa
agarosa yang masuk ke dalam sumur akibat dari pengangkatan comb. Pencucian
dilakukan perlahan agar tidak merusak agarosa. Selanjutnya sampel dimasukkan
ke dalam sumur. Sampel yang ditotolkan pada praktikum kali ini yaitu tujuh
sampel yang semuanya merupakan DNA bakteri asam laktat. Pada spot VIII
dimasukkan DNA marker yang berfungsi sebagai tolak ukur dalam penentuan
berat molekul sampel DNA. Pada praktikum ini larutan DNA marker yang
digunakan memiliki rentang nilai bobot molekul 100-1500 bp.

Pada saat

penempatan sampel, pertama dibuat campuran untuk masing-masing sampel yang

terdiri dari 1 L loading buffer, 5 L sampel. Kemudian dicampur dengan
menggunakan pipet mikro dengan tips kristal 20 L yang volumenya telah diatur

menjadi 6 L di atas parafilm. Parafilm berfungsi sebagai tempat pensuspensian

loading buffer dengan sampel. Parafilm bersifat mudah merenggang, moldable,
tahan air, tidak berbau, semitransparan dan self-adhering. Karena sifat selfadhering inilah, campuran sampel dan loading buffer dapat melekat secara
fleksibel dan dapat menyatu. Penambahan Loading buffer berfungsi sebagai
pemberat dan digunakan agar sampel DNA tidak meluber ke larutan buffer TAE
karena sampel DNA sangat ringan. Loading buffer memiliki kekuatan sampai 6
kali dimana 1 L loading buffer dapat digunakan sebagai pemberat untuk 5 L
sampel DNA. DNA marker ditambahkan 1 L loading buffer untuk 5 L DNA
dan diresuspensi kembali dengan pipet mikro. Sampel DNA dan Marker masingmasing ditempatkan pada sumur dimana saat penempatan sampel harus dilakukan
dengan hati-hati untuk mencegah robeknya dinding dan dasar sumur, karena
robeknya dinding dan dasar sumur dapat menyebabkan sampel akan meluber ke
larutan TAE dan

proses elektroforesis menjadi tidak maksimal. Sampel 1

ditempatkan pada sumur kedua, diikuti dengan sampel 2 dalam sumur 3, sampel 3
dalam sumur 4, dan seterusnya. Sedangkan marker dalam sumur 8. Pada sumur
paling pinggir baik kanan (sumur 1) maupun kiri (sumur 17) tidak diisi sampel.
Hal ini dikarenakan apabila sumur mengalami kebocoran pada saat penempatan
sampel maka sampel dapat tertampung kepinggir sehingga mengurangi
kemungkinan sampel menyebar pada larutan buffer. Sedangkan DNA marker
ditempatkan pada sumur nomor 8 agar saat proses analisis bands yang terbentuk
pada UV atau transluminator mempermudah praktikan menentukan ukuran
potongan sampel DNA secara visual. Selain itu, tujuan penempatan marker di
tengah sampel DNA adalah untuk memudahkan praktikan dalam pengamatan
sampel yang telah di run.
Tahap terakhir adalah elektroforesis. Setelah seluruh sampel dan DNAmarker di masukan kedalam sumur maka elekroforesis dapat dijalankan dengan
mengaliri listrik pada sistem elektroforesis. Pada praktikum ini digunakan listrik
sebesar 110 volt dalam 25 menit. Pada saat inilah sampel akan bergerak melalui
matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik dengan log jumlah basa.
Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih

besar. (Watson, 2007). Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel
sehingga kurang efisien lajunya daripada molekul yang lebih kecil. Dalam proses
elektroforesis akan terjadi pergerakan sampel dan DNA marker akan bergerak dari
kutub negatif ke kutub positif. Arah pergerakan menuju kutub positif karena
sampel dan DNA-marker yang digunakan memiliki muatan negatif. Selama listrik
dijalankan maka sampel dan DNA marker akan terus bergerak dengan jarak
tempuh yang berbeda-beda pada setiap fragmennya. fragmen yang lebih besar
akan bergerak lebih lambat karena terjadi gesekan yang lebih besar dengan
medium penyangga (Watson, 2007). Setelah 25 menit elektroforesis dihentikan
lalu agarosa dikeluarkan dari chamber elektroforesis. Setelah proses elektroforesis
selesai, medium agarosa dikeluarkan dari chamber. Selanjutnya dilakukan staining
(pewarnaan) dengan EtBr (ethidium bromida) yang bertujuan untuk visualisasi
asam nukleat, yaitu dapat berikatan dengan asam nukleat dengan cara masuk
diantara basa nukleotida dan berfluoresensi pada sinar UV saat berikatan dengan
DNA. EtBr bersifat karsinogen maka harus diperlakukan dengan hati-hati
(Sudjadi, 2008). Untuk mewarnai fragmen DNA dengan EtBr, gel agarosa yang
telah dielektroforesis direndam selama 2 kali dalam 10 menit, dimana perendaman
pertama dilakukan selama 10 menit hasilnya belum terlalu kelihatan sehingga
dilakukan perendaman yang kedua selama 10 menit sehingga hasil terlihat jelas.
Selanjutnya

sampel

divisualisasi

dengan

UV

transluminator.

Sebelum

divisualisasi dengan UV transluminator, gel agarosa yang telah direndam dengan

EtBr dilakukan pencucian dengan aquadest. Tujuan pencucian dengan aquadest
adalah aquades untuk mencuci kelebihan EtBr yang masih tersisa.
Setelah divisualisasi dengan UV transluminator terlihat pita-pita protein
yang memiliki warna terang. Dengan melihat pita-pita protein ini maka BP
(pasangan basa) dari setiap sampel dapat ditentukan. Penentuan BP setiap sampel
dilakukan dengan membandingkan BP sampel DNA dengan marker DNA.
Marker DNA yang digunakan memiliki rentang bobot molekul antara 100-1500
BP. Bobot molekul 100 BP ditunjukkan oleh pita yang paling jauh dengan sumur.
Bobot molekul (BM) besar berada pada bagian bawah dekat dengan sumur,
sedangkan sampel dengan bobot molekul kecil berada lebih jauh dari sumur.

10

Gambar 1. Hasil elektroforesis gel agarosa

Hasil dari pengamatan elektroforesis gel yaitu pada sumur 1 tidak ada pita,
karena tidak terdapat sampel. Pada sampel 1,2,5,7 DNA asam laktat tidak
teridentifikasi/ tidak terdapat pita yang terbentuk baik disebelah kanan dan kiri
DNA marker. Ketidak adaan pita ini disebabkan karena tidak ada sampel yang
bermigrasi. Tidak adanya sampel yang bermigrasi diakibatkan oleh robeknya
dasar sumur pada saat penempatan sampel sehingga sampel hanyut terbawa
running buffer. Pada sampel 3,4, 6 DNA masing-masing berisi pita baik sebelah
kanan dan kiri DNA marker. Dapat dilihat di gambar 1,pita yang dihasilkan pada
setiap sumur sampel dapat ditentukan banyak pasang basanya dengan cara
membuat titik tengah pada setiap pita kemudian membandingkannya dengan
DNA-marker dan literaturnya. Dengan cara demikian didapat hasil berikut: Pada
sumur 3, 5 dan 6 yang masing-masing sumur terdapat sampel 2,4,5 DNA masingmasing berisi pita dengan ukuran 500 bp,karena seluruh band yang dihasilkan
sejajar pada band yang menunjukkan 500 bp pada DNA marker. Band yang
diidentifikasi hanya band yang berfluoresensi paling terang karena band-band lain
bukan merupakan DNA melainkan kemungkinan jejak DNA primase.Terbukti
bahwa salah satu faktor yang mempengaruhi migrasi sampel adalah ukuran
sampel atau besar kecilnya pasang basa fragmen sampel. Faktor ini juga yang
akan digunakan sebagai bahan untuk mengidentifikasi sampel.Faktor lain yang

11

membuat hasil sedikit berbeda dengan literatur adalah gel agarose yang
digunakan. Pada literature gel agarose yang digunakan konsentrasinya yaitu 2%
sedangkan pada pratikum digunakan agarose 1,2% sehingga pita yang dihasilkan
jaraknya berdekatan.

VII.

KESIMPULAN
Berdasarkan pembahasan elektroforesis di atas, didapat beberapa

kesimpulan sebagai berikut.

12

1. Prinsip

kerja

elektroforesis

adalah

memisahkan

molekul-molekul

bermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan

listriknya. Khusus untuk DNA, pemisahan tidak didasarkan atas perbedaan
muatan listriknya, tetapi menurut ukuran dan konformasi atau struktur
fisik molekulnya. Gel yang digunakan adalah agarose 1,2%.
2. Pemisahan dengan metode elektroforesis dilakukan dengan menotolkan
sampel pada well gel agarosa yang telah diberi buffer, kemudian dilakukan
running untuk proses pemisahannya. Molekul DNA bermuatan negatif
sehingga di dalam medan listrik bermigrasi melalui matriks gel menuju
kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju
migrasinya. Dari ketujuh sampel didapat bahwa sampel 3,4,6 DNA dengan
ukuran 500 bp, karena seluruh band yang dihasilkan sejajar pada band
yang menunjukkan 500 bp pada DNA marker.

DAFTAR PUSTAKA

13

Marks, Dawn B., Marks, Allan D., Smith, Colleen M. 1996. Biokimia Kedokteran
Dasar. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran. hal: 239
Sudarmadji,S. 1996. Teknik Analisa Biokimiawi, Edisi Pertama. Yogyakarta:
Liberty
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius
Watson, David G. 2007. Analisis Farmasi Edisi 2. Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran. hal: 388
Widjaja, dkk. 2012. Petunjuk Praktikum Metode Pemisahan. Denpasar: Udayana
University Press
Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekular. Jakarta : Penerbit Erlangga
-

14