UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA

Facultad de Ingeniera, Ciencias y Administracin

Biloga Molecular

Manual de Biologa
Molecular

Profesor: Dr. Jorge Faras A.

Ayudante: Stefania Short R. Estudiante de Ing. En Biotecnologa

INTRODUCCIN
Los avances y aplicaciones de la investigacin bioqumica y gentica ocupan hoy da una
posicin privilegiada en el campo de las ciencias de la salud en general y en la Farmacia y
Biomedicina en particular. Se vislumbra en los albores del siglo XXI una tendencia hacia el
enfoque molecular de la enfermedad, como referente ltimo en la interpretacin de los
procesos patolgicos y como horizonte de nuevas estrategias diagnsticas y teraputicas
basadas en dichos avances.
La metodologa derivada de la Biologa Molecular, y en especial de la Ingeniera Gentica
(inicialmente limitada a la tecnologa del DNA recombinante), se ha ido extendiendo con el
tiempo a fines muy diversos (aislamiento, clonacin, hibridacin, secuenciacin, etc), para dar
lugar a una Biotecnologa Molecular.

La Biologa Molecular e Ingeniera Gentica han contribuido a resolver problemas de carcter industrial
(eliminacin de xenobiticos o residuos), agrcola y ganadero (mejora gentica y alimentos
transgnicos). Las aplicaciones en Farmacia, Medicina y Veterinaria, que se centran en la lucha contra
la enfermedad humana y animal (etiologa, patogenia, diagnstico, tratamiento y prevencin). Este
extraordinario avance ha dado lugar a una serie de trminos que, en general, incluyen el prefijo bio- o
el adjetivo molecular. Como representativo de todos ellos se acepta hoy el trmino Biomedicina o
Medicina Molecular, considerado de una forma amplia como una visin molecular de todos los
aspectos relacionados con la enfermedad.
Es conveniente describir los tres aspectos que mejor ponen de manifiesto el papel de los cidos
nucleicos en la clula y en especial del DNA como portador de la informacin gentica. Por un lado, la
descripcin global de las rutas de transmisin de la informacin gentica; en segundo lugar, los
antecedentes experimentales que demostraron el importante papel de los cidos nucleicos;
finalmente, las caractersticas generales del genoma de eucariontes, como punto de partida para el
estudio posterior en profundidad de los conceptos tericos, las tecnologas y las aplicaciones de esta
materia en las ciencias de la salud.
Francis Crick introdujo el trmino Dogma central de la gentica molecular para describir, incluso
antes de conocerse su importancia real en los seres vivos, el flujo de la informacin gentica y la
utilizacin celular de dicha informacin.

En concreto, la transmisin de la informacin contenida en la secuencia del DNA a las clulas y

organismos descendientes mediante la replicacin, y su expresin en biomolculas funcionales
mediante los procesos de transcripcin y traduccin. Comprende, pues, el conjunto de relaciones
generales existentes entre el DNA, el RNA y las protenas.

Debe resaltarse que la representacin abreviada DNA RNA Protena no indica la transformacin
de una molcula en otra, tal como se indica normalmente en las rutas metablicas, sino que cada
elemento es la secuencia aporta la informacin necesaria para la sntesis del siguiente. En este sentido,
es importante el concepto de plantilla o molde molecular: aunque cada paso est catalizado por una
enzima, los sustratos (nucletidos, aminocidos) no son seleccionados por ella, sino que vienen
especificados por la intervencin del molde, en concreto por su secuencia de nucletidos.

LABORATORIO N1.
Extraccin y Cuantificacin de protenas totales.
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina
bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se
quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de
enfermedades, as como para otros muchos propsitos.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se
basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la
formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos
colorantes. En la Tabla I se recogen los mtodos ms usados as como sus respectivas
sensibilidades.
Tabla I. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas y sus rangos de sensibilidad.

Mtodo de Bradford
Se basa en la unin de un colorante, Coomassie Blue G-250 (tambin Serva Blue) a las
protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las
protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un
coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g),
simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias
que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas. Para Bradford se utiliza una
solucin estndar de albmina bovina srica (BSA) de 1 a 10 mg/mL; mientras que para un
Micro-Bradford se utiliza una solucin estndar de BSA de 100 a 1000 g/mL.
Materiales y Reactivos
Materiales
- Balanza analtica
- Espectrofotmetro
- Esptula
- Tubo Falcon de 50 mL

- Tubo Falcon de 15 mL
- Matraz Erlenmeyer 100 mL
- Probeta 100 mL
- Vaso precipitado 100 mL

- Placa de Petri

- pHmetro

- Bistur
- Pinzas

Reactivos
- Tris

- Homogenizador Potter

- NaCl

- Centrfuga

- EDTA

- Tubos eppendorf 0,5 mL y 1 mL

- EGTA

- Cubetas de vidrio 2 mL

- Tween-20

- Vrtex

- PMSF

- Agitador magntico

- BSA stock = 2 mg/mL

- Piseta

- Reactivo de Bradford

- Micropipetas

- Agua destilada

- Puntas de micropipetas

Actividad I
a) Preparacin de soluciones:
- Preparar 25 mL de buffer de lisis (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 2,5 mM,
Tween-20 0,1% [pH 7.4], PMSF 100 ug/mL; Sigma-Aldrich).
b) Tratamiento con buffer de lisis: 400 mg de tejido deben ser homogenizados con 1 mL de
buffer de lisis durante 5 minutos. Posteriormente, la muestra debe ser centrifugada a 10.000
rpm durante 30 min a 4C. El sobrenadante debe ser alicuotado y almacenado a -20 C.
Actividad II
a) Para realizar el Micro-Bradford se debe hacer una curva estndar con una solucin
estndar de BSA de 200 g/mL. Para iniciar la etapa de cuantificacin es necesario un stock
de BSA (2 mg/mL en un volumen final de 1 mL) del cual se tomar el volumen necesario para
realizar la solucin estndar en un volumen final de 20 mL (no olvidar alicuotar en volmenes
de 1 mL).
b) Preparar la batera de tubos de la curva de calibrado como se presenta en la tabla. Una vez
agregada la solucin de Bradford se debe dejar reposar durante 5 min a temperatura
ambiente. Leer la absorbancia a 595 nm, frente a un blanco de reactivos. La concentracin de
BSA se obtiene a travs de la frmula Ci x Vi = Cf x Vf. Los datos son necesarios para realizar
la regresin lineal.

TUBO
Blanco
1
2
3
4
5
6
7
8

Agua
Destilada (L)
100
90
80
70
60
50
40
30
20

BSA
(L)
0
10
20
30
40
50
60
70
80

Bradford
(mL)
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Absorbancia
595nm

Concentracin
BSA (mg/mL)

c) Colocar dentro de una cubeta de vidrio 50 L de la muestra (probar la concentracin ms

adecuada). Adicionar 50 L de agua destilada y 1 mL del reactivo de Bradford. Mezclar
perfectamente, en vrtex o por inversin del tubo. Dejar reposar durante 5 min a temperatura
ambiente. Leer la absorbancia a 595 nm, frente a un blanco de reactivos. La concentracin de
protena se calcula a partir de una curva patrn.
d) Calcular la concentracin de protenas totales de la muestra problema a travs de la
frmula: A = m x C + Ao
A = Absorbancia de la muestra (A),
C = Concentracin
m = Pendiente de la recta
Ao = Ordenada al origen
Nota: No olvidar considerar el factor de dilucin (fd) si es que fuera necesario.
Cuestionario
1. Compare entre la curva estndar hecha con un slo punto y una curva estndar
realizada con tres repeticiones, en cuanto al valor R2 obtenido en cada una. Qu
puede concluir?
2. Qu concentracin de protenas posee su muestra? Presente claramente todos los
clculos.
3. Explique la importancia de los compuestos utilizados en el buffer de lisis.

LABORATORIO N2.
Electroforesis de protenas.
Dentro de los estudios realizados en biologa molecular, resulta ser muy til la separacin de
las molculas biolgicas presentes en una determinada muestra. La tcnica conocida como
electroforesis, es ampliamente utilizada para estos propsitos, ya que permite la separacin
de cidos nucleicos o protenas de acuerdo a su movilidad y tamao cuando son sometidas a
un campo elctrico.
Existen una gran variedad de protocolos para proceder a realizar una electroforesis de
protenas (SDS/PAGE). Sin embargo, de manera general los pasos de la electroforesis se
resumen en:
1. Preparacin de la muestra problema.
Para efectuar un ensayo de protenas, se necesita estandarizar la cantidad de protena con
que se va a estandarizar. En general, para los ensayos electroforticos, se cargan de 40 a 80
g de protena. Para ello, se necesitan los valores de la cuantificacin de protena para
conocer el volumen necesario para cargar en el gel. Una vez conocido el volumen, se agrega
solucin cargadora que desnaturaliza y tie la muestra.
2. Montaje del sistema electrofortico.
Este consiste en un sistema de vidrios y un soporte que ser de sostn para el gel de
acrilamida que contendr las muestras a trabajar. Este sistema permite una corrida vertical de
las muestras problema y permite el paso de una corriente elctrica que permitir la separacin
de las protenas a lo largo del gel, desde el nodo al ctodo.
3. Preparacin de geles de acrilamida.
En esta etapa, se deben preparar dos geles: el gel separador y el concentrador. El gel
separador, tiene la funcin de separar por tamao a las protenas que corren a travs del gel
impulsadas por la corriente elctrica. La eleccin de la concentracin que tendr este gel es
crtica, ya que dependiendo del peso molecular de la protena de inters, el gel ser ms
concentrado o diluido. As, mientras mayor es el peso molecular de la protena, el gel de
poliacrilamida deber estar menos concentrado, para que se obtenga una mejor separacin y
resolucin en el momento de la deteccin.
El gel concentrador es preparado sobre el separador y permite, como su nombre lo indica,
concentrar todas las muestras cargadas en los pocillos para que luego estos comiencen a
correr desde el mismo punto y as la separacin sea pareja. Normalmente, se trabaja a una
concentracin del 4% de acrilamida en este gel.
4. Carga de las muestras en el gel.
Una vez que los geles se han solidificado, se procede a cargar las muestras en los pocillos
disponibles en el gel concentrador (ver Figura 1). Cuando finaliza la carga, se procede a
conectar los electrodos de la cmara electrofortica en una fuente de poder y se conecta a un
voltaje constante, el cual puede variar de 60 a 150 V. A medida que avanzan las muestras en
el gel, la banda azul que se observa comienza a migrar hasta el polo positivo (hacia

Figura 1. Sistema de carga de muestras en una cmara electrofortica.

5. Desmontaje.
Transcurrido el tiempo de corrida (el cual vara entre 2 o ms horas), se apaga la fuente de
poder, se desconectan los electrodos y se procede a desmontar los vidrios. El gel separador
es recuperado y puede ser teido y utilizado para prximos ensayos como el de Western blot.
Factores que afectan la electroforesis.
La corrida de las protenas en el campo elctrico establecido en la cmara electrofortica, se
relaciona con la Ley de Ohm, donde se tiene que el voltaje (V) estar determinado por la
resistencia (R) y a la corriente (I) que fluye a travs del gel, segn la ecuacin:
V=IxR
La temperatura, es otro factor que determina la eficiencia electrofortica, ya que producto del
paso de corriente elctrica se genera calor, el cual provoca el aumento de la resistencia de las
molculas para pasar en el gel.
Materiales y Reactivos
Materiales
- Balanza analtica
- Frasco de vidrio mbar de 100 L
- Esptulas
- Matraz Erlenmeyer 100 mL
- Probeta 100 mL y 1 L
- Vaso precipitado 100 mL y 1 L
- Parafilm
- Frasco de vidrio de 1 L
- Tubos eppendorf 0,5 mL y 1 mL
- Vrtex
- Agitador magntico
- Piseta
- Micropipetas
- Puntas de micropipetas
- pHmetro
- Cmara electrofortica
- Vidrios de montaje
- Peinetas de separacin
- Papel filtro

- Hielo
Reactivos
- Acrilamida/Bis acrilamida
- Persulfato de amonio
- SDS
- Tris
- Glicina
- Agua destilada
- EDTA
- Mercaptoetanol
- Azul de bromofenol
- Glicerol
- Metanol
- TEMED
- N-butanol

Actividad I
a) Preparacin de reactivos:
10 mL de Persulfato de Amonio 10% (PSA). Tapar con parafilm y agitar.
Alicuotar y mantener congelado a -20C ya que el PSA no es estable en solucin.
10 mL de SDS 10%. Almacenar a temperatura ambiente.
Buffer Lower: Preparar 50 mL de buffer con Tris 1,5 M, ajustar el pH hasta un
valor de 8,8 con HCl, aforar y almacenar refrigerado.
Buffer Upper: Preparar 50 mL de buffer con Tris 0,5 M, ajustar el pH hasta un
valor de 6,8 con HCl, aforar y almacenar refrigerado.
Tampn de corrimiento 5X: Preparar 1 L de buffer con Tris 0,125 M, glicina
0,96 M y SDS 0,1%, disolver, ajustar el pH hasta un valor de 8,3 con HCl, aforar y
almacenar refrigerado.
Actividad II
a) Electroforesis.
Para 10 mL
Buffer Lower
A/BA 30%
H2O d
SDS 10%
PSA
TEMED

5%
2,5 mL
1,7 mL
5,45 mL
100 L
125 L
10 L

Gel separador
7,5%
9%
10%
2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL
2,5 mL
3 mL
3,3 mL
4,7 mL 4,3 mL
4 mL
100 L 100 L 100 L
125 L 125 L 125 L
10 L
10 L
10 L

12%
2,5 mL
4,08 mL
3,25 mL
100 L
125 L
10 L

13%
2,5 mL
4,5 mL
2,9 mL
100 L
125 L
10 L

15%
2,5 mL
5 mL
2,3 mL
100 L
125 L
10 L

Gel concentrador 4%
Buffer Upper
1,25 mL
A/BA 30%
0,65 mL
H2O d
3,05 mL
SDS 10%
50 L
PSA
60 L
TEMED
L
- Montar los vidrios previamente limpios con etanol.

- Agregar el gel separador hasta alrededor de 1 a 2 cm bajo el vidrio corto.

- Agregar unas gotas de n-butanol para emparejar.
- Una vez polimerizado el gel separador, eliminar el n-butanol.
- Preparar el gel concentrador y verter hasta el rebalse, colocar la peineta y dejar
polimerizar.
- Una vez polimerizado el gel concentrador, sacar la peineta e instalar el sistema
en la cmara.
- Agregar el tampn de corrimiento 1X arriba y abajo hasta la lnea de mximo
llenado.
- Extraer las burbujas inferiores y conectar a 120 V.

Cuestionario
1. Indique cul es el objetivo de cada uno de los reactivos del buffer de corrimiento,
buffer lower, buffer upper y gel separador, y su importancia para que la separacin
de las protenas se lleve a cabo.
2. Explique porqu el gel separador presenta distintos porcentajes de gel y porqu
el gel concentrador slo presenta un porcentaje del 4%.

LABORATORIO N3.
Western Blot.
La inmunoprecipitacin es una de las tcnicas inmunolgicas ms tiles cuando se
asocia a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De este modo se puede
determinar la presencia y cantidad de un antgeno, el peso molecular relativo de
una cadena polipeptdica, su sntesis y degradacin, la interaccin con protenas,
cidos nucleicos u otros ligandos.
Si se trata de protenas, la tcnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos
marcados con radioactividad para identificar cul es la banda que presenta la
protena que me interesa localizar.
Si se trata de DNA, la tcnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA
(molculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida)
para identificar qu bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de
la sonda.
Si se trata de RNA, la tcnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA
(molculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida)
para identificar qu bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de
la sonda.
En la actualidad el Western blot es el estudio confirmatorio ms empleado para el
diagnstico del SIDA. Se emplean antgenos virales obtenidos por cultivo celular.
Mediante electroforesis se separan las diferentes protenas vricas por su diferente
peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y
secundariamente se incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan
aadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que
produce una banda coloreada al aadir un sustrato. Esta tcnica identifica
anticuerpos especficos frente a las distintas protenas del VIH. Las protenas son
separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y
posteriormente se transfieren mediante la aplicacin de un campo elctrico
perpendicular al gel a una membrana. El procedimiento es anlogo al desarrollado
por el Prof. E. Southern ('Southern blotting') y por ello se le denomin 'Western'.
Los principales
autorradiografa.

pasos

del Western son:

Electroforesis,

Transferencia y

Electroforesis: Se separan las protenas en gel de poliacrilamida.

Transferencia (blotting): Se transfieren las bandas de protenas o de cidos

nucleicos desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules) para
que puedan reaccionar con la sonda radioactiva.

Autorradiografa: Se aaden anticuerpos radiactivos contra una protena o sondas

radioactivas de cidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A).
Se coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa fotogrfica y se revela (B).

Materiales y Reactivos
Materiales
- Balanza analtica
- Frascos de vidrio transparente
- Esptulas
- Matraz Erlenmeyer 100 mL
- Probeta 100 mL y 1 L
- Vaso precipitado 100 mL y 1 L
- Placa de Petri
- Pinzas
- Parafilm
- Frascos de vidrio de 1 L
- Tubos eppendorf 1mL
- Vrtex
- Agitador magntico
- Piseta
- Micropipetas
- Puntas de micropipetas
- pHmetro
- Cmara de transferencia
- Esponjas de transferencia
- Papel filtro
- Membrana de nitrocelulosa
- Hielo
- Cassette de revelado
- Film
- Tijera

- Pocillos de plstico para lavado

- Pocillos de plstico para revelado
Reactivos
- Acrilamida/Bis acrilamida
- Persulfato de amonio
- SDS
- Tris
- Glicina
- Agua destilada
- NaCl
- KCl
- Na2HPO4
- KH2PO4
- Tween-20
- EDTA
- Mercaptoetanol
- Azul de bromofenol
- Glicerol
- Metanol
- TEMED
- N-butanol
- Leche descremada
- Kit quimioluminiscente
- Fijador
- Revelador

Actividad I
a) Preparacin de reactivos:
Buffer de Transferencia 10X: Preparar 1 L de buffer con Tris 0,25 M, glicina
1,92 M, ajustar el pH hasta un valor de 8,3 con HCl. Aforar y almacenar
refrigerado.

Buffer PBS 20X: Preparar 1 L de buffer con NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM,
Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM. Disolver los reactivos en 800 mL de agua
destilada, ajustar el pH hasta un valor de 7,4 con HCl, aforar, autoclavar y
almacenar refrigerado.
Buffer PBS-T: Preparar 1 L de buffer con 50 mL de Buffer PBS 20X y 1 mL
Tween-20. Ajustar el pH hasta un valor de 8 con HCl, aforar y almacenar
refrigerado.
Buffer de Transferencia + Metanol: Preparar 1 L de buffer con 100 mL de
Buffer de Transferencia 10X, 200 mL de metanol y 700 mL de agua destilada.
Almacenar a 4C.
Actividad II
a) Electrotransferencia.
- Sacar el gel a transferir cuidadosamente y ponerlo sobre un trozo de membrana
del tamao de ste, marcando la posicin del carril 1 donde se carg el marcador
de peso molecular y teniendo la precaucin de utilizar guantes.
- Sumergir la membrana, dos trozos de papel filtro del mismo tamao y el gel en el
buffer blot.
- Montar la cmara de transferencia en hmedo como sigue: bandeja, esponja,
papel filtro, gel, membrana, papel filtro, esponja y bandeja, evitando que queden
burbujas. La membrana debe quedar hacia el nodo.
- Montar el equipo de transferencia en un bao de hielo, llenar la cmara con buffer
blot a rebalse y transferir por 1 hora entre 80-100 V.
- Sacar la membrana y bloquearla con leche descremada 5%/PBS 1X pH: 7,4
durante 1 hora con agitacin a temperatura ambiente.
- Lavar la membrana con PBS 1X pH: 7,4 para extraer los restos de leche e
incubar toda la noche con el anticuerpo primario en la dilucin adecuada en leche
descremada 1%/PBS 1X pH: 7,4 a 4C.
- Lavar cinco veces por 10 minutos con Tween-20/PBS 1X pH: 7,4.
- Incubar con el anticuerpo secundario en la dilucin correspondiente en leche
descremada 1%/PBS 1X pH: 7,4, durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Lavar cinco veces por 10 minutos con Tween-20/PBS 1X pH: 7,4.
b) Revelado.
- En oscuridad, incubar con el kit de quimioluminiscencia procurando cubrir toda la
membrana.
- Poner la membrana en el cassette de revelado y tapar con la mica, poner encima
un trozo de film de mismo tamao y esperar un tiempo (estimativo).
- Sacar el film del cassette y ponerlo en contacto con el revelador, hasta apreciar la
marca del velado. Lavar con agua destilada y poner el film en contacto con el

fijador (hasta que ste se vea transparente), luego lavar nuevamente con agua
destilada y dejar secar.
Cuestionario
1. Indique cul es el objetivo de cada uno de los reactivos del buffer de
transferencia.
2. Por qu al momento de utilizar el buffer de transferencia 1X se le debe agregar
metanol?
3. Cul es la importancia de las protenas como -tubulina y -actina para los
ensayos de protena?