Anda di halaman 1dari 10

1.

Pengertian Elisa Reader


ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan
kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai
laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang
relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA
diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis
adanya

interaksi antigen dengan antibodi di

dalam

suatu

sampel

dengan

menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label).

2. Penggolongan Elisa Reader


Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang
menggunakan konjugat antigenenzim atau konjugat antobodienzim, dan non-competitive
assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua
akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut
sebagai "Sandwich" ELISA.

3. Teknik Penggunaan Elisa REader


Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik
"Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:
1.

Well dilapisi atau ditempeli antigen.

2.

Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.

3.

Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti

peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya.
4.

Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi.

5.

Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA

reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata
kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positifnegatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif,
dan demikian juga sebaliknya.
Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang
besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu
dengan antigen lain.[2] Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan
pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai
sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi

4. Sejarah Penemuan
Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan
Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA
konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu
sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi
sebagai pelopor/ reporter/ signal.
Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk
mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi atau
antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur
kada antibodi atau antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu erupa spektrofotometer
atau dengan cara menetukan jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga
dapat dibuat suatu kurva standard an kadar antibodi atau antigen yang tidak diketahui dapat
ditentukan.

5. Prinsip Dasar Teknik ELISA


Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut :
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan
yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu
penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan
secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan
antigen atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich).
Selanjutnyaantibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal
(disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik
, sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke
atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang
bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim
yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau
antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat
dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau
antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran
flourescense.

6. Kelebihan dn Kelemahan Teknik ELISA


Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :

Teknik pengerjaan relatif sederhana

Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)

Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.

Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen


tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen
yang bersifat sangat spesifik)

Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis
antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen)

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol
negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan
blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi
bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.

Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan
harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan
memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

6. Alat dan Bahan Yang Digunakan


Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter. Microtiter ini
berupa suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah bawah
dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini terbuat dari bahan plistirena. Cekungan dari
microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter 0,7 cm. Selain itu, alat dan bahan lain
yang umum digunakan dalam teknik ELISA antara lain :

Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang akan dideteksi atau dikuantifikasikan berupa
antibodi).

Larutan standard (kontrol positif dan negatif).

Sampel yang ingin dites.

Cairan pencuci (buffer).

Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal.

Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal.

ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.

7. Macam-macam Teknik ELISA


Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA
kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan
teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada
teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim
yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai
teknik ELISA sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik.
Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut
sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik
ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain :
a. ELISA Direct
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini
seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel
ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi
keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen
yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel
pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal
dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen
yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibody
tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang
microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga
enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan
akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi. Pendeteksian

interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan
menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim.

Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.


Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada
percobaan yang berbeda.
Amplifikasi signal hanya sedikit.

Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan
untuk uji ELISA direct.

Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :

Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.

Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan
antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.

b. ELISA Indirect
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling
sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya
merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta
antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang
diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada ELISA indirect, pertama mocrotiter diisi dengan larutan yang mengandung
antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapal menempel pada bagian dinding
lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak
menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung
antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubnag microtiter, sehingga terjadi
terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan. Selanjutnya
microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen
spesifik. Lalu ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody sekunder
spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara
antibody

yang

diinginkan

dengan

antibody

sekunder

spesifik

tertaut

enzim

signal. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibody sekunder tertaut enzim
signal yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA
indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yag

tertaut dengan antibody sekunder speifik yang telah berinteraksi dengan antibody yang
diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena
ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara
antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan
dengan antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya
membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang
diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :

Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar.

Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan
enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.

Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa
epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.

c. ELISA Sandwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap
antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi
keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip
dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan
tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat
berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim
signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki
minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent
seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut
sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai
antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan
dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat
sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut
untuk berinteraksi dengan kedua antibody.

Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung
antibody penangkap, sehingga antibody penangkap tersebut dapat menempel pada bagian
dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibody
penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel
yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter,
sehingga terjadi interaksi antara antibody penangkap dengan antigen yang diinginkan.
Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak bereaksi dengan
antigen penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody
detector sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang
diinginkan dengan antibody detector. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang
antibody detector yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Kemudian pada tahap
akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu
enzim yang tertaut pada antibody detector yang telh berinteraksi dengan antigen yang
diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat
sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain :

Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-dinding


microtiter.

Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya,
teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu,
yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada
tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus
dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody
detector. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu
teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent
serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada
sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

d. ELISA Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)


Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk
mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai
teknik ELISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich,
hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector

(antigen bertaut enzim signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut
dengan enzim signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi vitamin biotin
yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah antibody avidin menjadi
antibody streptavidin, dimana satu molekul streptavidin dapat mengikat empat molekul biotin
(pengembangan dari ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin
kuat akibat interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.
e. ELISA Kompetitif
Teknik

ELISA

jenis

ini

juga

merupakan

pengembangan

teknik

ELISA

terdahulu.Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiter.Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody.
Pada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal,
sehingga

antibody spesifiktersebut

dapat

menempel

pada

bagian

dinding-dinding

lubangmikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan
enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen spesifik bertaut
enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody
spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen spesifik
tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. Lalu
kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan
enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen
yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik.
Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody

yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi


antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik. Lalu, kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik,
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses
pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik.
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen.
f. ELISA Multiplex
Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk
pengujian secara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.

8. Aplikasi Teknik ELISA


Berikut ini adalah beberapa ontoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:
a.

b.

c.

Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus:

HIV-1 dan HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)

Hepatitis C (presence of antibodies)

Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus)

HTLV-1 dan -2 (keberadaan entibodi)

Pengukuran level hormone

hCG (sebagai tes kehamilan)

LH ( menentukan waktu ovulasi)

TSH, T3dan T4 (untuk fungsi thyroid)

Pendeteksian Infeksi

Agen penularan secara seksual, HIV, Syphilis dan Chlamydia

Hepatitis B dan C

Toxoplasma Gondii

d. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.


e. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatab terlarabg, seperti

Cocain

Opium

-9-tetrahydrocannabiol, campuran aktif pada marijuana.