Pewarnaan Bakteri
1.
2.
3.
4.
5.
Disusun oleh
Ardina Citra Astuti
Firma Maulida
Fradita Mardathilla
Lina karlina
Switiani eka yuliani
Kelas
Kelompok
:
(1104015031)
(1104015106)
(1104015113)
(1104015175)
(1104015314)
:3K1
:3
BAB I
PENDAHULUAN
warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya
dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora,
flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling
utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi .
Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri
terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri
digunakan
pewarnaan
Gram,
dan
pewarnaan acid-fast(tahan
asam)
untuk
genus Mycobacterium.
prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum
melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik.
Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat
bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai
macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut.
Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara
umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu
kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).
2.
Pewarnaan differensial
Pewarnaan differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram
dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia
dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram
positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau
sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram
tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma
sp.
Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan
beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui
memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan
dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel
bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau
Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal
yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu
pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah
untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan (Jimmo, 2008).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel
bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan
zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,
peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat
yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna
terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini
dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro,
1994).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada
bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan
tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik
pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga
dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan
endospora, flagella dan pengecatan kapsul.(waluyo,2010)
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah
yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat
warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat
pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu
teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Rizki, 2008).
2.1 Macam-macam pewarnaan
2.1.1 Pewarnaan
Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat
diketahui.
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin,
fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna
Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat
pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan
pewarnaan Gram, dan pewarnaan acid-fast(tahan asam) untuk genusMycobacterium.
Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan
pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula
metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan
mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik
pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008).
2.1.2 Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel.
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe
morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan
pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat
basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan
Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa
contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan
fukhsin-karbol (5 detik).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu
bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram
negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan
tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Contoh bakteri gram posittif
contoh bakteri gram negatif
Sumber: http://id.wiki
pedia.org/wiki/Pewarn
aan_Gram
Pewarnaan Tahan
Asam
Pewarnaan ini
ditujukan terhadap
bakteri yang
mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri
diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat
warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asamalkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis
yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling
banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)
Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)
Sumber: http://www.google.com
3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan
spora, pewarnaan kapsul.
Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan
khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan
pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan Basil
Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam
mycolic dari Mycobacterium .
Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton
Sumber http://images.suite101.com/400620_com_endosporestainprocpscanite.jpg
Protokol pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:
Sumber:
Prinsip kerja:
Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar
zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna
fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri
warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Cara Kerja :
Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.
Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit.
Dibuat sediaan dan dikeringkan.
Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik
Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.
Sediaan dicuci dengan air.
Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.
Diperiksa dibawah mikroskop.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga
terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan
menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul.
Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.
4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :
pewarnaan Neisser (granula volutin),
pewarnaan yodium (granula glikogen).
5. Pewarnaan negatif
Tujuan
Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar
diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk
bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi
hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini
berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami
pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah
satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki
negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge
pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang
berwarna.
Kajian religi
1. Al-Furqon: 2
2. Yang kepunyaan-Nya-lah kerajaan langit dan bumi, dan Dia tidak mempunyai anak, dan tidak ada
sekutu baginya dalam kekuasaan(Nya), dan Dia telah menciptakan segala sesuatu, dan Dia menetapkan
ukuran-ukurannya dengan serapi-rapinya[1053].
[1053] Maksudnya: segala sesuatu yang dijadikan Tuhan diberi-Nya perlengkapan-perlengkapan dan
persiapan-persiapan, sesuai dengan naluri, sifat-sifat dan fungsinya masing-masing dalam hidup.
2. An nahl: 12
12. Dan Dia menundukkan malam dan siang, matahari dan bulan untukmu. dan bintang-bintang itu
ditundukkan (untukmu) dengan perintah-Nya. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar ada
tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang memahami (Nya),
1. Al-Baqarah : 164
164. Sesungguhnya dalam penciptaan langit dan bumi, silih bergantinya malam dan siang, bahtera yang
berlayar di laut membawa apa yang berguna bagi manusia, dan apa yang Allah turunkan dari langit
berupa air, lalu dengan air itu Dia hidupkan bumi sesudah mati (kering)-nya dan Dia sebarkan di bumi
itu segala jenis hewan, dan pengisaran angin dan awan yang dikendalikan antara langit dan bumi;
sungguh (terdapat) tanda-tanda (keesaan dan kebesaran Allah) bagi kaum yang memikirkan
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta
Pelezar,chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
Waluyo,lud. 2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM. Malang
Widjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan
Jimmo., 2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,. diakses pada
tanggal 14 April 2009, Makassar.
Fauziah., 2008, http://www.fkugm2008.com/wp-content/uploads/HSC/1-2x/6/Praktikum6.pdf. diakses
pada tangan 04 April 2009, Makassar
4.
Pewarnaan khusus
1.PEWARNAAN NEGATIF
Pewarnaan ini dipakai untuk yang sukar di warnai, misalkan Spirochaeta (Treponema, Leptospira dan
Borrelia)
2. PEWARNAAN SEDERHANA
Pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna. Misalkan Biru metilen, Air Fukhsin atau
Ungu Kristal selama 1-2 menit. Zat warna Anilin mudah di serap oleh kuman.
3. PEWARNAAN DIFFRENSIAL
Pewarnaan Diffrensial menggunakan lebih dari satu macam Zat warna:
A. Pewarnaan Gram: Pewarnaan Diffrensial yang sangat penting. Ditemukan oleh Christian Gram pada
tahun 1884.
B. Pewarnaan Tahan Asam (acid fast staining). Misalkan pewarnaan Ziehl-Neelsen dan KinyounGabbett untuk membedakan kuman-kuman yang tahan Asam dari yang tidak Tahan Asam.
A.PEWARNAAN GRAM
Pewarnaan Differensial dimaksudkan untuk membedakan 2 jenis bakteri berdasarkan daya rekat dinding
bakteri terhadap zat warna. Salah satu jenis pewarnaan differensial adalah Pewarnaan Gram, yang
menggunakan 2 macam zat warna yaitu Zat warna Primer (Kristal Violet) dan Zat warna Sekunder
(Fucshin atau Safranin).
Bakteri dapat membentuk bulat/kokus/coccus dengan susunan berkelompok atau berantai, sebagian
besar bakteri ini bersifat Gram Positif. Bakteri berbentuk berbentuk batang/basil/bacil dapat bersusun
satu-satu, berantai ataupun bertumpuk seperti kayu bakar, sebagian besar bersifat Gram negatif.
Cara Pewarnaan:
1.Sediaan yang sudah direkat diwarnai dengan karbol Kristal Ungu selama 5 menit.
2. Zat warna dibuang dan diganti dengan larutan Lugol dibiarkan selama 45-60 detik.
3. Larutan Lugol dibuang dan sediaan dicuci dengan Alkohol 96% selama 30 detik atau digoyanggoyangkan sampai tidak ada zat warna yang mengalir lagi.
4. Sediaan dicuci dengan air dan diwarnai dengan air Fukhsin selama 1-2 menit. Sediaan dicuci,
dikeringkan dan diperiksa dibawah mikroskop.
Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
-Kuman Positif Gram berwarna Ungu
- Kuman Negatiif Gram berwarna Merah
Sifat kuman terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu
kuman.
B.PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM
Pewarnaan ini adalah segolongan bakteri yang sulit diwarnai, tetapi sekali diwarnai sulit dihapus.
Dinding sel bakteri tahan asam terdiri dari peptidogikan, arabinogalaktan, dan lipid, dimana 50% dari
lipid ini terdiri dari asam nikolat. Bakteri ini dimasukkan kedalam golongan mikrobacterium yang
sebagian besar bersifat satprofit, dikenal juga golongan atipik , sebagian kecil pathogen bagi manusia
yaitu Mycrobaterrium tuberculosis dan Mycrobacterium leprae. Dari pewarnaan BTA dapat dibedakan 2,
yaitu golongan bakteri tahan asam yang akan tetap mengikat zat pewarnaan primer (karbofuksin) dan
tidak akan dilepas pada pencucian alkoholm asam, serta tidak akan mengikat zat warna sekunder (
metilen blue), sedangkan bakteri tidak tahan asam akan melepaskan zat warna primer pada
pencucian alcohol asam dan akan mengikat zat warna sekunder.
Ada beberapa cara mewarnai bakteri tahan asam yaitu, menurut Ziehl-Neelseen, menurut Tan Thiam
Hok (1957) yang disebut juga pewarnaan Kinyoun Gabelt, serta pewarnaan dengan AURAMEN-PHENOL
FLUORCHROME.
Cara Pewarnaan:
1. Metode ZIEHL-NEESEN
a. Buat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca benda hingga bebas dari lemak, bakar ose
hingga pijar dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose kemudian oleskan diatas kaca benda
hingga didapat usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan difiksasi diatas api. Ose setelah
digunakan dibakar lagi hingga pajar.
b. Tuangi sediaan dengan karbol fuksin hingga tergenang, kemudian panaskan diatas api kecil
sampai keluar asap lalu tunggu selama 5 menit
c. Cuci dengan air mengalir
d. Celupkan kedalam H2SO4 selama 2 detik untuk kuman M. leprae
e. Celukan kedalam alcohol 60% sehingga tidak ada lagi zat warna merah yang larut
f. Tuangi preparat dengan methylen blue selama 1-2 menit
g. Cuci dengan air mengalir keringkan tetesi minyal imaersi dan amati dengan mikroskop pembesaran
10 X 100
2.
a.
b.
c.
d.
e.
3. Campurkan kedua suspensi tadi dengan menggunakan ujung kaca benda lain, kemudian dengan kaca
benda tersebut ratakan suspensi kuman sepanjang kaca benda.
4. Keringkan sediaan dan direkatkan
5. Genangi dengan larutan karbol Fukhsin selama 2 menit
6. Cuci dengan air mengalir perlahan-perlahan dan keringkan diudara.
7. Amati dengan Mikroskop pembesaran 10 x 100, pada bagian yang tipis
Keterangan:
- Langkah 1-4 : Metoda Pewarnaan negative (Burri)
- Langkah 5-7 : Metoda Pewarnaan Gins
Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
- Kapsul bakteri : Tidak Berwarna
- Badan bakteri Asam : akan berwarna Merah
- Latar belakang : Hitam
B. PEWARNAAN SPORA BAKTERI
Beberapa genus bakteri dapat membuat endospora, yang diantaranya adalah dari genus bacillus dan
clostridium. Bakteri ini mengalami siklus diverensiasi untuk merespon keaddaan lingkungan buruk
seperti : kekeringan, kekurangan makanan, dll. Tiap sel membentuk satu endospora yang akan
dilepaskan bila sel induk mengalami otolisis. Spora adalah bagian dalam bentuk istirahat. Spora
bersifat resisten terhadap panas, kekeringan , dan zat kimiawi. Bila kondisi lingkungan telah baik
kembali spora dapat kembali melakukan gemisasi dan memproduksi sel vegetative.
Cara Pewarnaan:
1. Buat suspensi bakteri didalam 1 ml NaCl 0,9% hingga keruh seperti susu
2. Masukkan karbol Fuchsin ke dalam suspensi bakteri tadi sama banyak (1:1)
3. Homogenkan, panaskan dengan api kecil (70%) selama 6 menit jaga jangan sampai mendidih
4. Siapkan kaca benda yang telah bersih
5. Buat preparat dari suspense tadi rekatkan dan dinginkan
6. Celupkan kedalam bejana yang berisi larutan H2SO4 1% selama 2-3 detik
7. Cuci dengan air mengalir perlahan-lahan
8. Genangi dengan Metilen Blue selama 2-4 menit
9. Cuci dengan air mengalir perlahan-lahan, dan keringkan
10. Amati dengan Mikroskop pembesaran 10 x 100
Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
- Spora bakteri : Merah
- Badan bakteri asam : akan berwarna Biru
C.PEWARNAAN FLAGEL
o Flagel merupakan komponen tambahan dari sel yang menyerupai benang, terdiri dari protein
Flagelin
o Dikenal 4 jenis flagel :
Monotrikh, flagel tunggal pada salah satu ujung, missal : Vibrio sp.
Lofotrikh, terdapat 1/lebih flagel disalah satu ujung , Alcalingenes sp
Amfitrikh, terdapat 1/lebih flagel di kedua ujung, cth: Alcalingenes sp
Peritrikh, flagel terbesar diseluruh badan kuman, cth: Pruteus vulganis
Flagel merupakan organel sel yang tidak dapat dilihat dengan pewarnaan biasa. Ntuk itu pewarnaan
khusus atau dengan mikroskop electron. Salah satu pewarnaan yang digunakan untuk melihat flagel
adalah pewarnaan Gray serta beberapa pewarnaan lain diantaranya pewarnaan Novel, Zattnow, dan
Fontana-Tribondeau dengan menggunakan impregnasi Ag.
Pewarnaan Gray
Digunakan untuk pemantek / mordant untuk mneingkatkan afinitas flagel terhadap zat warna dan
memperbesar diameter flagel. Zat warna yang digunakan adalah Karbol Fuksin menjadi flagel dan
badan kuman berwarna merah.
Gerak Bakteri
Gerak bakteri dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara langsung dan secara biakan. Biakan yang
digunakan tidak mengandung gula karena adanya gula dapat meurunkan pH media sehingga gerak
bakteri akan terhambat. Biakan yang digunakan harus mempunyai konsisten setengah padat agar
bakteri dapat bergerak bebas. Biakan bakteri yang akan diperiksa harus lebih dari 20 jam dan perlu
diperhatikan bahwa suhu optimum untuk gerak bakteri dibawah 300 C.
Cara Pewarnaan:
1. Metode Tetes Tegak
a. Kaca benda dibersihkan agar terbebas dari lemak
b. Disiapkan gelas penutup dengan memberikan vaksin pada keempat sisinya
c. Letakkan suspense bakteri pada bagian tengah kaca benda jangan ditipiskan
d. Tutup suspense tersebut dengan kaca penutup
e. Amati dengan mikroskop pembesaran 10 X 100
2. Metode Tetes Gantung
a. Kaca benda cekung dibersihkan agar terbebas dari lemak
b. Disiapkan kaca penutup dengan memberikan vaselin pada keempat sisinya
c. Letakan suspensi kuman dibagian tengah kaca penutup, JANGAN DITIPISKAN
d. Peganglah kaca benda cekung dengan bagian cekung menghadap kebawah, kemudian dekatkan
kaca benda ini perlahan-lahan pada kaca penutup sedemikian rupa sehingga bagian cekung melingkupi
suspensi bakteri. Tekan perlahan-lahan agar vaselin menyebar
e. Dengan hati-hati namun cepat baliklah kaca benda tersebut, kemudian amati dengan mikroskop
pembesaran 10x kemudian 40x
Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
- Gerak Positif: Bila bakteri berpindah tempat dengan cepat
- Gerak Negatif: Bila bakteri bergerak ditempat saja akibat gerakan molekul air (Gerak Brown)
3.
a.
b.
c.
d.
(Sumber :
Tim Dosen Mikrobiologi Lingkungan Politeknik Kementerian Kesehatan Jakarta II jurusan Kesehatan
Lingkungan, Dra. Syarifah Miftahul El Jannah T . M. Biomed; Modul Praktikum Mikrobiologi Lingkungan,
Jakarta.)
Terampil melakukan pewarnaan gram untuk bakteri gram positif dan negatif.
Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dari hasil pengamatan dengan
pewarnaan gram.
dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang
membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative
tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di
bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
Bakteri garam (+)
Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel
Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi
4%)
Ketahanan
terhadap Lebih sensitif
Lebih tahan
penisilin
Penghambatan
oleh Lebih dihambat
Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi
Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana
kompleks
Ketahanaa terhadap
Lebih tahan
Kurang tahan
perlakuan fisik
(Manurung, 2010).
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson
dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue
Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen
untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat
warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras
4.
a.
b.
c.
d.
seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat
yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan
dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat
warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak
bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol
fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga
bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh
permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak
sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7
menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah
itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4
menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang.
Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit
lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).
Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur
khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh
pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium,
Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam
siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga
metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia
seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya
pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga
pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop
meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat
refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan
badan inklusi (Aditya, 2010)
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika
pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna
pada latar belakang yang berwana biru gelap.
Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan
cara memanaskan preparat.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi,
2010).
Alat :
Gelas Benda
2 Buah
Gelas Penutup
2 Buah
Pipet
4 Buah
Bunsen
1 Buah
Mikroskop
1 Buah
Tissue
Secukupnya
Bahan:
Bakteri Sampel A
1 Tetes
Bakteri Sampel B
1 Tetes
Alkohol 96%
2 Tetes
Air
Mengalir
Larutan Kristal Violet 2 Tetes
Safarin
1 Tetes
Larutan Iodin
2 Tetes
Nama
a.
b.
c.
a.
b.
c.
d.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna (Manurung, 2010).
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam
langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).
Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:
Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.
Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun,
formalin, fenol.
Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini
dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.
Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga
warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini
merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target.
Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat
asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna
ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya
tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau pewarna
ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang
berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda.
Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini
bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga
bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri
berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak
terkena nyala api.
Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya
hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna
primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian
iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram
positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1
menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya
hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau
melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna
dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna,
maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna
dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau
bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%
gram + : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel
terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)
gram - : lipid >> + alkohol 96%
pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel
terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci)
Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik kemudia
dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada
yang tersisa di dalam gelas benda.
Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya
diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit.
Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin merupakan
pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,
safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat
atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan
dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu
pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri
berlangsung cepat (efisiensi waktu).
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap
gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi
kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing
reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu
agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah
pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk
warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah
atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
Gambar skematik langkah kerja yang dilakukan oleh praktikan
(Pradhika, 2008)
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan
bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna
terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat
pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue,
safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -,
CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih
cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel (Rudi, 2010).
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram
positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam
praktikum ini digunakan salah satu pewarnanya yaitu safranin yang sesuai teori bersifat basa
sehingga lebih mudah bersenyawa atau bereaksi dengan bagian-bagian inti sel bakteri.
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010).
Hasil pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan bahwa bakteri sampel A memiliki
warna merah muda (gram negative), dan Bakteri sampel B memilki warna ungu (gram positif).
1. Escherichia coli
PEWARNAAN BAKTERI
Laporan Praktikum Mikrobiologi Air (BDI206)
Disusun Oleh
Widi Indra Kesuma
1114111058
UNIVERSITAS LAMPUNG
2012
HALAMAN PENGESAHAN
Nama Mahasiswa
No. Pokok Mhs
Program Studi
Fakultas
Judul Praktikum
Tempat
Waktu Praktikum
Kelompok
Npm.
Catatan
Nilai
diferensial yang mmilah bakteri menjadi dua yaitu kelompok gram positif dan gram negatif
(Lay W. Bibiana.1994).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan.
Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Zat warna yang digunakan daam pewarnaan bersifat basa atau asam. Pada zat yang
basa , bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai
muatan postif. Sebaliknya, pada zat warna asam, bagian yang memberikan zat
warna mempunyai muatan negatif. Zat warna yang basa lebih banyak digunakan karena
muatan negatif banyak ditemukan pada dinding sel, membrane sel sitoplasma sewaktu
proses pewarnaan. Muatan positif pada zat warna basa akan berikatan dengan muatan
negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme jeas terlihat (Lay W. Bibiana.1994).
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian
bakteri. Diharapkan dengan percobaan ini,mahasiswa mampu melakukan berbagai
pewarnaan bakteri sesuai dengan peruntukannya.
B. TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengabsobsi maupun
tidak mebiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme atau latar belakangnya. Zat warna yang mengabsorbsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan sekelilingnya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkimkan pengamatan struktur sel seperti spora, flagella dan
bahan inklusi yang mengandung zat pati dan granua fosfat. Pewarnan yang digunakan untuk
melihat alah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus, sedangkan pewarnaan yang
digunakan untuk memilah organisme disebut pewarnaan diferensial. Pewarnaan gram
merupakan contoh pewarnaan diferensial yang mmilah bakteri menjadi dua yaitu kelompok
gram positif dan gram negatif (Lay W. Bibiana.1994).
Berikut ini adalah contoh Bakteri yang dominan pada masing-masing media:
a. Air laut
1. Pseudomonas sp
Pseudomonas sp merupakan bakteri hidrokarbonoklastik yang mampu mendegradasi
berbagai jenis hidrokarbon. Keberhasilan penggunaan bakteri Pseudomonas dalam upaya
bioremediasi lingkungan akibat pencemaran hidrokarbon membutuhkan pemahaman tentang
mekanisme interaksi antara bakteri Pseudomonas sp dengan senyawa hidrokarbon.
namun masih sangat sedikit informasi yang diketahui tentang bakteri ini. E. tarda dikenal
dalam hal bakteri yang menyebabkan penyakit pada manusia dan ikan, keduanya yang
berpotensi bisa berakibat fatal jika tidak diobati. Sebagai patogen pada ikan, bakteri ini
penting untuk diketahui pada budidaya dan industri perikanan, peternakan ikan terutama
untuk
tujuan
komersial.
Beberapa
penelitian
mulai
fokus
menggunakan
metode proteomikdan
teknik
molekuler
untuk
menjelaskan
mekanisme
pathogenesis Edwardsiella tarda. Jenis analisis membantu kita lebih memahami patogenesis
suatu bakteri pada umumnya, serta memberikan wawasan baru untuk memerangi
penyakit (Anonim, 2011).
c. Air kolam
1. Myco bacterium
Mycobacterium tidak memiliki pigmen kecuali apabila ditumbuhkan paa media telur(egg
medium) yang dipertebal dan terkena sinar matahari akan menghasilkan koloni bewarna
kuning. Koloni berbentuk bulat, cembung di tengah dan rata pada bagian pinggirnya. Suhu
optimum pertumbuhannya adalah sekitar 25 35 C, tetapi masih dapat tumbuh dengan baik
pada suhu 18 -20 C. Bakteri ini tidak dapat tumbuh pada suhu di lebih dari 37 C.
Infeksi mycobacterium pada ikan mungkin saja menimbulkan atau tidak menimbulkan
munculnya
gejala-gejala
klinis
eksternal.
Ikan
yang
terserang
penyakit Histopatologijaringan yang terinfeksi Mycobacteriosis, B. Lesi granuloma pada
tuberculosis ini dapat menunjukan berbagai gejala-gejala klinis yang berbeda.
Pada umumnya ikan yang terinfeksi akan cenderung memisahkan diri dari kelompok
besamya dan berada di sudut-sudut tempat penampungan atau kolam, bersembunyi, dan
berada dalam air dengan posisi kepala di bawah. Ikan juga akan kehilangan nafsu makan
dan menjadi kurus. Pada beberapa jenis ikan ditemukan ulser-ulser pada jaringan otot
tepat di bawah kulit yang terinfeksi, kelainan pigmen dan tulang belakang, atau
terhambat pertumbuhannya. Selain itu, ikan yang terinfeksi mengalamieksopthalmus
unilateral atau bilateral (Anonim, 2011).
2. Aeromonas salmonicida
Aeromonas
salmonicida merupakan
bakteri
gram
negatif, Bakteri gramnegatif adalahbakteri yang
tidak
mempertahankan zat
warna metil
ungu pada
metode pewarnaan Gram. A.Salmonicida berbentuk batang pendek ( 1,3-2,0 x 0,8-1,3 m ),
non motil atau tidak bergerak, tidak membentuk spora, fakultatif anaerob, resisten terhadap
0/129, pertumbuhan optimum pada suhu 22C, G+C ratio 57-63%, memproduksi brown
pigmen yang diffusible (untuk strain typical). Koloni bakteri ini berwarna putih, kecil, bulat,
dan cembung. Strain typical dapat menghasilkan pigmen coklat yang akan lebih kelihatan
apabila medium ditambah dengan tyrosine atau phenylalanine. Pada media dengan
kandungan asam amino tinggi pigmen coklat akan jelas kelihatan pada umur kultur 48
jam. Secara biokimia bakteri ini mempunyai sifat-sifat : oksidase positif dan memfermentasi
glukosa (Anonim, 2011).
d. Air kolam ikan lele
1. Streptococcus agalactiae
Bakteri Streptococcus agalactiae (Strain difficilis)merupakan salah satu jenis bakteri
patogen pada ikan. Infeksi Streptococcus spp. pada ikan mengakibatkan
penyakit yang disebut syndrome meningoencephalitis dan panophthalmitis dengan gejala
umum seperti: lemah, warna gelap, hilang nafsu makan, disorientasi Daenuri dan Sinaga
PatogenesitasStreptococcus agalactiae dan Streptococcus iniae pada Ikan Nila 590 atau
hilang keseimbangan, uni/bilateral exophthalmia dengan kornea mata berwarna pucat,
pendarahan pada bagian eksternal serta luka. Organ internal menunjukkan gejala
adanya ascites, pembengkakan limpa, ginjal, hati dan organ dalam lainnya (Yanong and
Floyd, 2002). Selanjutnya dikatakan bahwa pada budidaya ikan nila, infeksi jenis bakteri
tersebut dapat bersifat akut yang mengakibatkan kematian massal (> 50%) dalam tempo 3-7
hari, atau kematian berpola kronik yang persisten selama beberapa minggu. Austin and
Austin (2007) menyatakan bahwa jenis-jenis ikan yang telah diketahui rentan terhadap
penyakit tersebut antara lain ikan nila (Oreochromis niloticus), mas (Cyprinus carpio),
rainbow trout (Salmo gairdneri), dan silver pomfret (Pampus argenteus) (Anonim, 2011).
2. Salmonella
Salmonella adalah penyebab utama dari penyakit yang disebarkan melalui makanan
(foodborne diseases). Pada umumnya, serotipe Salmonella menyebabkan penyakit pada
organ
pencernaan. Salmonella adalah
suatu genus bakterienterobakteria gramnegatif berbentuk
tongkat
yang
menyebabkan tifus, paratifus,
dan penyakit foodborne. Spesies-spesies Salmonella dapat
bergerak
bebas
dan
menghasilkanhidrogen sulfida.
Ikan laut yang terserang bakteri Salmonella biasanya berlendir, nafsu makan turun, terdapat
bercak-bercak pada tubuhnya, biasanya berwarna merah.
Apabila ikan yang tercemar salmonella dikonsumsi akan mengakibatkan diare, keram perut,
dan demam dalam waktu 8-72 jam setelah memakan makanan yang terkontaminasi oleh
Salmonella. Gejala lainnya adalah demam, sakit kepala, mual dan muntah-muntah (Anonim,
2011).
e. Air sumur
1. Shigella
Shigella merupakan bakteri gram negatif, bersifat fakultatif anaerob tapi paling baik tumbuh
secara aerob. OrganismeShigella adalah batang pendek, koloninya koveks, bulat transparan,
tidak membentuk spora. Pertumbuhan optimum terjadi pada suhu 37oC dalam keadaan
aerobik. Shigellatermasuk bakteri patogen di usus manusia dan primata penyebab shigella
(disentri basher). Tanda-tanda ikan yang terkenal bakteri Shigella biasanya tidak terlihat,
namun dapat dilihat dari gerakan ikan yang kurang lincah, sisik ikan terlepas dan pengapuran
pada bagian mata.
Mengkonsumsi ikan laut yang tercemar bakteri tersebut akan mengakibatkan gejala muntah,
nyeri usus dan keram. Pada kasus yang lebih parah kotoran mengandung darah dan lendir
(disenteri) sebagai akibat adanya ulserasi pada mukosa usus. Gejalanya mulai 1-3 hari
setelah terinfeksi dan kejadian penyakit ini biasanya berlangsung 4-7 hari, tetapi ada kalanya
dapat berlangsung lebih lama. Setelah masa inkubasi yang pendek (1-2 hari), ada serangan
tiba-tiba berupa sakit perut, demam dan diare cair (Anonim, 2011).
2. Clostridium botulinum
Clostridium botulinum merupakan bakteri berbentuk batang, anaerobik (tidak dapat
tumbuh di lingkungan yang mengandung oksigen bebas), Gram-positif, dapat
membentuk spora, dan dapat memproduksi racun syaraf yang kuat. Sporanya tahan
panas dan dapat bertahan hidup dalam makanan dengan pemrosesan yang kurang
sesuai atau tidak benar. Ada tujuh tipe botulisme (A, B, C, D, E, F dan G) yang dikenal,
berdasarkan ciri khas antigen dari racun yang diproduksi oleh setiap strain. Tipe A, B, E,
dan F dapat menyebabkan botulisme pada manusia. Tipe C dan D menyebabkan
sebagian besar botulisme pada hewan. Hewan yang paling sering terinfeksi adalah
unggas liar dan unggas ternak, sapi, kuda, dan beberapa jenis ikan. Walaupun tipe G
telah diisolasi dari tanah di Argentina, belum ada kasus yang diketahui disebabkan oleh
strain ini(Anonim, 2011).
f. Air aquarium
1. Renibacterium salmoninarum
Renibacterium salmoninarum yang dikenal sebagai penyebab kidney disease adalah
bakteri yang berbentuk batang pendek dengan ukuran 0,3-1,5 x 0, 1-1,0 m, bersifat gram
positif, tidak bergerak, tanpa kapsul, sering terdapat berpasangan dan bersifat aerob. Bakteri
ini dapat dijumpai di lingkungan air tawar maupun air laut dengan suhu optimal
pertumbuhannya antara 15-18oC, sedangkan pada suhu 25oC perturnbuhannya akan
terhambat (Anonim, 2011).
2. Nocardia sp.
Nocardia sp. adalah bakteri yang bentuknya bervariasi yaitu bulat, oval dan batang
berfilamen, dengan ukuran diameter 0,5-1,2 m, bersifat gram positif, bergerak, tidak
membentuk kapsul dan bersifat aerob. Bakteri ini tersebar di alam termasuk di air dan tanah.
Suhu optimal bagi pertumbuhan Nocardia asteroides antara 28-35oC, sedangkan N.
kampachi tidak tumbuh pada suhu 10oC atau 37oC (Anonim, 2011).
g. Air PDAM
1. Pasteurella piscicida
Pasteurella piscicida berbentuk batang pendek, berukuran 0,6-1,2 x 0,8-2,6 m, bersifat gram
negatif, tidak bergerak, tidak membuat kapsul maupun spora dan bersifat fakultatif anaerob.
Bakteri ini dapat hidup di lingkungan air laut dengan kisaran suhu untuk pertumbuhannya 1039oC. Umumnya yang diisolasi dari ikan dapat tumbuh baik pada suhu 25oC. (Anonim, 2011).
2. Listeria monocytogenes
komposisi
2. Ambil biakan bakteri dari biakan yang telah dibuat sebanyak 1 ose, lalu oleskan bakteri di
aquades secara merata dan setipis mungkin. Saat mengambil biakan harus dilakukan di
dekat bunsen yang menyala.
3. Jepit kaca preparat dengan penjepit tabung reaksi, lalu fiksasi di atas api sampai preparat
kering.
4. Beri larutan biru metilen 1% selama 30 detik.
5. Cuci/siram dengan aquades, keringkan secara hati-hati dengan kertas saring.
6. Amati di bawah mikroskop.
b. Pewarnaan Gram
1. Buat preparat ulas dengan cara member setetes aquades yang telah steril ke atas kaca
preparat.
2. Ambil biakan bakteri dari biakan yang telah dibuat sebanyak 1 ose, lalu oleskan bakteri di
aquades secara merata dan setipis mungkin. Saat mengambil biakan harus dilakukan di
dekat bunsen yang menyala.
3. Jepit kaca preparat dengan penjepit tabung reaksi, lalu fiksasi di atas api sampai preparat
kering.
4. Beri larutan Kristal violet selama 30 detik.
5. Cuci/siram dengan aquades, selama 5 detik.
6. Beri larutan lugol selama 1 menit.
7. Cuci dengan aquades selama 5 detik.
8. Beri larutan pemucat selama 10-20 detik. Lakukan setetes demi setetes sampai kristal violet
hilang dari preparat. Perhatikan waktu, pemucatan yang terlalu lama akan menyebabkan hasil
pewarnaan yang menyimpang.
9. Cuci dengan aquades selama 5 detik.
10. Beri larutan safranin selama 15 detik.
11. Cuci dengan aquades selama 5 detik, kemidian keringkan dengan kertas saring.
12. Perhatikan warna akhir yang terbentuk. Organisme gram positif akan berwarna ungu atau
biru, sedangkan organisme gram negatif akan berwarna merah muda atau merah.
13. Amati di bawah mikroskop dengan penambahan minyak imersi..
D. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengamatan
Nama Sampel
Pewarnaan
Air Laut
Sederhana
Gambar
Keterangan
Gram
Air PDAM
Sederhana
Gram
Bakteri
Streptrococcus
Sederhana
Gram
Air
Sederhana
Gram
Air Tambak
Sederhana
Gram
Air
Sederhana
Gram
Air
Sederhana
Gram
Pembahasan
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari
pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985):
1.
Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
2.
Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3.
Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4.
Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia
yang ada akan dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan
memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk
ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau
dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang
bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10
yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit
terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna
ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga
kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat
asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna
disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian
yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat
warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite
Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia
ini berfungsi untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakteri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan
bakteri (Sutedjo , 1991).
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk
mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan
Gram meliputi crystal violet , yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat
warna tersebut adalah :
1. Crystal Violet
Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam , dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan
akan terlihat berwarna (Ungu).
2. Yodium
Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang
diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan Gram dimaksudkan
untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
3. Alkohol
Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada
sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan :
1. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu
2. Bakteri menjadi tidak berwarna
4. Safranin
Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan
alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non target
(Wahyuningsih , 2008).
Berikut ini adalah macam - macam pewarnaan bakteri untuk melihat atau mengidentifikasi
bakteri secara mikroskopis. Sebenarnya yang sering digunakan adalah pengecatan gram
namun tidak ada salahnya jika mempelajari pewarnan lainnya agar lebih spesifik jika ingin
meng indentifikasi bakteri semoga bermanfaat.
1.Pewarnaan Negatif
Tujuan : Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi
organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna pewarna sederhana.
Prinsip : Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna
asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam
sel karena negative charge pada permukaan bakteri.oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah
dilihat dengan latar belakang berwarna.
2.Pewarnaan Sederhana
Tujuan : Mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi kontras antara sel dan
sekelilingnya dan mengamati ciri ciri bakteri.
Prinsip : Pada pewarnaan sederhana,bakteri diwarnai oleh reagen tunggal.pewarna dasar
dengan kromogen muatan positif disarankan,selama asam nukleat bakteri dan komponen
dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan mengikat kation
kromogenPerlu diperhatikan lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarna yang
digunakan.Untuk karbol fuchsin membutuhkan 15-30 detik,Kristal violet 2-60 detik,dan
Methilen Blue 1-2 menit
3.Pewarnaan Gram
Tujuan : Mempelajari prosedur pewarnaan Gram,memahami pentingnya setiap langkah dalam
prosedur tsb,dan secara umum memahami reaksi reaksi kimiawi yang terlibat di dalam
proses tersebut.
Prinsip : Bakteri dengan pewrna utama (Primary stain) yaitu dengan kristal violet atau
Gentian violet akan berwarna ungu,melalui fiksasi warna dengan lugol akan menguatkan
pelekatan warna utama,penambahan alcohol akan melunturkan atau memucatkan zat warna
utama sehingga pada sel Gram negatif sel menjadi tidak berwarna tetapi pada sel Gram
positif tidak mengalami pelunturan sehingga tetap berwarna ungu.pada pemberian pewarna
tandingan (counterstain) yang berbeda dengan pewarna utama yaitu safranin menyebabkan
bakteri gram negatif akan menyerap warna tsb menjadi merah.
4.Pewarnaan Tahan asam
Tujuan : Mempelajari dasar dasar kimiawi pada reaksi tahan asam dan kinerja prosedur
pewarnaan tahan asam untuk membedakan bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Prinsip : Pemanasan akan membantu penyerapan zat warna utama (karbol fuchsin) melalui
pemberian larutan pemucat (asam alkohol) bakteri tahan asam tetap berwarna merah
sedangkan pada bakteri tidak tahan asam zat warna utama akan luntur sehingga pada
penambahan warna kedua (Methylen blue) bakteri akan menyerap zat warna tersebut (biru).
5. Pewarnaan Spora
Tujuan : Mengenal dasar dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur
untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetatif.
Prinsip : Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga zat warna utama
dapat masuk masuk ke dalam spora sehingga berwarna hijau.melalui pendinginan warna
utama akan terperangkap di dalam spora,dengan pencucian zat warna utama yang ada pada
sel vegetatif akan terlepas sehingga pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan
berwarna merah (Kurniawan, 2010)
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam
pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994). Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu
gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan
membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang
berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008).
Jika teknik pewarnaan tepat, Gram positif bakteri akan tampak ungu dan Gram negatif bakteri
akan merah muda. Jika spesies gram terlalu pucat untuk dilihat maka disesuaikan dengan
diafragma, kemudian dapat melakukan pewarnaan kedua tetapi berhenti setelah dicuci
dengan airiodine. Pada bakteri gram warna ungu lebih mudah untuk mengamati. Untuk
motilitas pengamatan segar akan menghasilkan jumlah bakteri yang sama dalam setetes air
bawah coverslip (tidak panas, tidak ada noda) (Koning, 1994).
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 2448 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan
gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan
lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak
lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif
(Lay,1994)
Kristal violet dipakai sebagai zat warna primer dikarenakan Kristal violet mampu melekatkan
bakteri pada kaca mencegah autolisis pada sel, membuat sel-sel lebih kuat atau
keras, mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, mempertinggi sifat reaktif
gugusan-gugusan, membunuh bakteri secara cepat dengan tidak mengubah bentuk dan
strukturnya, dan mengubah afinitas cat.
E.
1.
2.
3.
1.
2.
Kendala yang sering dihadapi dalam proses pewarnaan biasanya adalah kesalahan praktikan
dalam membuat pewarnaan sehingga hasil pewarnaan terlalau tebal dan sulit diamati.
KESIMPULAN DAN SARAN
Adapun kesimpulan yang dapat diberikan adalah sebagai berikut:
Pewarnaan bertujuan agar bakteri dapat terlihat oleh mikroskop, karena pada dasrnya bakteri
tidak memiliki zat warna.
Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif
berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan
terjadi pada dinding selnya
Adapun saran yang dapat diberikan adalah sebagai berikut :
Upayakan terlebuh dahulu kebersihan dan sterilisasi parktikan sebelum melakaukan
praktikum agar tidak terjadi kontaminasi
Fasilitas yang ada di laboratorium mohon di tambah untuk menunjang pelaksanaan
praktikum.
3. Lebih efektif lagi antar asisten dan praktikan dalam melakukan praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.
Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com.Diakses pada 21
Oktober 2012
Kurniawan.
2010. http://kurniawan-sodikin.blogspot.co.id/macam-macam-strainng-pewarnaanbakteri/2010/html.
Lay w. Bibiana.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.PT RajaGrafindo Persada:Jakarta.
Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta.
Sugiharto,
Bowo.
2008. Menggagas
Penerapan
Bioteknologi
Berbasis
Mikroba.
(online)http//www.google.com. diakses 21 Oktober 2012.
Suwandi, Usman. 2003. Peran Media untuk Identifikasi Mikroba Patogen.
http//www.google.com. diakses 21 Oktober 2012.
Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.
(online)