RESOLUCIN
Por otro lado, la discusin sobre el ensanchamiento de banda del tema 2 es aplicable a
la cromatografia de lquidos. A continuacin se ilustra el importante efecto del tamao
de partcula del relleno y se describen otras dos causas del ensanchamiento de zona,
que a veces son de notable
importancia en cromatografia de
lquidos,
Efectos
del
tamao
de
partcula del relleno. El
coeficiente de transferencia de
masa de la fase mvil es
funcin inversa del cuadrado
del dimetro de las partculas
que constituyen el relleno.
Como consecuencia de ello, la
eficacia de una columna de
HPLC
debera
mejorar
espectacularmente
cuando
disminuye
el
tamao
de
partcula. Por ejemplo una
reduccin del tamao de
partcula de 45 a 6 m origina
una disminucin de diez o ms
veces de la altura de plato.
Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografa de lquidos. En
cromatografia de lquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo
fuera del relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de
banda extracolumna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a travs de tubos como
los que se utilizan en los sistemas de inyeccin, en los detectores y en los tubos que
conectan los distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de la diferente velocidad de flujo que hay entre las capas de lquido adyacentes a las paredes del
tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se
mueve con ms rapidez que la periferia. En cromatografia de gases la difusin
compensa la dispersin extracolumna. Sin embargo, la difusin en los lquidos es significativamente menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace
evidente.
Cuando se utilizan columnas de pequeo dimetro, el ensanchamiento extracolumna
puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de
orientarse a la reduccin del radio de los tubos del sistema externos a la columna.
Efecto del tamao de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de muestra
(g de muestra/g de relleno) tambin afecta a la eficacia de la columna. Para las
aplicaciones con columnas de reparto y adsorcin, la eficacia decrece notablemente
con la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia
es mucho mas pequeo.
Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina una
elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se aumenta
notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces ms)
disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la elucin, se
vara la relacin de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a
veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC
a menudo estn equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes
desde dos o ms recipientes en una cmara de mezcla a una velocidad que vara
continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o
exponencialmente con el tiempo.
Sistemas de bombeo
Tipos de bombas
Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas:
bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o
de presin constante.
Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los sistemas de
HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una pequea cmara en la que el
disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor.
Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo
del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas recprocas tienen la
desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar
dado que su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base en el cromatograma.
Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno
(35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm2), su fcil
adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son
prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del
disolvente.
Amortiguadores de pulsos
Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de flujo. Un
mtodo sencillo de amortiguacin contiene un fuelle flexible o un gas compresible en la
porcin superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energa de pulsacin.
Cuando la bomba se rellena esta energa se libera para ayudar a suavizar la pulsacin
de presin. Los amortiguadores electrnicos de pulsos proporcionan una carrera
hacia delante corta y rpida del pistn, y enseguida la carrera rpida de recarga de la
bomba. El pequeo impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando disolvente a
la presin del sistema.
Control del caudal y sistemas de programacin
Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se
equipan con dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudal
mediante la determinacin de la cada de presin a travs de un restrictor colocado en la
salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la seal y un valor preestablecido se
utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba.
Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicin del
disolvente bien sea de una forma continua o bien de forma escalonada.
Sistemas de inyeccin de muestra
A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de lquidos
es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema
se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las
columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy pequeos, de unas
pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se ha de poder introducir la
muestra sin despresurizar el sistema.
En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la
introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la
Estos dispositivos estn normalmente integrados en el equipo cromatogrfico y
6
Termostatos
En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las
columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se
controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se
obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan
actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las
dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C. Para poder controlar con
precisin la temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua
que provenga de un bao a temperatura constante.
Tipos de rellenos de la columna
En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos, pelicular y de
partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polmero, no porosas y
esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40 m. En la superficie de
estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o de una resina de
intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional,
constituido por una fase estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Las bolas
tambin se pueden tratar qumicamente para obtener una capa superficial orgnica. Por lo
general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las
columnas analticas.
Los tpicos rellenos de partculas porosas de cromatografa de lquidos estn formados por
micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible
para un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina o resinas de
intercambio inico, aunque la slice es el material ms comn. Las partculas de slice se
sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores al micrn en unas
condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros muy unifor- mes. Las
partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas orgnicas, que se unen
qumica o fsicamente a la superficie.
Detectores
Detectores de absorbancia
La figura muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la medida de la
absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de minimizar el
ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor
posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 L y las
longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est
restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.
Espectros de
absorcin del
efluente de una
columna de HPLC
10
11
12
Cromatografa de reparto
14
16
17
18
Cromatografa de adsorcin
19
21
Cromatografa inica
La cromatografa inica est relacionada con los mtodos modernos y eficaces para la
separacin y determinacin de iones que se basan en el uso de las resinas de
intercambio inico. La cromatografa inica empez a desarrollarse a mediados de los
aos setenta, cuando se demostr que mediante las columnas de HPLC rellenas con
resinas de intercambio catinico o aninico, se podan resolver fcilmente mezclas de
cationes o aniones. Por entonces, la deteccin se realizaba por lo general con
medidas de conductividad.
un grupo con la misma carga, se dan diferencias relacionadas con el tamao del ion
hidratado y con otras propiedades. De este modo, para una resina tpica de intercambio
catinico con grupos sulfnicos, los valores de Kex, disminuyen segn el orden Tl+ >
+
+
+
+
+
+
+
+
Ag > Cs > Rb > K > NH4 > Na > H > Li . Para los cationes divalentes, el
orden es Ba2+ > Pb2+ > Sr 2+ > Ca 2+ > Ni2+ > Cd 2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn 2+
2+
2+
>Mg >U02 .
Para los aniones, Kex, en las resinas de base fuerte disminuye en el orden SO42- >
2C2O4 > I > NO3 > Br > Cl > HCO2 > CH3CO2 > OH > F . Esta secuencia
debera considerarse slo como una aproximacin, pues depende en parte de la resina y
de las condiciones experimentales.
En este caso, el cido carbnico muy poco disociado que se forma no contribuye de
manera significativa a la conductividad.
Un inconveniente de las columnas supresoras es la necesidad de regenerarlas
peridicamente (de ordinario, cada 8 o 10 h) a fin de convertir sus rellenos otra vez a la
forma cida o bsica original. Sin embargo, recientemente se dispone de supresores de
membrana que operan continuamente. En este caso, el eluyente y la disolucin
supresora fluyen en direcciones opuestas en ambos lados de unas membranas
permeables de intercambio inico. Para el anlisis de aniones, las membranas
son resinas intercambiadoras de cationes y para cationes, son intercambiadoras de
aniones. Cuando, por ejemplo, se trata de eliminar los iones sodio del efluente de la
columna analtica, en la corriente supresora fluye continuamente cido para la
regeneracin. Los iones sodio del efluente se intercambian con los iones hidrgeno de la
membrana y entonces migran a travs de la membrana hasta intercambiarse con los
iones hidrgeno del reactivo regenerador. El dispositivo tiene una velocidad de
intercambio notablemente alta; por ejemplo, es capaz de eliminar completamente los
iones sodio de una disolucin 0.1 M de hidrxido de sodio cuando el caudal del eluyente
es de 2 mL/min.
24
muestra dos aplicaciones de la cromatografia inica que utilizan una columna supresora
y deteccin conductimtrica. En cada caso, los iones estn presentes al nivel de partes
por milln, y el tamao de las muestras es de 50 L en un caso y de 100 L en el
otro. El mtodo es de gran importancia para el anlisis de aniones debido a que
actualmente no existe un mtodo tan rpido y adecuado para muestras de este tipo.
Cromatografa inica con una sola columna. Tambin se dispone de equipos
comerciales para cromatografia inica en los que no se utiliza una columna supresora.
Estos sistemas se basan en las pequeas diferencias de conductividad que existe
entre los iones de la muestra eluidos y los del eluyente que prevalecen. Para amplificar
esas diferencias, se utilizan intercambiadores de baja capacidad, con los que es posible
la elucin utilizando especies de baja conductividad equivalente. La cromatografa
con una sola columna tiende a ser algo menos sensible que la cromatografa inica con
columna supresora.
25
Separacin de
aminocidos con
una columna de
intercambio ionico.
Relleno:
intercambiador
catinico con un
tamao de partcula
de 8m.
27
Aplicaciones de la
cromatografa
de
exclusin
por
tamaos.
(a) Separacin de
cidos grasos.
Columna
de
poliestireno 7.5 x
600 mm con un
lmite de exclusin
de 1000. Fase mvil
tetrahidrofurano.
Caudal 1.2 mL/min. Detector: ndice de refraccin. (b) Anlisis de una resina epoxi
comercial (n= nmero de unidades monomricas en el polmero). Columna de slice
porosa 6.2 x 250 mm. Fase mvil tetrahidrofurano. Caudal
1.3 mL/min
Determinacin de
glucosa (G), fructosa
(F) y sacarosa (S)
en zumos enlatados
29
INDICE
1.
2.
- Columnas analticas
- Precolumnas
- Termostatos
- Tipos de rellenos de la columna
Detectores...pag 8
- Detectores de absorbancia
- Detectores de fluorescencia
- Detectores de ndice de refraccin
- Detector de dispersin de luz
- Detectores electroqumicos
Cromatografa de reparto..pag12
-
Columnas para
qumicamente
cromatografa
con
fases
unidas
Cromatografa de adsorcin.pag18
-
Cromatografa inicapag21
-
Rellenos de columna
31