Anda di halaman 1dari 18

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia
karena kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk
memperoleh materi murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu
pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan
campuran .
Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara
berkermbang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang
semakin marak di bidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan
di bidang Biologi Molekuler. Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini
telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode elektroforesis ditemukan dan
dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi
(Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya metode elektroforesis ini
mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian yang
menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekulmolekul yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet,
Quincke, Hardy. dalam Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988)
elektroforesis berasal dari bahasa Junani yangmempunyai arti transport atau
perpindahan melalui partikel-partikel listrik.
Penggunaan data khemotaksonomi pada level protein diketahui dapat
digunakan untuk identifikasi organisme pada level spesies dan khususnya untuk
subtypingbakteri dalam spesies yang sama berdasarkan analisis perbandingan
profil protein dan polipeptida (Towner & Cockayne, 1995). Profil protein
mikrobia diperoleh dengan melarutkan komponen sel mikrobia, baik yang
diperoleh dari sel utuh ataupun dari fraksi subselular, dan kemudian dilakukan

pemisahan secara elektroforesis dalam suatu matriks gel seperti poliakrilamid atau
pati. Tergantung pada tipe sistem elektroforesis yang digunakan, protein
dipisahkan berdasarkan sifat-sifat fisikokimiawinya yang meliputi ukuran,
muatan, dan titik isoelektriknya. Protein

yang telah dipisahkan, atau subunit

komponen protein, kemudian dapat dideteksi dengan teknik pewarnaan untuk


menghasilkan profil protein.
Salah satu teknik yang sering digunakan untuk analisis protein adalah
SDS-PAGE (Sodium Dodecylsulphate polyacrilamid Gel Electrophoresis). Pola
pita protein sel mikrobia pada PolyAcrilamid GelEelectrophoresis(PAGE) bersifat
spesifik dan reprodusibel. Protein didenaturasi dengan menggunakan panas atau
deterjen, dan untuk menghasilkan subunit polipeptida yang kemudian dapat
dipisahkan dalam elektroforesis berdasarkan berat molekulnya. Agar diperoleh
hasil yang maksimal, maka kultur bakteri yang akan dianalisis ditumbuhkan
terlebih dahulu dalam medium kaya dan dilakukan pemanenan sel pada akhir fase
eksponensial atau awal fase stasioner.
Metode SDS-PAGE telah dibuktikan mampu membedakan sejumlah besar
strain bakteri karena memiliki tingkat resolusi diskriminatif sampai level spesies
dan subspesies atau antar strain dalam satu spesies. Metode ini juga terbukti
memiliki kesesuaian dengan metode hibridisasi DNA-DNA. Nilai similaritas yang
diperoleh dari SDS-PAGE cenderung sama dengan nilai similaritas hasil
hibridisasi DNA sebesar 70 % (Towne & Cockayne, 1995; Vandamme et al.,
1996).
B. Tujuan
a. Memahami konsep teknik elektroforesis khususnya SDS-PAGE dan
memiliki kompetensi melakukannya
b. Mengidentifikasi suatu protein berdasarkan berat molekulnya

C. Prinsip

Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis.


Dalam kes ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik
pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan
amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam
kecerunan dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6).

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Elektroforesis
Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan
mobilitas analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode
elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan
variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat.
pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif. keuntungan
utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi
dari pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul
besar.(Andreas Manz, et.al, 2010)
Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau
molekul dalam medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik
diterapkan. media konduktif biasanya buffer berair, juga disebut sebagai
elektrolit atau run penyangga. campuran analit dimasukkan ke dalam
medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik
diterapkan. Dalam contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran
analit mengandung molekul bermuatan negatif. berdasarkan atas
permohonan dari medan listrik, anion mulai bergerak menuju elektroda
positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan mobilitas

yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang


berbeda. sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam
medan listrik diterapkan.(Andreas Manz, et.al, 2010)

Gambar. 2.1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al,


2010)
Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam
larutan

yang mengandung matriks

non-konduktif

seperti

agarosa

atau

poliakrilamid gel. gratis pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit


digunakan. pemisahan ion analit terjadi karena perbedaan dalam mobilitas,
perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit hanya dapat dipisahkan
jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran. pemisahan analit
dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel
memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang
lebih kecil. ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya
dua rasio ukuran yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam
ukuran. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Jenis- Jenis Elektroforesis


Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase
diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan
dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang

lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang


dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas
sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas
tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas
zat terlarut.
Elektroforesis Gel (GE)
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi
molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam
matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun
dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul
sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR,
kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode
karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang
(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk
memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau
oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,
dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang
memungkinkan

pertautan

silang

(cross-linker),

menghasilkan

jaringan

poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam


nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang
digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur


(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel
ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,
arah pergerakan adalah menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif
alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju
perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk
menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi
dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining)
agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak,
atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk
keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya
setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet.
Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut
dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak
setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari
"sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis
mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis
dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul
tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan
campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk
menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis
marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur
marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan
ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma
ukuran molekul.

DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel


agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan
elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus
diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.
DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di
medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif.
Pergerakan kecepatannya tergantung dari :
a.

Ukuran molekul DNA

b.

Kerapatan media gel yang dilalui DNA

c.

Arus listrik yang diberikan

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan


penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :
1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari
sumur
2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam
sumur.
3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen
DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda
ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.
Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai
berikut.
a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda,
mengetahui susunan sekuens berbagai genom
b. DNA Fingerprinting
c. Mendeteksi kelainan genetik.
d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan
tertentu
e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel
organisme atau percobaan perlakuan gen

f. Mempelajari evolusi tingkat molecular


g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam
h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan
protein tertentu.
i. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
j. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan
DNA plasmid
k. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR
Dalam elektroforesis gel, pemisahan terjadi dalam media hidrogel elektrik
non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid (PA) yang berisi, buffer
elektrolit. pori-pori fungsi gel molekuler saringan, yang menghambat molekul
bermigrasi menurut ukuran mereka. Selanjutnya, gel bertindak sebagai media
pendukung anticonvective, yang dapat meminimalkan difusi dari molekul sampel,
dan dengan demikian mengurangi pelebaran pita. karenanya, nomor plat tinggi
dan resolusi tinggi dapat dicapai, terutama untuk molekul berat molekul tinggi
seperti DNA atau protein.a jumlah yang sangat besar senyawa karenanya dapat
dipisahkan dalam bentuk tunggal .. sebagai EOF ditekan dalam elctroporesis gel,
hanya analit dengan muatan bersih dapat dipisahkan. senyawa netral tidak
bermigrasi melalui gel bawah pengaruh medan listrik diterapkan. elektroforesis
gel adalah agak lambat dan tenaga kerja - metode intensif, yang tidak mudah
otomatis.
B. SDS-PAGE
SDS-PAGE merupakan suatu teknik elektroforesis yang menggunakan
polyacrylamide sebagai bahan pemisah. SDS-PAGE banyak digunakan dalam
praktikum biologi molekuler, genetik, biokimia, dan biomedik. SDS-PAGE
biasanya

digunakan

untuk

memisahkan

protein

berdasarkan

sifat

electrophoretic mobility (pemisahan komponen atau molekul bermuatan


berdasarkan perbedaan tingkat migrasi dan berat molekulnya (BM) dalam
sebuah medan listrik). Protein yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat

dikarakterisasi berdasarkan berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton


(kDa). Satu dalton sama dengan satu hidrogen molekul
SDS-PAGE merupakan teknik purifikasi skala kecil yang menghasilkan
pemisahan suatu protein berdasarkan berat molekulnya dalam band (pita)
spesifik yang tampak pada gel polyacrylamide. Teknik purifikasi dalam skala
besar kita dapatkan degnan menggunakan chromatography.
Gel acrylamide alam SDS-PAGE diletakkan diantara dua plat kaca. Ada dua
macam gel yang digunakan, yaitu main atai separating gel dan stacking gel.
Main gel merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak
dibagian bawah alat. Main gel berfungsi untuk memisahkan protein
berdasarkan berat molekulnya. Stacking gel terletak pada bagian atas,
digunakan untuk mencetak sumuran (sekat pemisah untuk penempatan
sempel). Protein tertarik ke bagian bawah oleh arus listrik. Protein yang
memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai
bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling
besar akan berada pada bagian atas dari gel. Protein marker digunakan sebagai
standart untuk menentukan berat molekul dari sampel.
Sejumlah mode pemisahan yang mungkin. Dalam gel native elektroforesis
dibebankan analit dibedakan menurut mobilitas jelas mereka, dan ukuran. natrium
dedocylsulfate-poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) analit diperlakukan
sedemikian rupa sehingga mereka semua menunjukkan muatan yang sama untuk
sixe rasio. maka mereka hanya dipisahkan oleh perbedaan ukuran mereka.

Gambar 2.3 Elektroforesis Gel (GE)


Gel Media
Elektroforesis Gel poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang
umum digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu :
mudah atau cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul
biologic, biaya pemisahan yang sangat besar.
Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat
dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary
electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik
elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul
ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi
dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari
molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis
daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa
dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose
poliasetat. Adapaun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah
disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan
vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena
mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat

sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan
pemisahan yang lebih baik.
Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida
dan menganalisis pemanjangan primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151).

Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa


yang dapat diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa
dilarutkan dalam buffer yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan
dituangkan ke dalam tangki elektroforesis. pada pendinginan gelasi terjadi. poripori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm konsentrasi 1% (10 mg mL-1)
sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1). pori-pori besar hanya
terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam nukleat. untuk
sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive.
Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen
cross-linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih.
ukuran pori dan sifat pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada
konsentrasi total serta tingkat silang C%
Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor
sebagaberikut:
1. Ukuran molekul DNA.
Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak
yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.
2.

Konsentrasi gel.

Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul


DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA
berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah
mempermudah molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.
3. Bentuk Molekul
Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat
melewati gel.
4. Densitas muatan
Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan
molekul dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan
per unit volume molekul.
5. Pori-pori gel.
Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati
gel, sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh
molekul DNA.
6. Voltase.
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal
tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.
7. Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik
sehingga migrasi DNA akan lebih cepat.
Aliran Elektroforentik.
Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan,
kation akan bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan
bergerak menuju anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak
akan bergerak. Aliran ion-ion menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut
aliran elektroforetik yang diperlihatkan dalam gambar 2. Aliran elektroforetik
inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam elektroforesa klasik (Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar

2.4.

pengaruh

medan

listrik

terhadap

ion-ion

(aliran

elektroforetik) (sumber: L. Thompson, et.al (1997))


Aliran elektroosmotik.
Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan
media kertas atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan
buffer dipakai sebagai pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut
berkontak dengan larutan dalam air maka permukaan gelas akan dilapisi anion
(SiO-) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika dengan air sehingga permukaan
pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-kation yang berasal dari
buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan kedua pada
permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan
diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan
pipa kapiler tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan
kation yang cepat ke katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran
elektroosmotik diilustrasikan dalam gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.5.

Pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran

elektroosmotik) (sumber: L. Thompson, et.al (1997))

Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan


lebih dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian
secara keseluruhan aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam
kenyataannya semua molekul baik yang bermuatan maupun netral akan terbawa
ke katoda. Tentunnya ion positif (kation) bergerak menuju katoda paling cepat
karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran elektroosmotik. Molekul
netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling lambat karena
aliran elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).
Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen
elektroforesis kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami
konsep gerakan ion-ion atau molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu
analogi. Aliran elektroosrnotik dapat dianalogikan sebagai aliran sungai yang
deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan sebagai ikan yang sedang berenang
ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan sebagai ikan yang
sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai ikan
mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam
sungai akan menuju ke hilir.
Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda
dipengaruhi oleh medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut

V=

ef

E+

eo

V menyatakan kecepatan solut menuju katoda,


eo

ef

adalah mobilitas elektroforetik,

adalah mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar

Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.6 Pengaruh aliran elektroosmotik dalam elektroforesis


kapiler (sumber: L. Thompson, et.al (1997)
C. Instrumentasi Elektroforesis
1.

Elektroforesis Gel
Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan thermostat

pendingin dan komponen utama yang diperlukan untuk elektroforesis gel.


pemisahan dapat dilakukan secara vertikal atau horizontal. catu daya memberikan
tegangan typi xallally 200-500 V dengan arus listrik cof 400 Artikel Baru 100.
elektroda dicelupkan ke dalam waduk penyangga di setiap sisi gel. untuk sebagian
pemisahan biomolekuler, pH Sochen bahwa analit bermuatan negatif. sehingga
analit bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk
melindungi pengguna dari tegangan tinggi .
Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer
elektrolit. gel vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex
dengan 0,5 sampai 1 cm id dan 3 sampai 10 cm panjangnya. alternatif gel dapat
berperan sebagai lempengan persegi panjang tipis di mana beberapa sampel dapat
dijalankan secara paralel. gel slab dapat dipolimerisasi pada foil lembam untuk
pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam tangki vertikal. ketebalan gel slab
adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang dan lebar sekitar 8cm x 8
cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya digunakan.
Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa
solusi kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan
penyangga di upper reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama
pengecoran dengan menggunakan sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk
dari sampel sumur, bergerak analit dalam bentuk pita yang sempit dan lebar
Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol
temperatrue memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka
membantu untuk mengusir panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi
termal. Pemisahan dapat memnggunakan waktu beberapa jam. setelah selesai gel

dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada divisualisasikan, biasanya dengan


pewarnaan.

Gambar 2.7 Bentuk bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk


horizontal; c. bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010).
Visualisasi Dan Deteksi

Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan


pewarnaan dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan
commomly digunakan adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan
alkohol asam ini temperatur tinggi pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam,
pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh jumlah mencuci langkah. Deteksi
batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1. pewarnaan perak lebih sensitif
dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip dengan protografhy
Metode Gel Elektroforesis
A. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS PAGE)
Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan
ukuran protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan
adanya deterjen anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya
melibatkan pemanasan protein pada temperature 950C. dengan adanya SDS yang
berbih dan agen tiol-reducing seperti

mercapto

etanol. Hasilnya lengkap

diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan tersier. Molekul melintang melalui
jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino
B. Isoelektrik Focussing (IEF)
Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic
seperti protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan
untuk pemisahan dan pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis
serta skala preparatif. Gel agarose dan PA keduanya digunakan pada metode IEF.
C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)
Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel
tunggal. Bagian yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi,
berikutnya yang lain akan terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode
ini, pencampuran seribu protein atau asam nukleat dapat dipisahkan dengan
resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat dibandingkan dengan database

elektronik. Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk mereproduksi dan metode


ini secara teknis menantang membutuhkan pengalaman personil dalam operasi.