Anda di halaman 1dari 7

CRITICAL APPRAISAL

PROTECTION OF GLYCYRRHIZIC ACID AGAINST AGESINDUCED ENDOTHELIAL DYSFUNCTION THROUGH


INHIBITING RAGE/NF-B PATHWAY ACTIVATION IN
HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS

Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Disfungsi Endotel

Oleh
MAKHYAN JIBRIL AL FARABI
1160701170114

PROGRAM PASCASARJANA FAKULTAS KEDOKTERAN


UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2015

1. Pesan Utama Arikel


Artikel ini menceritakan tentang peran Glycyrrhizic acid (GA, atau disebut juga
Glycyrrhizin), triterpenoid saponin glycoside sebagai kandugan utama dari Licorice (akar
Glycyrrhiza uralensis) terhadap efek AGEs dalam menginduksi disfungsi endotel,
meliputi perannya dalam anti-apoptosis, antioxidant stress dan respon anti-proinflamasi
beserta mekanisme yang mendasarinya. Penelitian ini telah membuktikan bahwa
pemberian GA dalam konsentrasi 10-810-6M mampu menurunkan apotptosis akibat
AGEs pada HUVECs, meningkatkan enzim antioksidan SOD dan menurunkan MDA
melalui inhibisi jalur RAGE dan NF-kB. GA juga mampu menurunkan produksi AGE
berlebih akibat ROS. Hal ini menunjukkan bahwa GA berpotensi mampu menjadi
alternative dalam pencegahan dan terapi komplikasi vaskuler diabetes pada dosis yang
tepat.

2. Kepentingan Artikel
Isi yang terdapat dalam artikel ini sangat menarik dan penting. Kadar glukosa
darah yang tinggi dalam jangka panjang pada penderita diabetes memicu terjadinya
proses glikasi lipid dan protein yang mengakibatkan terjadinya peningkatan AGE
(advanced glycation end product) AGE diproduksi melalui Maillard reaction yang
ditandai dengan adanya asam amino teralkilasi, residu fluorescence dan cross linkage
baik intra maupun inter molekul. AGE memegang peran yang cukup sigifikan dalam
proses terjadinya berbagai komplikasi pada diabetes, baik AGE yang berada pada
jaringan (intraseluler) maupun pada sirkulasi plasma darah (ekstraseluler) Interaksi antara
AGE dalam sirkulasi dengan RAGE (receptor for advanced glycation end product) akan
meningkatkan produksi ROS intraseluler dan upregulasi dari factor transkripsi NF-B dan
produknya yakni endothelin-1, vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1),
intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), E-selectin, tissue factor, thrombomodulin,
vascular endothelial growth factor (VEGF), sitokin proinflamasi IL-1, IL-6, tumor
necrosis factor- dan RAGE. ROS juga menginisiasi proses lipid peroxidation yang
ditandai dengan peningkatan MDA maupun penurunan aktivitas NO in vitro maupun in
vivo, atau menyebabkan terjadinya peningkatan regulasi (upregulation) dari iNOS dan
penurunan regulasi (downregulation) eNOS. Kesemuanya merupakan faktor yang
memicu terjadinya proses komplikasi vaskuler pada diabetes mellitus.
Glycyrrhizic acid (GA, atau Glycyrrhizin, 3-O-(2-O-beta-D- glucopyranuronosylalpha-D-glucopyranuronosyl)-18beta-glycyrrhetinic

acid,

Chemical

formula:

C42H62O16,molecular weight822.94), merupakan triterpenoid saponin glycoside

merupakan kandungan utama dari Glycyrrhiza uralensis. GA telahh dibuktikan memiliki


berbagai kemampuan bioaktivitas seperti antioksidan, antivirus, penrlindungan jantung,
penrlindungan liver, imunomodulator dan efek hipoglikemik.
Penelitian ini membuktikan bahwa GA pada dosis 10 -810-6M mampu
menghambat terjadinya apoptosis pada HUVEC yang dipapar 200 g/ml AGEs selama 48
jam. Dimana kemampuan tersebut juga terjadi ketika HUVEC diberi antibody
monoclonal

anti

RAGE.

Penghambatan

apoptosis

meningkat

seiring

dengan

meningkatnya dosis GA. Selain itu, GA juga menurunkan kadar Bax protein marker
apoptosis. Untuk aktivitas anti-oksidan, HUVEC di evaluasi kadar ROS, SOD dan MDA.
Dimana GA terbukti mampu menurunkan kadar ROS dan MDA, diikuti dengan
peningkatan kadar SOD.
GA juga dibuktikan mampu menghambat peningkatan kadar TGF-1 pada
HUVEC yang terpapar AGEs. Dimana mekanisme ini juga ditunjukkan pada pemberian
antibody monoclonal anti-RAGE. Selain itu, GA juga mampu menghambat amplifikasi
RAGE dan aktivasi NFkB pada HUVEC. Peningkatan transkripsi NF-B diakibatkan
karena interaksi AGE dengan RAGE yang meingkatkan signaling seperti NAD(P)H
Oksidase, P2, p38, GTPases Cdc42 dan Rac. Dengan hambatan aktivasi NF-B maka
akan terjadi penurunan ekspresi endothelin-1, vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM1),

intercellular

adhesion

molecule-1

(ICAM-1),

E-selectin,

tissue

factor,

thrombomodulin, vascular endothelial growth factor (VEGF), sitokin proinflamasi IL-1,


IL-6, tumor necrosis factor- dan RAGE. Hal ini menunjukkan bahwa GA memiliki
potensi untuk digunakan sebagai terapi dan pencegahan disfungsi endotel. Diduga
mekanismenya sama dengan metode untuk inhibisi RAGE dengan anti-RAGE igG atau
soluble RAGE sebagai ligan ekstraseluler yang mampu menginhibisi aktivasi NF-B.

3. Jenis Artikel
Artikel ini merupakan suatu original article suatu hasil penelitian eksperimental
laboratorik secara in vitro menggunakan sampel sel HUVEC dari American Type Culture
Collection (ATCC). Penelitian ini dilakukan untuk membuktikan pengaruh GA terhadap
HUVEC yang dipapar AGEs.

4. Validitas
4.1 Validitas Eksternal
Penelitian ini memiliki validitas eksternal yang rendah. Hal ini dikarenakan
sulitnya untuk melakukan generalisasi dari hasil penelitian yang menggunakan model in

vitro kepada populasi. Pada penelitian ini dilakukan pembatasan dalam berbagai macam
aspek sehingga bias yang terjadi dapat dikontrol dengan baik. Kondisi pembatasan ini
tentu saja tidak mencerminkan kondisi sebenarnya yang terdapat pada kondisi di dalam
tubuh atau in vivo.
Hasil yang didapatkan pada penelitian ini masih belum tentu akan menghasilkan
hasil yang sama ketika dilakukan secara in vivo. Hal ini dikarenakan aktivasi dari
disfungsi HUVEC ini dipengaruhi oleh berbagai macam faktor, seperti sitokin proinflamasi atau anti-inflamasi, interaksi dengan sel lain, dan lingkungan mikro yang
terdapat di dalam tubuh. Penelitian yang dilakukan secara in vitro ini dilakukan
pembatasan sehingga faktor-faktor perancu tersebut tidak memberikan pengaruh terhadap
hasil penelitian.
Selain itu, peneliti juga menyebutkan bahwa GA dapat menghambat apoptosis sel
HUVEC, peningkatan aktivitas antioksidan ditandai dengan penurunan ROS, MDA dan
peningkatan SOD,. Akan tetapi, peneliti di sini menggunakan AGE yang berasal dari
glikasi BSA sesuai metode Franke et al., (2009); Padahal, beberapa penelitian lain
menyebutkan bahwa AGE pada manusia akan berasal dari Human Serum Albumin (HSA)
dan protein lain yang terglikasi. Hal ini menunjukkan adanya kemungkinan perbedaan
hasil ketika AGE yang digunakan adalah AGE yang berasal dari HSA, bukan BSA. Selain
itu, AGE memiliki berbagai macam subtype seperti pyrallene, methylglycoxal,
carboxymethyl-lysine dan subtype lainnya. Oleh karena itu, untuk mengaplikasikan hasil
penelitian ini pada populasi penderita diabetes tentu saja masih sangat jauh karena AGE
yang digunakan tentu saja akan berbeda.

4.2 Validitas Internal


Penelitian ini memiliki validitas internal yang baik. Hal ini dikarenakan
hubungan sebab akibat yang didapatkan memiliki nilai yang kuat. Penelitian ini
melakukan pembatasan terhadap faktor-faktor eksternal yang mempengaruhi hasil dengan
menggunakan suatu desain penelitian in vitro. Pengaruh eksternal yang dapat
mempengaruhi hasil penelitian ini antara lain sitokin dan interaksi dengan sel lain serta
kondisi lingkungan mikro yang telah dimodifikasi sedimikian rupa sehingga menjadi
kondisi yang netral dan tidak mempengaruhi hasil penelitian. Apabila penelitian
dilakukan dengan desain in vivo tentu saja pengaruh-pengaruh eksternal akan sulit untuk
dihilangkan, seperti kondisi diet maupun emosional yang tentu saja dapat mempengaruhi
kondisi microenvironemtn vaskular dari satu individu.

Sel HUVEC yang digunakan telah disiapkan dengan metode yang standar dand
didapatkan dari American Type Culture Collection. Hasil dari produksi AGE di
laboratorium juga telah dilakukan konfirmasi terlebih dahulu kadarnya dengan
menggunakan ELISA sehingga memiliki nilai kepastian yang tinggi.
Untuk mendapatkan kesimpulan bahwa GA dapat menghambat apoptosis dan
memiliki efek anti-oksidan pada sel HUVEC yang terpapar AGEs, peneliti melakukan
beberapa pengukuran variabel. Variabel yang diukur merupakan variabel yang relevan
dalam menghasilkan kesimpulan tersebut. Variabel juga diukur menggunakan metode
yang telah dilakukan dalam penelitian sebelumnya sehingga merupakan metode yang
standar.

5. Bahan dan Metode


Penelitian yang dilakukan ini menggunakan HUVEC yang didapatkan dari
American Type Culture Collection. Peneliti tidak menyebutkan bagaimana standar
HUVEC yang digunakan dan jumlah sel nya dalam tiap well. Pada artikel ini juga tidak
disebutkan ethical clearance mengenai penelitian ini, mengingat penelitian menggunakan
HUVEC sebagai representasi dari sel manusia tentu saja harus membutuhkan persetujuan
dari komisi etik terlebih dahulu. Penelitian ini dilakukan dengan jumlah sampel triplicate
untuk menjamin validitas dari hasil yang didapatkan.
Metode yang dilakukan untuk produksi AGE merupakan metode standar produksi
AGEs dari BSA. AGEs yang dihasilkan dari reaksi ini merupakan crude AGEs yang
tersusun dari berbagai macam subtype AGE. Validasi kadar AGEs dengan menggunakan
ELISA dengan blanko standar BSA menjamin kadar yang tepat untuk AGEs yang
dipaparkan HUVEC. Sayangnya, AGE yang digunakan disini tidak dianalisis lebih lanjut
subtype apa yang dominan dalam kandugannya.
Metode pengukuran apoptosis dengan menggunakan Acridine orange/ethidium
bromide (AO/EB) merupakan metode standa yang cukup baik. Sayangnya hasil yang
didapatkan masih hasil semi kuantitatif dari analisis Image-Pro Plus software. Meskipun
demikian, hasil apoptosis ini ditunjang dengan adanya hasil analisis western blot yang
menunjukkan adanya peningkatan kadar Bax, protein yang akan muncul pada apoptosis
sel.
Metode pengukuran SOD, MDA, TGF-1, NFkB telah dijelaskan dengan cukup
jelas, dimana semuanya dilakukan dengan kit yang telah dipersiapkan khusus untuk
evaluasi variable tersebut. Hasil yang didapatkan merupakan hasil kuantitatif sehingga
cukup baik untuk digunakan sebagai referensi.

Metode statistik yang digunakan merupakan metode yang standar menggunakan


analisa komparasi menggunakan ANOVA yang menggunakan nilai p < 0,05 untuk
perbedaan yang signifikan dan p < 0,01 untuk perbedaan yang sangat signifikan.

6. Hasil Penelitian
Hasil yang didapatkan disajikan dalam bentuk tabel dan gambar

sehingga

memudahkan untuk membaca hasil tersebut. Akan tetapi, hasil yang menunjukkan
interpretasi berbagai macam warna marker pada evaluasi apoptosis di mikroskop
fluoresens (Gambar 1) tidak diberikan keterangan langsung, sehingga membuat pembaca
cukup kesulitan. Hal ini dapat diatasi dengan membuka versi web dari jurnal yang
memaparkan detail interpretasi warna dengan lebih jelas.
Peneliti juga menyimpulkan bahwa pemberian GA mampu menghambat
apoptosis dan memiliki efek antioksidan pada HUVECs yang dipapat AGE. Hal ini sudah
didasarkan dari analisa statistik dan telah ditunjukkan perbedaan yang signifikan antar
kelompok penelitian. Peneliti juga telah menggunakan antibody monoclonal anti-RAGE
untuk membandignkan efeknya dengan terapi yang sudah ada. Hasil lain yang didapatkan
dalam penelitian ini sudah relevan dan terkait dengan tujuan dari penelitian ini.

7. Pembahasan Artikel
Dalam artikel ini, peneliti tidak menyebutkan kekurangan dalam penelitian yang
dilakukannya. Kekurangan dalam penelitian ini justru penting untuk disebutkan karena
dapat dijadikan sebagai saran untuk penelitian selanjutnya.
Secara garis besar, pembahasan yang dituliskan oleh peneliti sudah sangat bagus
dimana peneliti mencari mekanisme kerja GA dalam menghambat disfungsi endotel ini
sudah relevan. Banyaknya data yang didapatkan dalam penelitian ini juga mendukung
pembahasan dan kesimpulan yang dikemukakan oleh peneliti. Data dari penelitian
terdahulu juga mendukung hasil yang didapatkan oleh peneliti sehingga membuat
pembahasan yang dikemukakan oleh peneliti ini valid.
Akan tetapi, limitasi dari pembahasan dalam artikel ini adalah tidak adanya
pembuktian secara langsung dari reseptor apa dari HUVEC yang berperan dan
dipengaruhi oleh pemberian GA. Dengan demikian, peneliti mencari mekanisme ini
berdasarkan studi pustaka dari hasil penelitian lainnya. Selain itu, dengan membuktikan
bahwa efek pemberian GA memiliki efek yang mirip dengan pemberian antibody antiRAGE, maka disimpulkan bahwa kemunkginan GA akan bekerja pada jalur AGE-RAGE.