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Scientia Chromatographica 2011; 3(4):327-338

Instituto Internacional de Cromatografia

TROUBLESHOOTING

DOI: 10.4322/sc.2011.020
ISSN 1984-4433

A importncia do volume do misturador de solventes em


HPLC gradiente
lvaro Jos dos Santos Neto
Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo - USP,
Av. Trabalhador So-carlense, 400, Cep 13560-970, So Carlos, SP, Brasil
e-mail: alvarojsn@iqsc.usp.br

Resumo
Com os desenvolvimentos recentes em HPLC e a complexidade dos atuais desafios enfrentados pela
tcnica, tem sido mais comum o uso de anlises no modo de eluio em gradiente de fase mvel. O
uso desses gradientes permite, por exemplo, anlises mais rpidas e capazes de separar compostos
com faixas mais amplas de hidrofobicidade do que nas metodologias com eluio isocrtica. Por outro
lado, a utilizao de gradiente mais exigente com a configurao da instrumentao analtica. Essas
configuraes podem ser particularmente crticas em casos de anlise com corridas curtas em UHPLC ou
com o uso de colunas microbore em LC-ESI-MS. Dependendo do tipo de detector e fase mvel utilizada,
volumes muito pequenos de mistura podem provocar excessivo rudo e instabilidades na linha de base do
cromatograma. Pelo contrrio, um volume muito grande do misturador pode acarretar atrasos no efetivo
incio do gradiente e demora no recondicionamento da coluna ao fim da corrida cromatogrfica. Nesse
artigo ser feita uma reviso de algumas particularidades do uso de gradiente, bem como dos respectivos
cuidados e ajustes para se minimizar as possibilidades de falha nesse tipo de anlise.
Palavras-chave
HPLC; UHPLC; colunas microbore; misturador de solvents; volume de atraso do gradiente; instrumentao.

The importance of the solvent mixing volume in gradient HPLC


Abstract
With the recent developments in HPLC and the complexity of the current challenges faced by this
technique the use of mobile phase gradients has become more usual. The use of gradients allows, for
example, fast analysis able to separate compounds with wide ranges of hydrophobicity than possible with
isocratic elution. On the other hand, the use of gradient is more demanding regarding the instrumental
setup. These setups can be particularly critical in the case of short chromatographic runs in UHPLC or
with the use of microbore columns on LC-ESI-MS. Depending on the type of detector and mobile phase
used, very low mixing volumes can lead to excessive noise in the form of ripple in the chromatographic
baseline. In contrast, a very high mixing volume can cause gradient delay and extend the time needed
for column equilibration at the end of the run. Here we present a revision about some particularities
regarding the use of gradient, as well as the respective caution and adjustments to minimize the chances
of failure in this kind of analysis.
Keywords
HPLC; UHPLC; microbore column; solvent mixing; gradient delay volume; instrumentation.

Santos Neto AJ

1 Aspectos gerais
Apesar da maior simplicidade das anlises
com eluio isocrtica em HPLC (aquelas em que
no h variao da composio/fora de eluio da
fase mvel ao longo da separao), diversas aplicaes requerem o uso de eluio em gradiente de
fase mvel. Um exemplo seria a anlise de amostras complexas para as quais se necessita reduzir o
tempo de eluio de compostos que apresentam
alta interao com a fase estacionria da coluna
(sem prejudicar a separao dos analitos menos
retidos presentes na mesma amostra). Anlises
em gradiente exigem instrumentao mais sofisticada e solventes mais puros, causam maiores
problemas na linha de base do detector e so mais
problemticas na transferncia do mtodo entre
diferentes equipamentos. Embora existam essas
complicaes, certas situaes exigem as anlises em gradiente, como amostras com compostos de interesse apresentando fatores de reteno
(k) muito amplos em anlise isocrtica; amostras
contendo interferentes muito retidos e que podem
eluir tardiamente em anlises subsequentes ou
sobrecarregar a coluna; amostras muito diludas e
em solventes fracos, as quais necessitam pr-concentrao na coluna cromatogrfica.
Para a formao de gradientes em HPLC
h duas tcnicas mais comumente empregadas: o gradiente de baixa presso (Low-Pressure
Gradient LPG) usando vlvula proporcional
de mistura precedendo a bomba ou o gradiente
de alta presso (High-Pressure Gradient HPG)
usando dois ou mais dispositivos de bombeamento. Em ambos ocorre a programao da
variao da composio final da fase mvel em
funo do tempo, de maneira a garantir um gradiente de solventes na fase mvel. Obviamente,
se necessrio, tais sistemas podem operar no
modo isocrtico, permitindo uma fcil alterao
na composio desejada para a fase mvel isocrtica. As bombas mais comumente encontra328

Misturador de solventes em HPLC gradiente

das no mercado para ambas as aplicaes so a


bomba ternria ou quaternria de mistura sob
baixa presso e a bomba binria de mistura sob
alta presso, usadas para LPG e HPG, respectivamente. De qualquer forma, na utilizao dessas
bombas ocorrem inomogeneidades localizadas
na composio da fase mvel impulsionada para
o restante do sistema cromatogrfico, tornando
necessria a existncia de um adequado misturador para que a combinao dos solventes torne-se
perfeitamente homognea. Em reviso anterior,
um maior detalhamento sobre o funcionamento
de gradientes de alta e baixa presso foi fornecido[1]. Basicamente, a formao inicial da fase
mvel em bomba de mistura sob baixa presso
possui a caracterstica segmentada e realizada
antes da bomba cromatogrfica propriamente
dita, de maneira que a mistura entre os solventes deve atravessar o sistema de bombeamento
antes de, efetivamente, chegar ao misturador do
sistema. Em bomba binria de alta presso, pelo
contrrio, ocorre a confluncia entre os solventes
impulsionados separadamente pelos dois dispositivos de bombeamento e as pequenas pulsaes
desses dispositivos fazem com que a composio
da fase mvel no seja perfeitamente homognea
antes de uma adequada mistura. A Figura1 ilustra as diferenas na forma de composio da fase
mvel nos sistemas para LPG (Figura1a) e HPG
(Figura1b), bem como a caracterstica dessa fase
mvel antes e aps a passagem pelo misturador[2].
Maiores detalhes sobre o escopo do uso
das bombas mencionadas acima podem ser
consultados na reviso tcnica de GratzfeldHuesgen[3]. Em aplicaes no muito exigentes,
ambos os tipos de bombas (mistura de baixa ou
alta presso) apresentam desempenho adequado.
Todavia, com ambas, se o misturador utilizado
no for eficiente na homogeneizao da fase
mvel, prejuzos podem ocorrer no desempenho
final da anlise cromatogrfica.
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Misturador de solventes em HPLC gradiente

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Figura 1 Ilustrao dos sistemas de bombeamento utilizados para a) LPG; e b) HPG. Adaptao feita com
permisso de Dionex (Part of Thermo Fisher Scientific)[2].

Em casos de insuficiente volume ou ineficincia para uma adequada homogeneizao, o


problema mais comum o aumento do rudo da
linha de base (na forma de ondulaes, ou ripple
em ingls). Nesse caso, quanto mais sensvel for o
detector s variaes na composio da fase mvel,
mais crticos sero os problemas com ondulaes da
linha de base. Outro problema que pode ocorrer em
alguns casos a deteriorao da eficincia cromatogrfica. Isso pode acontecer por causa de pequenas

diferenas de interao localizadas ao longo do pico


cromatogrfico, em funo das diferentes foras de
eluio encontradas na fase mvel, e que levam
deformao da banda cromatogrfica.
No menos importante do que um volume
mnimo suficiente para a mistura, um volume
excessivo tambm apresenta detrimentos s anlises em gradientes, particularmente em alguns
casos, como anlise em UHPLC e em microbore
LC-ESI-MS. Nas anlises em UHPLC exploram-

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-se velocidades lineares mais altas bem como


gradientes mais ngremes, de maneira a obterem-se anlises cromatogrficas mais rpidas. Nessas
situaes, um excessivo volume do misturador
causaria atrasos no incio efetivo do gradiente de
solventes na coluna, bem como um tempo mais
longo para chegar-se a um equilbrio da coluna ao
trmino da anlise. De maneira anloga, o uso da
cromatografia em escala reduzida tambm exige
ajustes no volume utilizado para a mistura da
fase mvel em questo. A Tabela1 apresenta uma
classificao para as diferentes escalas da HPLC,
e, dessas, aquela que encontra maior importncia a escala microbore, a qual extensivamente
utilizada no caso do acoplamento com a espectrometria de massas utilizando a interfase de eletronebulizao (electrospray) (LC-ESI-MS). Como
o uso dessa abordagem vem se popularizando e,
muitas vezes, instrumentos j existentes no laboratrio so adaptados para essa tcnica, faz-se
relevante destacar a importncia que ajustes sejam
feitos tambm no volume utilizado no misturador.
O desenvolvimento de misturadores com
volumes compatveis s novas demandas e, principalmente, efetivos na homogeneizao da fase
mvel tem sido bastante explorado atualmente
pelos fabricantes de instrumentos para HPLC.
H basicamente duas abordagens para a realizao da mistura: o uso de misturadores estticos
ou dinmicos. Os primeiros no utilizam peas
mveis e so mecanicamente mais simples, apesar de explorarem sofisticadas tecnologias na sua
concepo e fabricao, de maneira a garantir um
mximo de mistura em um menor volume. Os
misturadores dinmicos ou ativos utilizam dispositivos mveis de agitao para a obteno da
mistura. Muitos deles so constitudos por uma
cmara onde ocorre a confluncia dos solventes
a serem misturados e no interior da qual existe
uma barra ou dispositivo similar de agitao.
Apesar de garantirem uma mistura muito efetiva,
esses agitadores apresentam maior necessidade
330

Misturador de solventes em HPLC gradiente

de manuteno, geralmente tm maior volume


total, e atualmente no so utilizados por todos os
fabricantes, particularmente em casos de UHPLC
e LC microbore. A Figura2 ilustra o esquema de
um agitador dinmico desenvolvido em pesquisas do passado para a utilizao em LC microbore.
No caso dos agitadores estticos muito tem sido
feito ultimamente. Diversos fabricantes tm apresentado novas alternativas para a configurao
desses misturadores, mostrando, algumas vezes,
comparaes entre os seus modelos e os dos
concorrentes. Dessa forma, existem no mercado
diferentes tecnologias para esses misturadores,
entre as quais se podem citar o uso de: dispositivos preenchidos com microesferas de diferentes
tamanhos e materiais; dispositivos que induzem a
mistura por cisalhamento do solvente; diferentes
dispositivos microfludicos em mltiplas camadas; e dispositivos que combinam etapas sequenciais de mistura radial e longitudinal.
Tabela 1Nomenclatura para classificao da
cromatografia lquida realizada em diferentes escalas.
Classificao

Dimetro
interno (i.d.)

Vazo tpica

LC convencional

3,2-4,6 mm

0,5-2,0 mL/min

LC microbore

1,5-3,2 mm

100-500 L/min

micro-LC (-LC)

0,5-1,5 mm

10-00 L/min

LC capilar (cLC)

150-500 m

1-10 L/min

nano-LC

10-150 m

10-1000 nL/min

Figura 2 Esquema em corte de uma cmara de


mistura dinmica por agitao com volume interno de
80L. Com permisso, a partir da referncia4.

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Misturador de solventes em HPLC gradiente

Santos Neto AJ

2 Implicaes do uso de volume


insuficiente para mistura
A princpio pode-se questionar o porque
da necessidade de um misturador para bombas
binrias de alta presso, uma vez que a juno
dos solventes em uma conexo em T aparenta ser
suficiente. Logicamente bombas de alta presso
so menos crticas do que aquelas baseadas em
mistura sob baixa presso (as quais produzem
um fluxo segmentado de solventes); todavia, em
algumas situaes, excessivo rudo ainda observado na linha de base. Algumas bombas podem
dispensar volumes to baixos quanto 20 L ou
menos por ciclo de funcionamento, dependendo
se so do tipo de pistes paralelos ou sequenciais.
Requer-se usualmente um volume de mistura
mnimo equivalente ao volume dispensado em
dois ciclos da bomba para minimizar as pequenas diferenas na composio de cada um desses
ciclos de preenchimento. Para as bombas de baixa

presso, a esse volume soma-se o fato que a fase


mvel chega e atravessa a bomba em um fluxo
segmentado e mal pr-misturado, requerendo-se
um maior volume de mistura e, por conseguinte,
maiores atrasos na realizao de gradientes. Esse
um grande motivo para alguns fabricantes no
aconselharem a configurao de baixa presso
para executar gradientes em separaes tpicas de
LC-ESI-MS sob baixas vazes da fase mvel. Alm
disso, as bombas de baixa presso no so aconselhadas por alguns fabricantes para gradientes
extremos, alm da faixa de 5 a 95% de qualquer
um dos constituintes da fase mvel[3]. Igualmente,
pequenas diferenas podem ocorrer na transferncia de mtodos entre os dois tipos de bomba,
uma vez que as bombas binrias de alta presso
utilizam a compressibilidade tima para cada um
dos solventes utilizados na mistura (orgnico e
aquoso), enquanto em gradiente de baixa presso
apenas uma compressibilidade pode ser utilizada
para todos os canais do solvente.

Figura 3 Cromatograma ilustrando as oscilaes inadequadas causadas na linha de base por problemas na
mistura do gradiente (a), em relao a um cromatograma adequado (b). Adaptao feita com permisso de
Dionex (Part of Thermo Fisher Scientific)[2].

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Os casos tpicos que levam ao aparecimento


de oscilaes mais elevadas da linha de base so
aqueles em que os solventes da mistura apresentam respostas muito diferentes no detector
utilizado (por exemplo, diferente absoro no
caso de deteco UV). Obviamente, o maior
rudo induzido por problemas na mistura leva
a maiores valores de LD e LQ nessas situaes.
Um trabalho de Logar e colaboradores descreve
os efeitos da mistura do eluente em HPLC gradiente sobre a resposta do detector de espectrometria de lente trmica (TLS) e do UV-Vis[4].
Nesse trabalho foi feita uma comparao entre
valores de LD obtidos em mtodo isocrtico
e em gradiente para alguns compostos. Dada
a maior sensibilidade do TLS s variaes da
composio do solvente, o uso de gradiente
causou maior aumento dos valores de LD no
detector TLS do que no UV-Vis, demonstrando
que o primeiro sofre maior influncia das inomogeneidades da mistura. A Figura 3 ilustra
a diferena na razo sinal/rudo em funo de
uma mistura inadequada dos solventes que
compe o gradiente.
Um teste simples para a verificao de adequao da mistura pode ser feito adicionando-se
metanol na linha A do gradiente e metanol contendo 0,1% de acetona na linha B, e ajustando-se
o detector UV para 260nm. Em seguida realiza-se uma corrida com gradiente de 0 a 100% do
componente B da fase mvel, verificando-se o
rudo obtido na linha de base. A Figura 4 ilustra alguns experimentos em vazes tpicas de LC
microbore comparando diferentes tipos de misturadores.
Algumas composies de fase mvel so
mais crticas em HPLC, sabe-se que a presena de cido actico e frmico, ou suas respectivas bases, eleva a absoro da radiao
UV em baixos comprimentos de onda. Um
caso tipicamente conhecido e extremo o uso
332

Misturador de solventes em HPLC gradiente

de cido trifluoroactico (TFA) como aditivo


nas fases orgnica e aquosa. Esse aditivo, em
uma concentrao de 0,1% em cada solvente,
faz com que haja uma diferena da ordem de
160 mAU (a 220 nm) entre as absorbncias
observadas na fase 100% aquosa e 100% orgnica (acetonitrila). Neste ltimo caso, o maior
volume possvel de mistura deve ser usado se
o objetivo principal for a obteno dos menores limites de deteco em detectores espectrofotomtricos.

Figura 4 Testes de gradientes obtidos com metanol


e metanol fortificado com acetona. a) Apenas um T
misturador, b) T com tubo misturador esttico de 80L,
c) T com tubo misturador de 320L, d) misturador
dinmico de 80L, e e) T com tubo misturador esttico
de 80L e misturador dinmico de 80L. Gradiente
de 0 a 100% em 50minutos (2%/min), vazo de fase
mvel de 50L/min e misturador ligado diretamente
ao detector sem o uso de coluna cromatogrfica. Com
permisso, a partir da referncia4.

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Misturador de solventes em HPLC gradiente

Uma situao adicional que os volumes


inadequados de mistura, alm de induzirem s
ondulaes na linha de base, tambm acarretam distores no cromatograma. O exemplo da
Figura 5 demonstra que mesmo em separaes
isocrticas usando a mistura dos solventes no sistema, uma mistura incompleta alm de elevar o
rudo da linha de base tambm distorce o perfil
cromatogrfico. Pode-se observar pelo cromatograma da Figura5b que uma menor eficincia foi
obtida no caso da mistura inadequada, alm do
j esperado aumento no rudo da linha de base.
Por fim, conforme destacado na referncia2,
a prpria coluna cromatogrfica tem a capacidade de amplificar o rudo (ondulao) da linha
de base atribudo a problemas de mistura da fase
mvel. Em experimentos em que se comparam
o uso de uma unio, em substituio coluna
cromatogrfica, pode-se observar o efeito dessa
ampliao (Figura6). Nesse caso, com o uso de
um misturador de 35L, as ondulaes equiva-

Santos Neto AJ

leram a 0,26% da escala usando-se uma unio e


11,1% usando-se uma coluna (uma amplificao
de 43 vezes). No caso do uso de um misturador
com 400 L, os rudos foram, respectivamente,
0,03 e 1,45% da escala do detector; apesar de um
nvel mais baixo de rudo, a amplificao superior a 50 vezes.
Apesar de algumas aplicaes serem crticas com relao a uma perfeita mistura da fase
mvel, em outros casos permite-se uma considervel reduo do volume de mistura. Algumas
aplicaes em LC-MS permitem o uso de volumes mnimos de mistura, de maneira a possibilitarem-se gradientes e re-equilbrios mais rpidos.

3 Implicaes da existncia de
volume excessivo
Se um volume inadequadamente pequeno
de mistura pode ser um problema, por outro
lado, um volume muito grande tambm no

Figura 5 Separao isocrtica com metanol:gua (70:30, v/v). Picos 1 a 6: uracila, fenol, acetofenona,
nitrobenzeno, metilbenzoato e tolueno, respectivamente. a) Fase mvel pr-misturada usando apenas uma
bomba; b) Metanol e gua impulsionados por duas bombas e combinados em um misturador em T. c) Metanol
e gua impulsionados por duas bombas e combinados em um misturador completo. Com permisso, a partir
da referncia 4.

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Misturador de solventes em HPLC gradiente

rpidos e as vazes, baixas, qualquer volume


excessivo de mistura pode causar detrimentos na
separao.

Figura 6 Comparao das oscilaes da linha


de base com a presena da coluna (cinza) e sem a
coluna (preto). Misturador de 35L, solvente A: gua/
acetonitrila 99:1+0,1% TFA, solvente B: acetonitrila
100%+0,1% TFA, coluna: Dionex Acclaim RP C18,
3m, 120, 2503,0mm, vazo: 1,00mL/min,
temperatura: 35C, comprimento de onda: 220nm.
No experimento sem coluna foi utilizado um capilar
de slica fundida de 50m, gerando uma presso de
400bar. Adaptao feita com permisso de Dionex
(Part of Thermo Fisher Scientific)[2].

desejvel na maioria das anlises em gradiente.


O problema relacionado a um volume exagerado
de mistura que esse causar atrasos na chegada
do gradiente at a coluna, podendo ainda causar significativas distores do gradiente, alm
de prolongar o tempo de equilbrio entre as corridas. No caso de UHPLC, deseja-se um baixo
volume de mistura, para permitirem-se gradientes rpidos e pequeno tempo de re-equilbrio.
Duas situaes se destacam atualmente na questo dos ajustes necessrios em sistemas HPLC
no otimizados para a compatibilizao com
anlises em gradientes. Um dos casos relevantes
a utilizao de colunas para anlises cromatogrficas rpidas (por exemplo, colunas com tecnologia de partculas superficialmente porosas),
o outro envolve o uso de colunas microbore para
LC-ESI-MS, as quais tipicamente trabalham em
vazes inferiores a 0,2-0,3mL/min. Como nesses casos os gradientes utilizados so geralmente
334

A Figura 7 compara anlises sequenciais


realizadas com um tempo de equilbrio insuficiente entre as corridas, dadas as baixas vazes
em contrapartida a um misturador com mais do
que 500 L de volume. Nesse caso, a primeira
corrida (com coluna equilibrada) difere das
demais, tanto nos tempos de reteno quanto
nas eficincias, justamente pelo fato do solvente
no se re-equilibrar adequadamente no interior
da coluna antes de uma nova injeo de amostra. Observa-se que na primeira corrida (cromatograma de cima) os picos so mais estreitos e
eluem em tempos diferentes daqueles dos demais
cromatogramas abaixo, comprovando que aps a
primeira corrida a coluna no consegue retornar
ao seu equilbrio inicial antes da prxima injeo. Nesse caso usou-se uma coluna com tecnologia de partculas superficialmente porosas e
com dimetro interno de 2,1mm, para facilitar
o acoplamento LC-ESI-UV-MS, e verificou-se
que o volume do misturador era inadequado
condio analtica utilizada, a qual usava vazo
de 0,15mL/min.
bvio que no basta minimizar apenas
os volumes, fato esse que leva os fabricantes de
HPLC ao desenvolvimento constante de melhores tecnologias de mistura para atender os diferentes volumes demandados. Faz-se importante
mencionar que no apenas o volume do misturador pode causar atrasos nos gradientes como
tambm alguns injetores automticos, os quais
utilizam grandes alas de amostragem que permanecem no caminho do solvente entre o sistema de bombeamento e a coluna. Alguns desses
instrumentos permitem a configurao dessa
ala em modo by-pass depois de determinado
tempo de esvaziamento, fazendo com que o
gradiente no precise atravess-la durante toda
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Misturador de solventes em HPLC gradiente

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Figura 7 Comparao entre cromatogramas obtidos por LC-ESI-UV-MS com coluna microbore (1502,1mm,
2,6m). Injees sequenciais de mistura contendo 5 antibiticos. Anlise em gradiente linear de 8 a 30% do solvente B,
retornando a 8% em intervalo de 1 minuto e mantendo-se equilibrado por mais 5minutos, em vazo de 0,15mL/min.

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a anlise. Em outros equipamentos nos quais a


opo by-pass no configurvel, recomenda-se
a reduo do volume da ala de injeo para realizao de anlises suscetveis a atrasos indesejados do gradiente.
3.1 Como aferir e ajustar o volume
adequado para o gradiente
Diante de todo o exposto, faz-se importante
saber como estimar o tempo real de atraso da
chegada do gradiente coluna, em funo do
volume de mistura e dos demais dispositivos utilizados. Esse atraso til no clculo do denominado GDV (do ingls, gradient delay volume), o
qual o produto do tempo de atraso do gradiente
com a vazo da fase mvel utilizada. Conforme

Misturador de solventes em HPLC gradiente

ilustrado na Figura 8, um gradiente entre 0 e


100% do solvente B pode ser realizado em um
intervalo de 10minutos (sendo que o solvente B
contm 0,5% de acetona em relao ao solvente
A). A linha de base deve ser registrada por um
detector UV em aproximadamente 260 nm e a
distncia horizontal entre o grfico do gradiente
e o da linha de base na altura de 50% de B corresponde ao tempo de atraso do gradiente.
Alm do tempo de atraso no gradiente,
outro parmetro importante a dependncia
que o erro na concentrao (CE) da fase mvel
apresenta em funo da inclinao do gradiente.
A Figura 9 demonstra que para um mesmo
tempo de atraso do gradiente h o dobro do erro
na concentrao quando se duplica a inclinao
do gradiente. O erro na concentrao :
(1)

Figura 8 Determinao experimental do tempo de


atraso do gradiente. Adaptao feita com permisso
de Dionex (Part of Thermo Fisher Scientific)[2].

A simulao de diferentes volumes de mistura demonstra claramente que um volume


excessivo causa distores no gradiente devido s
disperses no sistema. Essas disperses causam
um comportamento no linear do gradiente em
funo da diluio exponencial que ocorre nos
extremos do gradiente. O trabalho de Powley e
colaboradores descreve como realizar uma simulao do efeito do volume de mistura e demais
parmetros sobre o perfil do gradiente[5]. Tal

Figura 9 Determinao experimental do erro da concentrao do gradiente.

336

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Misturador de solventes em HPLC gradiente

abordagem de interesse quando se trabalha com


baixas vazes de fase mvel e necessita-se saber os
ajustes necessrios e influncias existentes sobre
a transferncia de mtodos. A Figura 10 ilustra
algumas simulaes, em comparao a um sistema terico com volume de mistura igual a zero.
Como pode ser observado na Figura 10, o
aumento no volume de mistura prejudica a linearidade da variao do gradiente que realmente
chega coluna. Na simulao de um volume de
400 L de mistura, o qual causa um atraso de
2minutos no gradiente, o erro de concentrao
de 10%. Esse erro mantm-se linearmente em
10% ao longo da regio central do gradiente,
todavia, nos extremos do grfico h uma perda
de linearidade seguindo um comportamento
exponencial. No caso da mistura em 400L h
uma perda da linearidade do gradiente abaixo

Santos Neto AJ

de aproximadamente 10% de B e acima de aproximadamente 90% de B. Essas distores so


capazes de afetar a eluio dos compostos retidos nessa faixa do gradiente e devem ser levadas
em considerao nos ajustes do mtodo e principalmente na transferncia da metodologia entre
instrumentos com volumes diferentes.

4 Consideraes finais
A existncia de um misturador efetivo para
a homogeneizao da fase mvel obtida em sistemas cromatogrficos com mltiplos canais de
solventes de extrema importncia em diversas
aplicaes, quer seja usando anlise isocrtica ou
em gradiente, com bomba binria de alta presso ou quaternria de baixa presso. A influncia de uma adequada mistura recai sobre o rudo
da linha de base, permitindo limites de deteco
significativamente melhores para alguns detectores e diversas composies de fase mvel.
Um perfeito ajuste do volume utilizado
para a mistura importante para UHPLC e
LC-ESI-MS, no apenas no sentido de garantir-se uma mistura minimamente aceitvel para a
fase mvel como tambm para evitar grandes
atrasos no gradiente, os quais podem inviabilizar
o desenvolvimento de anlises rpidas, eficientes
e reprodutveis.

Figura 10Simulao das distores causadas


pela disperso no volume de mistura. Perfil terico
considerando volume zero e em comparao com
200 e 400L de volume de mistura. Gradiente entre
0 e 100% de B de 0 a 20minutos (5%/min) e vazo
de 0,2mL/min.

Em linhas gerais, para aplicaes de UHPLC


e LC-ESI-MS, com detectores que sofrem pouco
com as irregularidades da composio do solvente (Corona CAD, ELSD e MS) podem-se utilizar misturadores pequenos, da ordem de 35 a
100L. Misturadores de tamanho intermedirio
(200 a 400L) podem ser mais adequados para
minimizar as ondulaes da linha de base em
detector UV-Vis, sendo que o mximo de estabilidade pode ser conseguido com misturadores de
at 800L. Para as aplicaes mais exigentes, tais
como aquelas envolvendo o uso de TFA e bom-

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Santos Neto AJ

Misturador de solventes em HPLC gradiente

bas com misturador de baixa presso, volumes


de 800L ou mesmo superiores a 1,5mL podem
ser necessrios.
Em vista da discusso apresentada, torna-se evidente que instrumentos convencionais
no otimizados para UHPLC e LC-ESI-MS em
escala microbore, muito comuns nos laboratrios
de anlise, necessitam ajustes para operar adequadamente em condies de gradientes. Alguns
desses equipamentos podem ter misturadores
com volumes ajustveis, mas provavelmente no
sero capazes de t-los reduzidos aos nveis mais
baixos desejados, ao menos sem a aquisio de
novos misturadores com tecnologias e volumes
mais compatveis com as atuais exigncias.

Dionex - Part of Thermo Fisher Scientific. Reliable solvent


mixing in UHPLC. [cited 2011 nov.]. Dionex; 2011.
Dionex Technical Note, n. 108. Available from: http://
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