Citoqueratinas

Las citoqueratinas (o queratina epitelial) son filamentos intermedios de queratina que se
encuentran en el citoesqueleto del tejido epitelial, formando una compleja red (en rojo, en la
imagen de abajo) que se extiende desde la superficie del ncleo de la clula epitelial hasta la
membrana plasmtica. Hay dos tipos de citoqueratinas: de bajo peso (citoqueratinas cidas de
tipo I) y de alto peso (citoqueratinas bsicas o neutras de tipo II). Las queratinas epiteliales se
encuentran generalmente por parejas, una citoqueratina de tipo I y otra de tipo II. Cada tipo de
citoqueratina tiene diferentes subtipos, que se designan como CK1, CK2, etc, siendo los subtipos
1 a 9 pertenecientes a las queratinas bsicas o neutras, y los subtipos 10 a 20 pertenecientes a
las queratinas cidas. La expresin de estas citoqueratinas se produce con frecuencia en un
rgano o tejido especfico (por ejemplo, la CK7 se expresa en el epitelio del tracto genitourinario
mientras que la CK20 es ms comn en el tracto gastrointestinal). Los histopatlogos emplean
esas distinciones para detectar las clulas de origen de diversos tumores.
Los subgrupos de citoqueratinas que expresa una clula epitelial dependen principalmente
del tipo de epitelio, del momento de diferenciacin terminal y de la fase de desarrollo. Por lo
tanto, son como huellas dactilares que permiten clasificar todos los epitelios segn su perfil de
expresin de citoqueratina. Adems, esto tambin se aplica a la contraparte maligna del epitelio
(los carcinomas), ya que el perfil de citoqueratina tiende a permanecer constante cuando el
tejido sufre una transformacin maligna. La principal implicacin clnica es que el estudio del
perfil de citoqueratinas mediante tcnicas de inmunohistoqumica es una herramienta de gran
valor, ampliamente utilizada para el diagnstico y caracterizacin de tumores en la patologa
quirrgica.
citoqueratina
Tipo de protena que se encuentra en las clulas epiteliales que revisten las
trratamiento es eficaz, o si el cncer volvi. Una citoqueratina es un tipo de
Cytokeratin 7
Producto
Informacin sobre el antgeno

Las citoqueratinas son protenas de filamentos intermedios presentes en los
epiteliocitos. Se expresan en de manera especfica para el tejido en rganos
normales y en los tumores que surgen de los mismos. La citoqueratina 7
pertenece a la subfamilia neutra bsica de tipo B de las citoqueratinas. Su
distribucin se reduce al epitelio glandular y transicional. Se conoce la
expresin de la citoqueratina 7 en abundancia en clulas bronquiales y
mesoteliales de cultivo, pero solo a niveles bajos en clulas epidrmicas de
cultivo.
La secuencia de aminocidos predicha de esta queratina ha revelado un

notable diferencia entre sta y las queratinas de tipo II expresadas en las
clulas epidrmicas. Se ha observado la presencia de citoqueratina en

adenocarcinomas pulmonares, de mama, de endometrio, de ovario, de
glndula tiroidea, as como en carcinomas de la vejiga y carcinoma renal de
clulas cromfobas. Se conoce que la expresin de la citoqueratina 7 y la
citoqueratina 20 muestran patrones caractersticos en adenocarcinomas
primarios y metastsicos colorrectales y de pulmn.
Mientras que el clon OV-TL 12/30 puede producir una tincin no deseada de las
clulas endoteliales, el clon RN7 no tie estos tipos de clulas. La opcin de la
recuperacin de eptopo, calor o enzima, con objeto de obtener el mejor
resultado con el clon OV-TL 12/30 deber determinarlo el propio usuario. Los
clones RN7, OV-TL 12/30 y LP5K reaccionan con la protena de filamentos
intermedios de la citoqueratina humana (54 kD) identificada como
citoqueratina 7.
Carcinoma de mama con infiltracin lobular: tincin inmunohistoqumica para

el antgeno de la citoqueratina 7 usando NCL-L-CK7-560. Observe la intensa
tincin citoplasmtica y de la membrana de las clulas tumorales. Corte de
parafina.
CLONE: OV-TL12/30
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CK7-OVTL-L- 1ml NCL-L- Liquid Concentrated

CE
CK7-OVTL Monoclonal Antibody
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et
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MSD
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CK7-OVTL-L- 1ml NCL-L- Liquid Concentrated
P(ENZYME/HI Info
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Datashe MSD
Cant.
et
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CE
CK7-OVTL
Monoclonal Antibody
ER)
S
1
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CK7-OVTL-CE 1ml NCLCK7-OVTL
Lyophilised Concentrated P(ENZYME/HI Info

Monoclonal Antibody
ER)
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CK7-OVTL-CE 1ml NCLCK7-OVTL
Lyophilised Concentrated P(ENZYME/HI Info

Monoclonal Antibody
ER)
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CK7-OVTL-R- 7ml RTU7-CE

CK7-OVTL
Ready to Use Monoclonal P(ENZYME/HI Info

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ER)
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S
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CK7-OVTL

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ER)
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CK7-OVTL

Antibody
ER)
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CLONE: RN7
El esfago de Barrett (EB) es un factor de riesgo conocido para el desarrollo de
adenocarcinoma esofgico. El EB ha sido categorizado como a segmento largo

(EBSL) si se extiende a ms de 3 cm de la unin esfago-gstrica, o a
segmento corto (EBSC) si se observa mucosa de aspecto columnar a menos de
3 cm de dicha unin. La metaplasia intestinal puede tambin desarrollarse en
la mucosa gstrica (MIG) de la unin esfago-gstrica. presentando un menor
potencial desarrollo de cambios displsicos o adenocarcinomatosos. Estas
condiciones son difciles de distinguir entre s slo en base a parmetros
endoscpicos o morfolgicos. El objetivo de este estudio fue evaluar patrones
de inmunomarcacin con anticuerpos para citoqueratinas (CQ) 7 y 20 en estas
entidades con el fin de identificar el sitio de origen de dichas metaplasias
intestinales. Fueron evaluadas 27 biopsias pertenecientes a pacientes con
sospecha endoscpica de EBSL y EBSC, las cuales fueron comparadas con
biopsias con diagnstico de MIG. El patrn CQ7/20 de tipo Barrett fue
observado en el 100% de los EBSL. el cual no fue identificado en ninguna de
las biopsias con MIG. En estas ltimas se observ por el contrario la ausencia
de marcacin con CQ7 y tincin con CQ20 en el epitelio superficial. En el grupo
de pacientes con EBSC. 67% presentaron el patrn CQ7/20 tipo Barrett.
mientras que e133% restante evidenci una marcacin similar a la vista en las
biopsias con MIG. Nuestros hallazgos confirman la alta especificidad del patrn
Inmunohistoqumico de CQ7/20 para distinguir metaplasias intestinales
correspondientes a EBSL o EBSC de las MIG.(AU)
Barrett's oesophagus (BE) has been identified as the most important risk factor
for adenocarcinoma of the distal oesophagus. BE has been categorized as longsegment (LSBE) if it extends 3 cm or more up the oesophagus and as short
segment (SSBE) if it extends less than 3 cm into oesophagus. Intestinal
metaplasia may also develop in gastric mucosa (lMG) at the
gastroesophagealjunction. IMG has a much lower risk to progress to dysplasia
or carcinoma when compared with SLBE or SSBE. Moreover. these conditions
are difficult to distinguish one from another only based on endoscopic and
morphologic criteria. Therefore the aim this study was to evaluate the
cytokeratin (CK) 7 and 20 inmunoreactivity patterns in these intestinal
metaplasias with the purpose to determine the precise anatomic site ofthe
biopsy. Biopsy specimens from 14 patients with LSBE, 6 with SSBE and 7
patients with IMG were inmunohistochemically stained with monoc1onal
antibodies to CK 7 and 20. Barrett's CK7/20 pattern was characterized by
superficial and deep CK7 reactivity and only superficial CK 20 staining in the
intestinalized mucosa. This pattern was found in all 7 ( I 00%) patients with
LSBE, and was absent in all 7 patients with IMG. All biopsy specimens from
patients with IMG showed no staining for CK7 and diffuse surface positivity for
CK20. 67% of the biopsy specimens from patients with endoscopic SSBE
showed Barrett's CK7/20 pattern, and the remaining 33% specimens showed
the IMG stainlng pattern. Based on our data the inmunohistochemical
determination of CK7/20 is an excelent tool with high specificity in
distinguishing LSBE and SSBE from IMG.(AU)

Descritores:
Esfago de
Barrett/patologia
Juno
Esofagogstrica/patol
ogia
Queratinas/anlise
-Esfago de
Barrett/complicaes
Metaplasia
Imuno-Histoqumica
Bipsia
Esofagoscopia
Sensibilidade e
Especificidade
Diagnstico
Diferencial
Adenocarcinoma/etiol
ogia
Neoplasias
Esofgicas/etiologia
Mucosa
Gstrica/patologia
Limites:
Estudo Comparativo
Humanos
Revista chilena de anatoma

versin impresa ISSN 0716-9868
Rev.chil.anat.v.16n.2Temuco1998
http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98681998000200007
EXPRESIONDECITOQUERATINASENELEPITELIOORALDELAMUCOSA
GINGIVALHUMANAYDERATON
CYTOKERATINEXPRESSIONINHUMANANDMOUSEGINGIVALEPITHELIA
Anglica Montenegro
Gumy C. Ibarra
Mariana Rojas
Programa de Morfologa, Instituto de Ciencias Biomdicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Chile.
MONTENEGRO, M. A.; IBARRA, G. C. & ROJAS, M. Expresin de citoqueratinas en

el epitelio oral de la mucosa gingival humana y de ratn.Rev. Chil. Anat., 16(2):211217, 1998.
RESUMEN: Utilizando la tcnica de inmunoperoxidasa y un panel de anticuerpos
monoclonales, se realiz un estudio para caracterizar la expresin de citoqueratinas
(CK) constituyentes de los filamentos intermedios, en el epitelio de la mucosa gingival
humana y de ratn.
El epitelio que reviste la enca humana vara de ortoqueratinizado a paraqueratinizado
y no cornificado, predominando el paraqueratinizado. Este epitelio se caracteriza por
un estrato crneo con ncleos picnticos y un estrato granuloso pobremente definido.
La expresin de citoqueratinas es ligeramente diferente del ortoqueratinizado.
El epitelio gingival ortoqueratinizado se caracteriza por la presencia de CK 1 - 10,
queratinas especficas de la diferenciacin tipo epidermis. En cambio el epitelio gingival
no queratinizado se diferencia del queratinizado porque todas sus clulas suprabasales
contienen las CK tipo esfago 13 y 14, pero no las de tipo epidermis. Todas las capas
celulares de estos epitelios reaccionan negativamente con los anticuerpos anti CK 18 y
19.
El epitelio gingival de ratn es principalmente ortoqueratinizado y muestra un patrn
de expresin de citoqueratinas similar a este tipo de epitelios.
Existen diferencias notorias en la expresin de citoqueratinas en el epitelio gingival,
que estn relacionadas con el grado de queratinizacin que puede ser comprobado
histolgicamente. Las citoqueratinas siguen siendo los mejores marcadores de la
diferenciacin epitelial en la cavidad oral.
PALABRAS CLAVE: 1. Citoqueratinas; 2. Epitelio paraqueratinizado; 3. Mucosa gingival;
4. Filamentos intermedios.
INTRODUCCION
Las citoqueratinas constituyen el principal componente del citoesqueleto de las clulas
epiteliales, donde forman un gran grupo de filamentos intermedios cuyo dimetro
oscila entre 8 y 10 nm. En la especie humana forman una compleja familia codificada
por, al menos, 20 genes diferentes, cuyo peso molecular vara entre 40 y 70 kDa y su
punto isoelctrico oscila desde 5.2 a 7.8 (CREWTHER et al., 1983; STEINERT & ROOP,
1988).
Las citoqueratinas corresponden a un grupo de 19 protenas que se caracterizan por su
estabilidad y su baja solubilidad en tampones fisiolgicos. Mediante mtodos
electroforticos e inmunolgicos con anticuerpos monoclonales, se han clasificado en 2
subfamilias: la primera comprende protenas bsicas relativamente grandes (56 a 67
kDa), numeradas de 1 a 8; mientras que la segunda est constituida por protenas

ms pequeas, ms acdicas y son numeradas de 9 a 19.
Los dos grupos de citoqueratinas se comportan como heteropolmeros obligados, es
decir, se requiere un miembro de cada grupo para la formacin de un filamento de
queratina, con excepcin de la citoqueratina 19. Como consecuencia de esto, cada
epitelio expresa por lo menos dos citoqueratinas diferentes. Por ejemplo, las queratinas
5 y 14 se encuentran juntas en todos los queratinocitos, la 1 y 10 estn en los epitelios
queratinizados, la 4 y 13 en epitelios estratificados no queratinizados y la 8 y 18 en
epitelios simples. La queratina 19 aparece sola, en epitelios simples. Pero dependiendo
de la complejidad del epitelio, el nmero y tipo de queratinas presentes puede variar
(CREWTHER et al.; STEINERT & ROOP).
Se ha establecido que las citoqueratinas de bajo peso molecular (40 kDa) se
encuentran en epitelios simples y glandulares, las de peso molecular intermedio en
epitelios estratificados y las de alto peso molecular (~ 67 kDa) en epitelios
queratinizados. Su expresin es afectada por factores ambientales y cambios
patolgicos (SAWAF et al., 1991).
El epitelio que tapiza la enca es un epitelio estratificado escamoso que puede tener
distintos grados de cornificacin, variando desde el epitelio ortoqueratinizado al
paraqueratinizado y no cornificado (TEN CATE, 1994).
Las clulas epiteliales experimentan cambios morfolgicos y composicionales a medida
que migran desde la capa basal hacia la superficie y aunque, se han encontrado
algunas queratinas en tejidos no epiteliales como los rganos linfoides, stas todava
siguen siendo los mejores marcadores de la diferenciacin epitelial.
En este trabajo se estudia la expresin de algunas citoqueratinas a nivel de epitelio
gingival humano y de ratn.
MATERIAL Y METODO
Para este estudio se utilizaron cinco encas humanas y cinco de ratn. Las encas
humanas sanas fueron obtenidas de piezas dentarias de pacientes adultos, con
indicacin de extraccin. Las encas de ratn se obtuvieron de especmenes adultos
normales, mantenidos en vivero, bajo condiciones controladas de luz, temperatura y
alimentacin.
Las muestras se fijaron en formol tamponado al 10%, se postfijaron en Dubosq Brasil y
se procesaron por el mtodo histolgico corriente que consiste en deshidratacin en
alcoholes ascendentes, impregnacin e inclusin en parafina, cuidando de no exceder
los 60C para no alterar los antgenos del tejido.
Se realizaron cortes seriados de 5 m, algunos de los cuales se tieron con
hematoxilina-eosina y azul de Alcin. Otros cortes se sometieron a la tcnica de
inmunoperoxidasa para identificar citoqueratinas en el epitelio de la mucosa gingival,
utilizando los siguientes anticuerpos primarios:
- Anticuerpo monoclonal AE1, en una dilucin de 1:200 (Sigma, producto N C2562).
Este anticuerpo es especfico para identificar queratinas 1 - 10 - 13 - 16 - 18 - 19.
- Anticuerpos monoclonales antiqueratinas 18 y 19, en una dilucin de 1:200 (Sigma,

productos N C7765 y C6930, respectivamente).
Para la tcnica de inmunoperoxidasa, se procedi de la siguiente forma:
- Desparafinacin de las muestras en bateras de xilol y posterior hidratacin con
alcoholes descendentes.
- Inhibicin de la peroxidasa endgena del tejido con perhidrol al 3% (H 2O2 al 3%).
- Digestin enzimtica (tripsina al 0.1% en cloruro de calcio a pH 7.8).
- Bloqueo con suero de bovino no inmune diluido 1:20 (Dako).
- Incubacin con el anticuerpo primario diluido 1:200 para todas las citoqueratinas
utilizadas, en cmara hmeda.
- Incubacin con el anticuerpo secundario (antisuero biotinilado) diluido 1:400
(Zymed).
- Incubacin con estreptavidina-peroxidasa diluida 1:800 (Zymed).
- Revelado con diaminobenzidina (DAB).
- Tincin nuclear de contraste con hematoxilina de Harris.
- Deshidratacin, aclaramiento con xilol y montaje con entelln (Merk).
Entre cada paso se hicieron lavados en buffer fosfato (PBS) a pH 7.2, excepto entre el
bloqueo con suero no inmune y el anticuerpo primario.
Para asegurar la especificidad de la reaccin inmune, se realizaron controles positivos y
negativos. Para el control positivo se utilizaron cortes de tejidos que, se conoce, dan
positiva la reaccin con los anticuerpos primarios usados. Para el control negativo se
utilizaron cortes adyacentes a los tratados con el anticuerpo primario y se sometieron a
la misma tcnica, con la excepcin que el anticuerpo primario se reemplaz por suero
de ratn no inmune (Dako). En estos casos no se observ reaccin positiva.
RESULTADOS
El anlisis histolgico de las muestras indic que la mucosa gingival humana est
constituida principalmente por un epitelio paraqueratinizado, pero que en algunas
zonas puede variar a ortoqueratinizado y hacia la zona del surco gingival pierde la
cornificacin, pasando a constituir un epitelio no queratinizado (Figs. 1, 2, 3). La
mucosa gingival del ratn en cambio, presenta un epitelio queratinizado en toda su
extensin, incluyendo parte del surco gingival (Figs. 4 y 5).
Fig. 1. Corte coronal de enca humana libre. Se

observa el epitelio paraqueratinizado (puntas de
flechas) y no queratinizado (flechas). H&E, azul
Alcin. 40 X.
Fig. 2. Enca marginal con epitelio paraqueratinizado.

H&E, azul Alcin. 100X.
Fig. 3. Enca humana marginal con epitelio

ortoqueratinizado. H&E, azul Alcin. 200 X.
Fig. 4. Enca libre de ratn con epitelio

ortoqueratinizado (punta de flecha). Dentina (D).
Surco gingival (S). H&E, azul Alcin. 200 X.
Fig. 5. Enca marginal de ratn con epitelio

ortoqueratinizado (puntas de flechas). Dentina (D).
Surco gingival (S). H&E, azul Alcin. 200 X.
Los resultados obtenidos con el anticuerpo AE1 se resumen en la Tabla I. Este
anticuerpo no se expresa en el estrato basal en ninguno de los tipos de epitelio, pero
su expresin es intensa en el estrato polidrico o espinoso, especialmente en las capas
celulares inferiores de este estrato, en las distintas variedades del epitelio gingival. El
estrato granuloso es fuertemente positivo en el epitelio ortoqueratinizado, lo mismo
que el estrato superficial de clulas aplanadas del epitelio paraqueratinizado
(Figs. 6, 7, 8).
Tabla I. Patrn de tincin de las clulas del epitelio gingival humano con anti-queratina AE1.
Estrato basal
Estrato polidrico
Clulas profundas
Estrato polidrico
Clulas superficiales
Estrato granuloso
Estrato plano
Estrato crneo
Ortoqueratinizado
Epitelios estratificados
Paraqueratinizado
No queratinizado
--+++
--+++
--++
++
++
+++
++
+++
+
--- = tincin negativa; + = algunas clulas positivas y otras negativas

++ = todas las clulas positivas; +++ = todas las clulas fuertemente positivas
Fig. 6. Inmunoexpresin de citoqueratina AE1 en

epitelio gingival humano paraqueratinizado. Se
observa expresin positiva en las clulas inferiores del
estrato polidrico (puntas de flechas) y en el estrato
plano y reaccin negativa en el estrato basal. 200 X.

epitelio gingival humano ortoqueratinizado . Se
observa expresin fuertemente positiva en las clulas
inferiores del estrato polidrico (puntas de flechas) y
en el estrato granuloso (flechas) y reaccin negativa
en el estrato basal. 200 X.

epitelio gingival humano no queratinizado. La
expresin es marcada en el estrato polidrico (puntas
de flechas). 200 X.
Con las citoqueratinas 18 y 19, el resultado fue negativo en todas las clulas de los
distintos tipos epiteliales (Figs. 9 y 10).
Fig. 9. Inmunoexpresin de citoqueratina 18 en

epitelio gingival humano paraqueratinizado. La
tincin es negativa en todos los estratos celulares. 100
X.
Fig. 10. Inmunoexpresin de citoqueratina 19 en

epitelio gingival humano ortoqueratinizado. Se
observa tincin negativa en todos los estratos
celulares. 200 X.
En el ratn, la expresin de citoqueratinas es similar a la observada en el epitelio
ortoqueratinizado de la enca humana, existiendo una fuerte expresin en el estrato
espinoso y en el estrato granuloso (Figs. 11 y 12).
Fig. 11. Inmunoexpresin de citoqueratinas AE1 en

epitelio gingival de ratn ortoqueratinizado. Se
observa tincin fuertemente positiva en el estrato
polidrico (puntas de flechas) y reaccin negativa en
el estrato basal. 100 X.
Fig. 12. Inmunoexpresin de citoqueratinas AE1 en

epitelio gingival de ratn ortoqueratinizado. Se
observa tincin fuertemente positiva en el estrato
polidrico (puntas de flechas) y reaccin negativa en
el estrato basal. 100 X.
Fig. 13. Distribucin de citoqueratinas en el epitelio gingival de las diferentes zonas de la enca humana.
DISCUSION
En este trabajo se utilizaron algunos anticuerpos monoclonales especficos para
identificar filamentos intermedios de citoqueratinas en el epitelio gingival humano y de
ratn. En general, nuestros resultados corresponden con algunos de los descritos
previamente (CLAUSEN et al., 1986; SAWAF et al.).
La expresin de citoqueratinas de un epitelio est ntimamente relacionada con su
estado de diferenciacin. En la enca humana, cada uno de los tres fenotipos de
epitelio gingival (ortoqueratinizado, paraqueratinizado y no queratinizado) mostraron
un patrn de citoqueratinas caracterstico.
En nuestro estudio, las evidencias de la expresin suprabasal de queratinas, se

basaron en la reaccin de la queratina AE1 que indica presencia de queratinas 1 - 10 13 y 16. Efectivamente, en el estrato polidrico se observ una fuerte expresin del
anticuerpo AE1, especialmente, en las clulas profundas de esta capa. Adems, la
reaccin fue intensa en el estrato granuloso del epitelio ortoqueratinizado y en el
estrato plano de los epitelios paraqueratinizado y no queratinizado. En el estrato
crneo la expresin fue tambin positiva pero menos marcada. Los anticuerpos para
las queratinas 18 y 19 fueron negativos.
Estas observaciones estn de acuerdo, en general, con lo descrito en otros epitelios de
la cavidad oral de similares caractersticas, excepto que en este estudio se encontr
mayor expresin en las clulas profundas del estrato polidrico, lo que difiere de lo
descrito previamente, con una mayor expresin en las clulas superficiales de este
estrato (CLAUSEN et al., 1983, 1986; SAWAF et al.).
El epitelio oral ortoqueratinizado que se encuentra en el paladar duro, tuberosidad del
maxilar, punta de las papilas filiformes y en los bordes desdentados, se caracteriza por
la presencia de citoqueratinas 1 - 2 - 10 y 11, que son especficas de la diferenciacin
tipo epidermis. Estas citoqueratinas se expresan bien en las clulas superiores del
estrato polidrico y en el estrato granuloso, pero estn ausentes en el estrato basal y
en las clulas profundas del estrato polidrico (CLAUSEN et al.,
1983, 1986; MACKENZIE et al., 1991; SAWAF et al.). Adems, las clulas suprabasales
sintetizan queratinas 6 y 16 que, se supone, son marcadores de queratinocitos con alto
recambio como son los del epitelio oral. En el estrato basal contienen citoqueratinas 5
y 14 que son especficas de la estratificacin (Fig. 13).
El epitelio oral no queratinizado que reviste la mucosa alveolar, el surco gingival, la
superficie interna de labios y mejillas, el piso de la boca, la superficie ventral y lateral
de la lengua, el paladar blando y la mucosa interpapilar, expresa polipptidos
diferentes del epitelio queratinizado, donde faltan las citoqueratinas de alto peso
molecular (CLAUSEN et al., 1986). En estos epitelios, todas las clulas suprabasales
contienen citoqueratinas 4 y 13 (como en el esfago), pero no las de tipo epidrmico 1
- 10 y 11, mientras que la capa basal contiene queratinas 5 y 14 especficas de la
estratificacin (SAWAF et al.).
El epitelio paraqueratinizado que reviste la enca, se caracteriza por tener un estrato
crneo con ncleos picnticos y un estrato granuloso pobremente definido. En este
epitelio el patrn de citoqueratinas es algo diferente al ortoqueratinizado, ya que
expresa tambin la citoqueratina 14 en la capa basal y 1 y 10 en las clulas
suprabasales que son tpicas de la estratificacin y cornificacin, respectivamente, pero
adems posee citoqueratina 13 que es especfica de las capas suprabasales del epitelio
no queratinizado (MACKENZIE et al.; LU et al., 1997; TOMAKIDI et al., 1997).
Las citoqueratinas siguen siendo los mejores marcadores de la diferenciacin epitelial,
en la cavidad oral en general y en la mucosa gingival en particular, ya que se ha
descrito que el epitelio de unin, que es un tejido no queratinizado y no diferenciado,
sintetiza queratinas 19 - 5 y 14, stas dos ltimas son especficas de la estratificacin.
Es el nico epitelio de la cavidad oral que no sintetiza CK 4 y 13, tpicas del esfago y
aunque el recambio de este epitelio es muy alto, no expresa CK 6 y 16 que son propias
de la hiperproliferacin (MATSUYAMA et al., 1997). La presencia de CK 19, tpica de
epitelios simples, indica que este epitelio tiene caractersticas de un tejido de transicin
(TOMAKIDI et al.).
Existen diferencias notorias en la expresin de citoqueratinas en el epitelio gingival,

que estn relacionadas con el grado de queratinizacin que se observa
histolgicamente.
MONTENEGRO, M. A.; IBARRA, G. C. & ROJAS, M. Cytokeratin expression in human
and mouse gingival epithelia.Rev. Chil. Anat., 16(2):211-217, 1998.
SUMMARY: Using immunoperoxidase technique, an established panel of antibodies
was used to characterise the cytokeratin (CK) intermediate filament profile of human
and mouse oral stratified epithelia from gingival mucosa.
The epithelium covering the human gingiva is a combination of orthokeratinized,
parakeratinized and non-keratinized epithelia but it is mainly parakeratinized. This
epithelia is characterized by a stratum corneum with pycnotic nuclei and a poorlydefined stratum granulosum. The cytokeratin pattern of this epithelium was slightly
different from that of orthokeratinized epithelia.
Stratified orthokeratinized gingival epithelia is characterized by the presence of CK1
and 10, which are specific to epidermal-type differentiation. The non-keratinized
gingival epithelia can be distinguished from keratinized epithelia because all the
suprabasal cells contain esophageal-type CK 13 and 14 , but no epidermal-type CK 1
and 10. The parakeratinized gingival epithelia presents both CK 1 - 10 and 13 - 14. All
the cell layers of these three kinds of epithelia reacted negatively with antibodies
against CK 18 and 19.
The mouse gingival epithelium is mainly orthokeratinized, and it shows a similar
pattern of keratin expression of this type of epithelia.
There are, distinct differences in the keratin expression of gingival epithelia which are
related to the pattern of keratinization assessed histologically.
KEY WORDS: 1. Cytokeratins; 2. Epithelium; 3. Gingival mucosa; 4. Intermediate
filaments.
Direccin para correspondencia:
Prof. Dra. Mara Anglica Montenegro
Programa de Morfologa
Instituto de Ciencias Biomdicas
Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Independencia 1027, Casilla 70079, Santiago 7, Chile
Fax 56-2- 678 6264
Recibido : 06-08-1998
Aceptado : 21-09-1998
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
CLAUSEN, H.; VEDTOFTE, P.; MOE, D. & DABELSTEEN, E. Keratin pattern in human oral
buccal and hard palate mucosa. Scand. J. Dent. Res., 91: 411-13, 1983.
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PCR en tiempo real complementa inmunohistoqumica en la

determinacin de la condicin de HER-2/neu en cncer de mama
BioMed Central
Andreea Nistor (umnistor@cc.umanitoba.ca) [1], Peter H Watson
(pwatson@cc.umanitoba.ca) [1], Norman Pettigrew (pettig@cc.umanitoba.ca)
[2], Karim Tabiti (comfidenceu . Tabiti@roche.com) [3], Angelika Dawson
(adawson@hsc.mb.ca) [4], Yvonne Myal (myal@cc.umanitoba.ca) [1]
[1] Departamento de Patologa de la Universidad de Manitoba, 770 Bannatyne
Ave., Winnipeg, Manitoba R3E 0W3, Canad
[2] Departamento de Patologa, Laboratorio de Inmunopatologa, Centro de
Ciencias de la Salud, 820 Sherbrook St, Winnipeg, Manitoba R3A 1A9, Canad
[3] Jefe de Gestin de la Alianza de Oncologa, Clnica genmica,
el diagnstico Roche GmBH, Nonnenwaldstr. 2-82372 Penzberg, Alemania
[4] Departamento de Bioqumica y Gentica Mdica, Universidad de Manitoba,

770 Bannatyne Ave., Winnipeg, Manitoba R3E 0W3 y el Laboratorio de
Citogentica, Centro de Ciencias de la Salud 820 Sherbrook St, Winnipeg,
Manitoba R3A 1A9, Canad
[5] Patologa Laboratorio de Diagnstico Molecular, Departamento de Patologa,
Centro de Ciencias de la Salud, 820 Sherbrook St, Winnipeg, Manitoba R3A 1A9,
Canad
Copyright 2006 Nistor et al; licenciatario BioMed Central Ltd
Este es un artculo de acceso abierto distribuido bajo los trminos de la licencia
Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que
permite el uso irrestricto, la distribucin y reproduccin en cualquier medio,
siempre que la obra original sea debidamente citada.
Resumen
Antecedentes
El beneficio clnico de la determinacin de la condicin de HER2 / neu amplificacin en pacientes con cncer de mama es bien aceptado.
Aunque inmunohistoqumica (IHC) es el mtodo ms frecuentemente utilizado
para evaluar la sobre-expresin de la protena HER-2, de fluorescencia de
hibridacin in situ (FISH) es reconocido como el "estndar de oro" para la
determinacin de HER-2 / neu estado . La mayor discordancia entre los dos
mtodos tiene lugar entre los tumores de mama que reciben una puntuacin
de IHC indeterminado de 2 +. Ms recientemente, un tiempo real de reaccin
en cadena de polimerasa (PCR) utilizando el ensayo LightCycler ha sido
desarrollado para la cuantificacin de HER-2 / neude amplificacin de genes. En
este estudio se evaluaron la sensibilidad y especificidad de una prueba
LightCycler disponible en el comercio, ya que se compara con FISH. Para
determinar si este ensayo ofrece una alternativa precisa para la determinacin
del HER-2 / neu, que se centr principalmente en tumores que se consideran
indeterminados o por la condicin de frontera IHC.
Mtodos
Treinta y nueve tumores de mama IHC recibir una puntuacin de 2 + fueron
evaluadas por ambas FISH LightCycler y las tecnologas, a fin de determinar
si cuantitativos PCR en tiempo real proporciona una alternativa precisa para la
determinacin del HER-2 / neu.
Resultados
Se observa una alta concordancia (92%) entre FISH y PCR en tiempo real los
resultados. Tambin observ que el 10% de estos tumores fueron positivos
para la amplificacin de genes por tanto FISH y PCR en tiempo real.
Conclusin
Los datos muestran que los resultados obtenidos para la amplificacin del gen
HER-2 / neu por PCR en tiempo real sobre el LightCycler instrumento es
comparable a los resultados obtenidos por FISH. Estos resultados sugieren que,
por lo tanto, PCR en tiempo real de anlisis, utilizando el LightCycler , es una
alternativa viable a FISH para reevaluar los tumores de mama que reciben una
puntuacin de IHC 2 +, y que una combinacin de IHC y PCR en tiempo real
criterio para la determinacin de HER-2 en pacientes con cncer de mama
puede ser una estrategia eficaz y eficiente.
Antecedentes
Gene amplificacin y sobre-expresin del HER-2 / neu gen, tambin conocido
como c-erbB erbB-2 o ERBB2, es frecuentemente observadas
(aproximadamente 25-30%) en los humanos cncer de mama [1]. El HER2 / neu gen, que es un miembro del receptor del factor de crecimiento
epidrmico (HER), la familia, se localiza en el cromosoma 17q11.2-12 [2] y
codifica una 185 kDa transmembrana tirosina quinasa del receptor de la
protena.
Considerado a desempear un papel en el comportamiento biolgico o la
patognesis del cncer de mama humano, la amplificacin del HER-2 / neu gen
es considerado en la actualidad como un slido [3] predictivo y pronstico [4]
marcador para el cncer de mama, en particular para la gestin De cncer de
mama avanzado. Ambos con ganglios positivos y ganglios negativos pacientes
con cncer de mama cuyos tumores presentan HER-2 / neu amplificacin,
tienen un mal pronstico, un aumento del riesgo de recidiva y un elevado
riesgo de las enfermedades relacionadas con la muerte que muestra las tasas
de supervivencia general ms corta [5 - 10] .
Sin embargo, el principal inters en HER-2 / neu amplificacin reside en su
utilidad como marcador predictivo de la respuesta al tratamiento [11], sobre
todo, la respuesta de pacientes con cncer de mama a la quimioterapia, la
terapia hormonal (antiestrgenos) y teraputica anti-HER-2 Anticuerpos.
Tumores con amplificacin de este oncogn son menos sensibles a CMF
(ciclofosfamida, metotrexato y 5-fluorouracilo) regmenes de quimioterapia
adyuvante que los de los niveles normales de los genes de productos [12]. Por
el contrario, HER-2 /neu amplificacin es un marcador til para identificar a los
pacientes que tienen ms probabilidades de beneficiarse de altas dosis de
doxorrubicina (Adriamicin) la terapia [13 - 15]. Los pacientes con HER2 / neu amplificacin de genes / sobre-expresin son menos sensibles a la
terapia tamoxifeno [16 - 18]. Sin embargo, el HER-2 / neu estado se utiliza
principalmente para la identificacin de pacientes con cncer de mama
avanzado, que pueden beneficiarse de la terapia con anti-HER-2 anticuerpo
trastuzumab / Herceptin (Genetech, San Francisco, CA) un anticuerpo
monoclonal murino humanizado que Ha demostrado ser eficaz en la
prolongacin de la supervivencia en pacientes con receptor positivo de
carcinoma de mama metastsico [19].
Si bien el beneficio clnico de la determinacin de la condicin de HER2 / neu amplificacin y sobre-expresin est claramente aceptado, varios
mtodos para la evaluacin y cuantificacin de HER2 / neu alteracin gentica se han utilizado en la bsqueda de una precisa,
cuantitativa ampliamente Aplicable en el mbito clnico y rentable de ensayo.
Inmunohistoqumica (IHC) es el ms frecuentemente utilizado para evaluar la
sobre-expresin de la protena HER-2. Se trata de un mtodo indirecto de
medicin de amplificacin de genes, y se basa en la capacidad de los
anticuerpos para identificar HER-2 protenas expresadas por las clulas en fijos
congelados o secciones de tejidos embebidos en parafina. En general, IHC se
lleva a cabo tejidos embebidos en parafina utilizando equipo de laboratorio
estndar y, por tanto, es el mtodo de eleccin para la mayora de los
laboratorios clnicos. Sin embargo, IHC anlisis se basa en la interpretacin
subjetiva de la intensidad de la tincin y la extensin de clulas tumorales
dentro de una seccin con el fin de asignar una expresin de la puntuacin de
0 / 1 + (IHC considerarse como negativo) o 2 + / 3 + (IHC considerarse como
positivos).
Determinacin de HER-2 / neu amplificacin por fluorescencia de hibridacin in
situ (FISH) estrategias es un mtodo alternativo de eleccin. Considerando que
IHC detecta la sobre-expresin de la protena HER-2, FISH es un mtodo directo
para la deteccin de HER-2 / neu de amplificacin de genes. Sin embargo, FISH
es ms tiempo para llevar a cabo, relativamente costoso, y requiere equipo
especializado. Sin embargo, la exactitud de esta tcnica FISH evaluacin
significa que se acepta como el "estndar de oro" para la determinacin del
HER-2 / neu estado embebidos en parafina de tumores de mama.
Reaccin en cadena de polimerasa (PCR) estn basadas en ensayos en
condiciones de determinar los cambios en HER-2 / neu nmero de genes y de
expresin [20]. PCR en tiempo real de anlisis de ADN ofrece un anlisis
cuantitativo preciso de amplificacin de genes. La ventaja de esta tcnica es
que es sencillo, cmodo, no radiactivos y rpido por lo que es muy adecuado
para una rutina de laboratorio clnico. No ms all de los conocimientos
precisos y tcnica asptica pipeteado es obligatorio. Sin embargo, los
resultados de la PCR en tiempo real cuantitativa ensayos pueden ser afectados
por la contaminacin de la muestra del tumor con los cidos nucleicos de la
falta de tumor tejidos circundantes. Este problema se puede reducir mediante

el uso de lser con ayuda de microdissection, o si no est disponible, por
esbozar cuidadosamente el tumor rea de la diapositiva y utilizando
nicamente el tumor de tejido para el anlisis.
La evaluacin de la condicin de HER-2/neu en el nivel de mRNA de
transcripcin inversa-PCR (RT-PCR) tambin se ha propuesto [20, 21], pero el
uso de parafina fijado en formol e-embebido de tejidos para este fin es
problemtico como el ARN es a menudo ampliamente degradados. Por lo tanto,
el uso de RT-PCR se limita a la disponibilidad de tejido congelado.
Cromognico hibridacin in situ (CISH) es un mtodo introducido ms
recientemente para la deteccin de HER-2 / neu amplificacin [22]. CISH hace
uso de la tecnologa dehibridacin in situ, pero tambin se aprovecha de la
cromognico deteccin de la seal de IHC. Con CISH, una sonda de ADN se
detecta mediante un simple como IHC-peroxidasa y la reaccin positiva seales
pueden ser detectados con el microscopio ordinario de luz. Una de las ventajas
de CISH es que el ensayo es un cuarto del costo de FISH y se puede utilizar
cuando la microscopa fluorescente no est disponible. Sin embargo CISH,
como IHC, se basa en la interpretacin subjetiva y la utilidad de algunos de
baja / alta amplificacin de CISH resultados son a veces de que se trate.
Hasta la fecha, la FDA ha aprobado dos mtodos [23] para la seleccin de
pacientes con cncer de recibir Herceptin (Trastuzumab), la terapia: FISH y la
IHC. En la prctica, ambas tcnicas se utilizan en combinacin. IHC ensayo se
utiliza como un primer ensayo de cribado para identificar claramente los casos
positivos o negativos. El FISH de ensayo es usado posteriormente en los casos
en que la condicin de IHC es indeterminado (2 + IHC casos positivos). Esta
estrategia secuencial evita el alto costo y la demora de tiempo relativamente
largo de la utilizacin de la FISH de ensayo en todos los casos. Ms
recientemente, un LightCycler HER-2 / neu Cuantificacin de ADN kit (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) est actualmente disponible en
el comercio y una PCR en tiempo real LightCycler ensayo ha sido desarrollado
para HER-2 / neu evaluacin. Los avances en el uso de la tecnologa PCR en
tiempo real fluorescente capacidad de vigilancia de la LightCycler tienen el
potencial de permitir relativamente barata, rpida y precisa cuantificacin de
amplificacin de genes [24]. La evaluacin de la PCR cuantitativa en tiempo
real de ensayo para HER2 / neu es el foco de este estudio.
Nuestro objetivo fue evaluar la especificidad y sensibilidad de la LightCycler
PCR en tiempo real de ensayo, ya que se compara con FISH, centrndose
principalmente en los tumores que son indeterminados o borderline estado de
HER-2 por IHC.
Mtodos
Muestras de tejidos
Entre enero de 2001 y diciembre de 2004, 1.673 tumores de mama fueron
examinados rutinariamente por IHC anlisis de la protena HER-2
sobreexpresin en el Laboratorio de Inmunopatologa en el Centro de Ciencias
de la Salud, Winnipeg, Manitoba. Las muestras tumorales fueron fijados,
procesados y embebidos de parafina de acuerdo a protocolos estndar [25].
Borderline muestras (+2 anot por IHC), que consiste en aproximadamente un
10% del nmero total de muestras analizadas tumor de mama.
Representante bloques de parafina de los 39 seleccionados al azar muestras de
tumor primario de mama ocup el +2 por IHC se obtuvieron del Laboratorio de
Inmunopatologa. FISH y PCR en tiempo real anlisis fueron realizados por el
Laboratorio de Patologa Molecular de diagnstico. Por PCR en tiempo real de
anlisis, tumor de las zonas con un mnimo de 100 clulas / cm 2 y un mnimo
de 'contaminando' del tejido normal del seno se esbozaron en la cubierta de
vidrio con una hoja de marcador permanente. Las reas descritas se rasp en
tubos eppendorf para la extraccin de ADN.
Este estudio fue aprobado por el Comit de Patologa Acceso Tejidos (PACT) y la
Junta de tica de la Investigacin en la Universidad de Manitoba.
Inmunohistoqumica (IHC), el anlisis
IHC anlisis de la protena HER-2 expresin se llev a cabo en las
secciones histolgicas de los especmenes de cncer de mama utilizando el
HercepTest (DAKO, CA, EE.UU.). El HercepTest fue aprobado por la FDA
(septiembre, 1988) para la seleccin de las mujeres con cncer de mama con
el fin de recibir trastuzumab anticuerpo monoclonal humanizado terapia. Seis
m de espesor de las secciones de tejido de embebido bloques de parafina se
cortaron, montado en silano revestida de diapositivas, deparaffinized,
sometidos a tratamiento trmico para la recuperacin de antgeno [26] y
immunostained. El tratamiento trmico de calefaccin que participan en olla a
presin en 10 mmol / L de tampn citrato durante 40 minutos y de las
secciones de tejidos fueron luego enfriado. La inmunomarcacin proceso se
llev a cabo utilizando el DAKO Autostainer Universal Staining Sistema de
acuerdo a las instrucciones del fabricante (DAKO, Corp). En resumen, las
secciones de tejidos fueron tratados con peroxidasa de bloqueo de reactivos
durante 5 minutos, lavadas y tratadas con conejo anti-humano HER-2
anticuerpo primario durante 30 minutos. Las secciones fueron lavadas y
tratadas durante 30 minutos con secundario de cabra anti conejo de
anticuerpos y peroxidasa de rbano y, tras el aclarado, en diaminobenzidine
incubados durante 10 minutos. Las secciones fueron eliminados de la
Autostainer y counterstained con hematoxilina y montado en Permount. Tincin
de membrana fue interpretado como HER-2 sobreexpresin de la protena
utilizando una esfera brillante-microscopio Olympus de acuerdo con un sistema

de puntuacin establecido en [20] como 0, 1 + 2 + 3 + y de la siguiente
manera: 0 que indique la ausencia de manchas, indicando el 1 + Ms bajo nivel
detectable de tincin y / o la falta de homogeneidad en tincin dbil, 2 +
indicando moderada tincin de membrana homognea y 3 + indicando intensa
tincin de membrana homognea. Inmunomarcacin se consider positiva
cuando ms del 10% de todas las celdas haba 2 + o 3 + intensidad de la
tincin.
Anlisis FISH
FISH anlisis se llev a cabo utilizando el Vysis LSI HER2 / neu SpectrumOrange y CEP 17 SpectrumGreen Dual Color sonda de ADN kit
(Vysis PathVysion , Abbot Laboratories, IL), de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. El locus especficos de identificacin (LSI) HER-2/neu es una
sonda de ADN de 190 Kb SpectrumOrange-etiquetados sonda fluorescente que
hybridizes especficamente a la HER-2/neu gene locus, 17q11.2-q12. El
cromosoma enumeracin sonda (CEP) 17 es un 5.4-Kb SpectrumGreen
etiquetados fluorescentes de ADN especficas para la sonda alfa satlite
secuencia de ADN en la regin centromrica del cromosoma 17, 17p11.1q11.1.
HER-2 / neu gen copia nivel fue determinado por FISH anlisis de tejidos
embebidos en parafina de las secciones como la relacin entre el gen HER2/neu copias del cromosoma 17 y centrmeros copias (Vysis, Inc.) Este enfoque
excluye polysomy del cromosoma 17 como fuente de aumento de HER2 / neu nmero de copias de genes.
El 6 m de espesor en las secciones de tejidos fueron deparaffinized
diapositivas en xileno, seguido de deshidratacin con etanol absoluto, secado
al aire y pre-tratados con la Vysis Parafina pretratamiento Kit I (Vysis, Inc.)
Despus de un tratamiento previo, el proceso de hibridacin se realiz a 37 C
durante 14-18 horas (durante la noche) y luego los ncleos se counterstained
con 4'-6'-diamidino-2'-phenylindole (DAPI). La enumeracin de HER-2 / neu y
CEP 17 seales de la sonda se realiz bajo microscopa de fluorescencia con
una de 100 vatios lmpara de mercurio a 1000X de aumento utilizando un
microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot con triple bandas filtros.
La puntuacin se limitaba a la demarcacin de las clulas cancerosas del tumor
en la zona H & E diapositivas manchado por dos patlogos del cncer de mama
(PW, WO). En cada muestra, 60 no fueron contados ncleos superpuestos. El
verde de las seales de centrmeros 17 y el naranja de las seales de HER2 / neu gen se registraron, y la proporcin se calcula para cada diapositiva.
Segn las directrices del fabricante, sin seales de los ncleos, o slo a una de
las seales de color o ncleos con DAPI insuficiente contra-tincin nuclear para
determinar la frontera no se obtuvo resultados. Una razn de HER-2 / neu en el

cromosoma 17 el nmero de copias 2,2 se considera positiva y un ratio <1,8
se considera negativa para HER-2 / neu amplificacin. La puntuacin de
diapositivas, que present una tasa de entre el 1,8 y el 2,2, se volvi a evaluar.
PCR cuantitativa en tiempo real de anlisis de amplificacin de HER2/neu gene
La extraccin de ADN se realiz a travs de Alto Pure PCR plantilla de
Preparacin Kit (Roche).
Real-Time PCR anlisis se ha realizado mediante el LightCycler (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) y el LightCycler HER2 / neu Cuantificacin Kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,
Alemania). El gastrin gen se utiliz como referencia la limpieza de genes. A
112-bp fragmento del gen Her-2/neu y un fragmento de 133 pb del gen gastrin
se ampliaron durante la reaccin de PCR. La cuantificacin simultnea de la
HER-2 / neu gen y el gen de referencia que sirve a la vez como control de la
integridad del ADN y como referencia para la cuantificacin relativa se logr
mediante el uso de sondas de hibridacin diferentes etiquetados (Red-705 para
el HER-2 / neu y Roja-640 de la gastrin oligonucletidos especficos) que
permiten la deteccin de doble color en el mismo capilar. Cinco l
(aproximadamente 1 g), de cada muestra de la plantilla de ADN se mezcla
con el listos para usar primers y sondas de hibridacin, la solucin de enzima
(Taq ADN polimerasa) y dNTP mezcla de reaccin incluido en el kit en un
volumen final de 20 l . La pre-incubacin y de desnaturalizacin de la plantilla
de ADN se realiz a 95 C durante 12 minutos. Esto fue seguido por el objetivo
de amplificacin de ADN a travs de 45 ciclos de desnaturalizacin a 95 C
durante 10 segundos, recocido a 58 C durante 10 segundos y elongacin a 72
C durante otros 10 segundos. Las muestras fueron luego enfriado a 40 C.
Las muestras fueron analizadas en los duplicados. El LightCycler HER2 / neu Cuantificacin Kit contiene un calibrador de ADN siempre y para
generar una curva de calibracin. El punto de cruce de datos para el HER2 / neu y el gen de referencia se determinaron y exportados a cuantificacin
relativa de Software que permite el clculo de la ratio HER-2/gastrin
normalizado. Un ratio objetivo gen / gen de referencia = 2,0 se consider
positivo para HER-2 / neu de amplificacin de genes.
Anlisis estadstico
El anlisis estadstico se realiz utilizando GraphPad PRISM , versin 3,02. La
concordancia entre el tiempo real LyghtCycler ensayos FISH y PCR fueron
analizados por una probabilidad exacta de Fisher de prueba (Cuadro 2], el
punto de corte para asignar negativas y positivas de la condicin de cada
mtodo que se est estableciendo como ya se describe en Material y Mtodos.
La correlacin entre ambas pruebas fue establecido por el clculo del

coeficiente de correlacin de Spearman.
Resultados
Como FISH es actualmente el "gold standard" mtodo de evaluacin de HER2 / neu amplificacin queramos examinar el desempeo de la LightCycler el
ensayo de PCR en tiempo real, medida contra la FISH en el ensayo de IHC
casos lmite. Treinta y nueve muestras de tumores de mama que anot 2 +
HER-2 para la expresin de la protena por IHC anlisis fueron seleccionados
para este estudio. Nuestros resultados (que se resumen en la Tabla 1]
muestran que de los 39 tumores, 32 (82%) se obtuvo resultados negativos para
HER-2 /neu amplificacin de genes y 4 (10%) se obtuvo resultados positivos por
PCR y FISH ambos mtodos, en general, la correlacin Entre FISH y PCR en
tiempo real los resultados que el 92% (36 de 39 tumores). De los restantes 3
tumores, 1 fue positiva por PCR en tiempo real y negativas por FISH y 2 fueron
positivas por FISH y negativas por PCR (Fig. 1].
Los resultados de nuestro estudio se resumen en la tabla de contingencia (se
ilustra en el Cuadro 2] generado por la categorizacin de los resultados de
acuerdo a los puntos de corte de la se describen en Material y Mtodos para
cada prueba. El anlisis estadstico confirm el 92% de concordancia entre los
estados de HER-2/neu evaluados por los 2 mtodos (p <0,0009, de dos caras
test de Fisher). El coeficiente de correlacin de Spearman rango fue de r = 0,45
en el intervalo de confianza del 95% (p = 0,0038, dos colas de correlacin de
Spearman).
Discusin
Treinta por ciento de pacientes con cncer de mama presentan sobreexpresin
del HER-2 y el gen HER-2 / neu estado se correlaciona con la respuesta a los
receptores especficos dirigidos tanto la terapia, as como otros tratamientos.
Por consiguiente, se ha recomendado que la rutina de deteccin de HER2 / neu amplificacin se deben realizar como parte de la evaluacin de cada
nuevo caso diagnosticado de carcinoma de mama [27]. Considerando que la
falta de evaluacin de la HER-2 / neu estado priva a los pacientes de cncer de
mama beneficioso del tratamiento, un falso diagnstico positivo de la
amplificacin de genes puede dar lugar a una innecesaria costosa terapia con
mltiples posibles efectos secundarios, incluida la disfuncin cardaca [28].
Con el fin de establecer la mejor estrategia para evaluar el HER2 / neu, numerosos estudios han comparado los resultados de los dos mtodos
de ensayo aprobados FDA. La discordancia entre la exactitud de la protena
HER-2 determinada por IHC y de amplificacin de genes determinados por FISH
ha suscitado un amplio debate en los ltimos aos. Algunos autores han
informado de una tasa de concordancia tan altas como 91% [29] o 88% [30],
pero reclamar una dbil concordancia entre los dos mtodos HercepTest
cuando la puntuacin es de 2 +, como una concordancia del 35% [30]. Del
mismo modo, el 75% de los casos discordantes (por IHC positivo y negativo por
FISH) HercepTest tuvo una puntuacin de 2 + [31]. Por otro lado, en un gran
estudio recientemente publicado [32], slo el 0,7% de los tumores IHC
negativos fueron positivas por FISH y el 5,9% IHC 3 + FISH tumores fueron
negativos por lo que hay una muy buena correlacin entre la HER-2/neu estado
evaluados por FISH y la IHC en 0, 1 + y 3 + tumores. Por lo tanto se ha
propuesto que la puntuacin de 2 +, tal como se definen en las directrices para
la HercepTest aprobado por la FDA, no deben utilizarse como un criterio para el
tratamiento de trastuzumab a menos confirmada por FISH [33].
Nuestro estudio se centr principalmente en esta frontera 2 + IHC categora. El
uso de un PCR en tiempo real cuantitativa de ensayo, encontramos un 92% de
concordancia entre FISH y PCR en tiempo real los resultados en los tumores de
mama previamente evaluados con moderado aumento de la protena HER-2
expresin (2 +) por IHC. Asimismo, se encontr que el 10% de estos tumores
fueron positivos para la amplificacin de genes por tanto FISH y PCR en tiempo
real, y el restante 90%, decidido a ser negativo. La elevada concordancia (92%)
entre el FISH y PCR en tiempo real los resultados, as como la discordancia
entre ambos de estos 2 mtodos de ensayo con el IHC, sugiere que la PCR en
tiempo real es ms preciso en la determinacin de los pacientes que son
candidatos a la verdad Trastuzumab terapia. Una forma similar de alta
concordancia entre FISH y PCR en tiempo real se haba informado
anteriormente [34, 35]. Adems, los mismos autores [34] inform de que el
92% de concordancia observada tasa ms tarde aument a 98% despus de la
incorporacin de microdissection asistida por lser en el protocolo de PCR en
tiempo real, y que hasta entonces eran capaces de reclasificar el positivo FISH,
PCR negativo Especmenes a FISH positivo, PCR positiva.
Asimismo, se encontr que dos casos negativos por FISH, exhibi polysomy del
cromosoma 17. Curiosamente, en estas dos muestras tumorales, IHC detectado
el aumento de la protena HER-2 de expresin, pero no puede discriminar entre
verdad y polysomy sobreexpresin del cromosoma 17. Reconocemos que
polysomy del cromosoma 17 puede ocurrir en una frecuencia detectable. Por lo
tanto, para la PCR cuantitativa en tiempo real ensayos, se debe tener en
cuenta la introduccin de un segundo control gen que se encuentra a una
distancia de la regin y amplifiable capaz de detectar anomalas numricas del
cromosoma 17. La determinacin del nmero de copias del cromosoma 17
podra ser til en la diferenciacin de pacientes con cncer de mama con
polysomy del cromosoma 17 y los que sobreexpresan la de la protena HER-2 y
puede ayudar a identificar subgrupos de pacientes que probablemente han
genticos y clnicos de las diferencias [21, 36 ].
Tambin es importante sealar que la prevalencia de cncer de las clulas de

raspado del tejido utilizado para la extraccin de ADN o de la inclusin de
estrategias microdissection, tendr un impacto en la PCR en tiempo real los
resultados. As, las muestras previamente considerar PCR negativo puede ser
verdaderamente PCR positiva, cuando microdissection de la pura tejido tumoral
fue contratado.
Los resultados de nuestro estudio demuestran que no puede haber
discordancia entre las ms utilizadas mtodo de ensayo (IHC) y otros mtodos
de evaluacin del estado de HER-2. Concretamente, en los casos positivos IHC
lmite, nuestros datos sugieren que la PCR en tiempo real posee un alto
potencial para mejorar la precisin en entornos clnicos para el diagnstico de
la verdadera terapia trastuzumab candidatos. Estos datos tienen que ser
confirmados por un estudio ms amplio, as como un estudio clnico diseado
para comparar la forma en que el HER-2 / neu estado evaluados por FISH y PCR
en tiempo real se correlaciona con la respuesta a la terapia con Herceptin.
Conclusin
Los resultados obtenidos por PCR en tiempo real para la amplificacin del HER2 / neu de genes en los tumores de mama son comparables con los resultados
obtenidos por FISH y sugiere que la PCR en tiempo real utilizando el LightCycler
es una alternativa viable a FISH para la evaluacin de los tumores considerados
por indeterminado IHC. Un combinado IHC y PCR en tiempo real para
determinar el enfoque de HER-2 / neu amplificacin en pacientes con cncer de
mama puede ser una estrategia eficaz y eficiente.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
Contribuciones de los autores
Andreea Nistor analizados los datos, llevado a cabo el anlisis estadstico y
escribi el manuscrito.
Yvonne Myal gener la idea para el estudio y supervis el estudio.
Peter Watson siempre aportacin intelectual y revisado crticamente el
manuscrito.
Norman Pettigrew suministrados tumor especmenes y fue responsable de
anlisis IHC.
Angelika Dawson proporcion asesoramiento e interpretacin de anlisis FISH.
Karim Tabiti ayud con la interpretacin de los datos LightCycler.
Cytokeratin 20
Producto
Publicaciones
Informacin sobre el antgeno
La citoqueratina 20 ha demostrado estar casi exclusivamente confinada al epitelio
gstrico e intestinal, el urotelio y las clulas de Merkel cutneas. La citoqueratina
es menos cida que otras citoqueratinas de tipo I y su inters radica en su
expresin tisular restringida.
En el tejido normal, la citoqueratina 20 se expresa en el epitelio intestinal, el
epitelio foveolar gstrico, en diversas clulas endocrinas, en las zonas superiores
de las glndulas pilricas, el urotelio, y en las clulas de Merkel de la epidermis.
En los tumores en los que aparece, existe una marcada diferencia en la expresin
de la citoqueratina 20 dentro de diferentes carcinomas.
Las neoplasias que expresan la citoqueratina 20 se derivan del epitelio normal que
a su vez expresan la citoqueratina 20.
Los carcinomas colorrectales expresan de forma constante la citoqueratina 20,
mientras que los adenocarcinomas gstricos expresan la citoqueratina 20 en
menor grado.
Los adenocarcinomas de la vescula biliar y de las vas biliares, los
adenocarcinomas de clulas ductales del pncreas, los tumores mucinosos
ovricos, los tumores de las clulas de Merkel y los carcinomas de clulas
transitorias tambin expresan la citoqueratina 20.
Colon humano: tincin inmunohistoqumica para citoqueratina 20 usando NCL-LCK20-561. Observe la tincin de los epiteliocitos del colon. Corte de parafina.
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Monoclonal Antibody
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CK20-L-CE-S 0.1ml NCL-L- Liquid Concentrated

CK20
Monoclonal Antibody
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CK20-L-CE-H 0.5ml NCL-L- Liquid Concentrated

CK20
Monoclonal Antibody
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Deteccin de micrometstasis por RT-PCR de citokeratina

20 y su correlacin con la sobrevida global en pacientes
portadores de cncer colorrectal
Cytokeratin 20 as a marker of tumor progression or
dissemination in patients with colorectal cancer
Cant.
Marcelo Garrido S, Pablo Ramrez V, Concepcin Risueo Aa, Eric Orellana U,

Hctor Galindo A, Manuel Alvarez Z.
Departamento de Hematologa-Oncologa, Oncologa Mdica Centro de Cncer,
Pontificia Universidad Catlica de Chile. Santiago de Chile.
a
Biloga
Direccin para correspondencia
Background: Colorectal cancer relapses or metastasizes in 30% of cases. Cytokeratin

20 is present in 95% of colorectal tumors and their metastases and could be used as a
marker to detect tumor cells. Aim: To assess the usefulness and prognostic value of
peripheral blood and bone marrow cytokeratin 20 determinations in patients with
colorectal cancer. Material and methods: Blood and bone marrow samples were
obtained from 56 patients with colorectal cancer aged 26 to 77 years (31 females)
before surgical procedure. They were followed for a mean of 22 months (range 2.9 to
72 months) after surgery. Blood and bone marrow from 45 patients without cancer
and 35 healthy subjects were used as negative controls. Messenger RNA expression of
cytokeratin 20 was studied by real time and nested polymerase chain
reaction. Results: Cytokeratin 20 was detected in 6% of controls and 41% of patients.
There was no relation between cytokeratin 20 expression and age, gender, overall
survival, tumor relapse, progression, localization or stage. Conclusions: Cytokeratin
20 determination is not useful as a marker of tumor progression or dissemination in
patients with colorectal cancer.
(Key words: Colonic neoplasms; Keratin-20; Neoplasm metastasis)
El cncer colorrectal (CC) es la cuarta causa de enfermedad metastsica o a recada
del tumor imuerte por cncer en el mundo1,2, debido a sometido previamente a ciruga.
La etapificacin basada en el examen microscpico del tumor, los ganglios regionales y
la determinacin de enfermedad metastsica (TNM) son los mejores predictores de
sobrevida3-4. Sin embargo, a pesar de una adecuada etapificacin, aquellos pacientes
sometidos a ciruga curativa sin enfermedad ganglionar tienen entre 9% y 13% de
recurrencia y entre 21% y 28% de metstasis a distancia a 5 aos5, indicando que
ellos tienen enfermedad mnima residual despus de la ciruga6.
La deteccin de micrometstasis a travs de la pesquisa de clulas tumorales
diseminadas en los ganglios linfticos, sangre perifrica (SP) o mdula sea (MO)7,
mediante inmunohistoqumica (IHQ), puede mejorar la etapificacin, contribuir a una
mejor prediccin del pronstico8 y de esta forma modificar la conducta teraputica. Sin
embargo, la sensibilidad de deteccin vara dependiendo de la tcnica de IHQ y el
protocolo utilizado. Por esta razn, el uso de tcnicas altamente sensibles basadas en
la amplificacin por transcripcin reversa acoplada a reaccin en cadena de polimerasa (RT-PCR) se est utilizando con mayor frecuencia9, logrando identificar una clula
tumoral en 109 clulas mononucleares10.
Para identificar clulas tumorales colorrectales se ha usado como marcador

citoqueratina 20 (CK20)11, un subtipo de filamento intermedio del citoesqueleto celular
que se expresa predominantemente en los tejidos epiteliales (gstrico, intestinal,
ureteral y clulas de Merkel) y cuya expresin se mantiene incluso despus de la
transformacin neoplsica12. En el adenocarcinoma de colon 95,6% de los casos tiene
expresin de CK2013.
La relevancia pronostica de las clulas tumorales diseminadas detectadas por RT-PCR
de CK20 en tumores colorrectales, ha sido descrita por varios grupos de
investigadores. Desde que Burchill propuso el uso de CK20 como marcador para
detectar clulas tumorales gastrointestinales circulantes mediante RT-PCR14, varios
autores han realizado estudios similares, con resultados controversiales: algunos
encontraron asociacin entre CK20 por RT-PCR y el estadio tumoral, grado histolgico y
recurrencia; otros han reportado que no hay correlacin o que su deteccin no es
especfica de clulas tumorales15-25. Estas discrepancias en los resultados pueden
explicarse debido a la heterogeneidad inter e intratumoral en la expresin proteica y de
ARNm de CK20, o bien a la expresin gnica de CK20 en clulas no tumorales26,27.
Dado la heterogeneidad de resultados y la importancia de disponer de un marcador
pronstico de sobrevida y recurrencia, desarrollamos este estudio prospectivo en
muestras preoperatorias de SP y MO de pacientes con CC, mediante RT-PCR de CK20,
para determinar su utilidad como predictor de recurrencia tumoral y SG.
PACIENTES Y MTODOS
Pacientes. Fueron incluidos 56 pacientes portadores de CC que ingresaron al Centro de
Cncer de la Pontificia Universidad Catlica de Chile entre enero de 1997 y agosto de
1999. Ellos fueron etapificados segn la clasificacin TNM 5a edicin y se obtuvieron
muestras de MO y SP previo a la intervencin quirrgica o al inicio de tratamiento con
quimioterapia o radioterapia, segn correspondiera por la ubicacin y estadio del tumor
primario. La muestra de MO se obtuvo de la cresta ilaca pstero-superior y la de SP de
la vena del antebrazo, previo consentimiento informado del paciente. El estudio fue
aprobado por nuestro comit de tica.
Controles. Como controles negativos se analizaron muestras de MO de pacientes (n
=45) no oncolgicos y SP de donantes sanos (n =35). Como controles positivos se
utilizaron muestras de tumores digestivos.
Extraccin de ARN total. La fraccin de clulas mononucleadas se obtuvo por
centrifugacin en gradiente de densidad a travs de Lymphoprep (Nycomed Pharma
AS, Oslo, Noruega). Las clulas extradas de la interfase fueron lavadas con
solucin buffer fosfato salina (PBSlx) y guardadas a -20C en guanidina isotiocianato
(GTC) hasta su estudio. El ARN total fue extrado de las clulas por el mtodo de
Chomzynsky y Sachii28 y se resuspendi en 35 yd de agua libre de RNasas. Su
concentracin se determin por espectrofotometra a 260 nm.
Transcripcin reversa (RT). 2,0 Lig de ARN fueron sometidos a 70C por 10 min e
inmediatamente enfriados en hielo. El ADN complementario (cADN) fue sintetizado en
20 l de buffer TR (50 mM Tris-HCl pH=8,0) que contena 75 mM KCl, 10 mM DTT, 3
mM MgCl2, 2,5 M de partidores hexmeros random, 500 M de cada deoxinucle-tido
(dNTPs) y 200 U de transcriptasa reversa MMLV (Promega, Madison, WI, USA). La
mezcla fue incubada a 20C por 5 min, 37C por 60 min y 94C por 5 min.
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). 10l de cADN fueron amplificados en 50

fxl, mediante PCR para CK20 (673 pb) mediante 30 ciclos de 94C por 1 min, 65C por
1 min y 72C por 1 min, seguido de una extensin final de 72C por 10 min, usando
los partidores CK-1 y CK-4 (Tabla 2).
Nested PCR o PCR anidado. Para aumentar la sensibilidad y especificidad de la

reaccin, 1 l de esta amplificacin fue sometido a una segunda amplificacin en 25 l,
por PCR anidado para CK20 (317 pb) siguiendo el mismo programa, usando los
partidores CK-2 y CK-3 (Tabla 3). Un l de la primera amplificacin para CK20 fue
amplificado en 25 l por PCR para beta-2-microg-lobulina (201 pb), con el mismo
programa de amplificacin que CK20, con los partidores AS-53 y AS-54 (Tabla 2).
Todas las reacciones de amplificacin se hicieron en buffer PCR (50 mM Tris-HCl pH

=9) que contena 50 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 200 M de cada dNTP, 0,4 M de cada
partidor para CK20 y 0,2 M para beta-2-microglobulina y 1,25 U de Taq ADN
polimerasa (Promega, Madison, WI, USA).
La ausencia de contaminacin se verific mediante RT-PCR de controles negativos
(todos los reactivos excepto cADN).
Todos los fragmentos amplificados fueron analizados por electroforesis en geles de
agarosa al 2%, teidos con bromuro de etidio. El peso molecular fue determinado por
comparacin con un marcador de pesos moleculares para ADN, Ladder DNA (Life and
Technology).
Estadstica. El objetivo primario fue correlacionar el estado de CK20 por RT-PCR, con la
sobrevida global (SG) y la sobrevida libre de recurrencia (SLR). Como objetivos
secundarios evaluamos la SG de la cohorte, sobrevida segn diagnstico (colon o
recto), estadio tumoral y sexo. Tambin se estudi la correlacin entre la positividad de
CK20 y el lugar de obtencin de la muestra (SP o MO) y la probabilidad de recada
tumoral en pacientes con cnceres colorrectales estadios II y III.
El anlisis univariado para SG se realiz con las variables edad de diagnstico, estadio
tumoral, estado de CK20 y lugar del primario. Para recada se analizaron las mismas
variables por regresin logstica. El anlisis multivariado se efectu por modelo de Cox
considerando las mismas variables anteriormente mencionadas, en relacin a SG y
SLR.
Las curvas de sobrevida se realizaron segn el mtodo de Kaplan-Meier, y se
compararon segn el mtodo de Log-rank.
Las comparaciones entre variables categricas se realizaron por mtodo de chi
cuadrado o test exacto de Fisher, con valor p significativo <0,05, de dos colas.
RESULTADOS
Un total de 56 pacientes con diagnstico de CC se dividieron en las siguientes
categoras: estadio II, 8 pacientes; estadio III, 36 pacientes y estadio IV, 12 pacientes.
Del total, 21 presentaron cncer de recto y 35 cncer de colon; hubo 25 pacientes de
sexo masculino y 31 de sexo femenino. El promedio de edad fue de 55 aos y la
mediana de seguimiento de 22 meses (2,9-72 meses). El ARNm de CK20 fue detectado
en 5 controles (6%) y en 23 pacientes (41%) (Tabla 3), de los casos CK20 positivos, 3
se encontraban en estadio II, 16 en estadio III y 4 en estadio IV (Tabla 4) (Figura 1).
La SG estimada a 6 aos fue de 42% con 21 pacientes fallecidos por cncer, no se
detectaron diferencias estadsticamente significativas en relacin al lugar del primario
(colon o recto) (p =0,8) (Figura 2); lugar de obtencin de la muestra (MO o SP) y el
estado de citokeratina 20 (p =0,2) (Figura 3). Slo los distintos estadios tumorales
mostraron diferencias en la SG (p =0,001) (Figura 4). Sin embargo, al relacionarlo con
la positividad para CK20 no se encontr relacin estadstica entre ellas (p =0,58)
(Tabla 4).
Figura 1. Muestras de sangre perifrica de

pacientes con cncer colonectal sometida a
RT-PCR para CK20.
Figura 2. Sobrevida global segn lugar del

tumor primario, rectal o colnico.
Figura 3. Sobrevida global segn expresin

de CK20 en pacientes con cncer
colorrectal.
Figura 4. Sobrevida global segn estadio

en pacientes con cncer colorrectal.
En el anlisis de los subgrupos, los pacientes con estadios II y III (44 pacientes), que
corresponden al grupo de pacientes curables por el tratamiento combinado de
quimioterapia y ciruga, no demostr diferencias estadsticamente significativas entre la
positividad de CK20 y la recurrencia (p =0,7).
El anlisis univariado no mostr influencia de las variables en SG, como tampoco el

anlisis por regresin logstica en recada en el grupo de pacientes con estadio tumoral
II y III. El anlisis multivariado que incluy las variables edad, lugar del tumor primario
y estado de CK20, para SG y recada tumoral, no demostr influencia significativa de
ninguna de las covariables.
DISCUSIN
En la ltima dcada, el manejo del CC ha experimentado un considerable desarrollo
debido a los avances en las tcnicas quirrgicas, prolongacin de la sobrevida con
esquemas de quimioterapia ms activos y aumento en el conocimiento de los cambios
moleculares asociados a la carcinognesis y progresin tumoral. Sin embargo, a pesar
de una reseccin curativa, 21%-28% desarrolla metstasis^ lo que hace necesario
mejorar la sensibilidad y especificidad de las tcnicas de etapificacin para detectar
pacientes con alto riesgo.
La deteccin de micrometstasis y factores moleculares o histolgicos de mal
pronstico han sido reas de investigacin para conocer los pacientes con mayor riesgo
de recada y muerte9,10,29,30.
La deteccin de micrometstasis a travs de la pesquisa de clulas tumorales
diseminadas se ha realizado en ganglios linfticos, SP o MO7, mediante IHQ, IHQ con
seleccin y anlisis de imgenes automatizado y tcnicas de biologa molecular ms
sensibles y especficas como RT-PCR9,10.
Los factores histolgicos o moleculares de mal pronstico son el grado histolgico,
invasin linfovascular, alta frecuencia de inestabilidad microsatelital (MSI-H), prdida
allica del cromosoma 18q y alta actividad de timidilato sintetasa. Sin embargo,
actualmente se considera que la deteccin del perfil de activacin o inhibicin de miles
de genes detectados en un chip (microarray) es la forma ms exacta para evaluar el
riesgo de recunencia y muerte de los pacientes en muchos tipos de tumores, incluso,
en fase de aplicacin clnica en cncer de mama y en CC29,30.
Debido a que la tecnologa del microarray es compleja y costosa para su aplicacin en
nuestro medio y a que la deteccin de citokeratinas por IHQ en MO es un factor
pronstico en otros tumores como cncer de mama, se evalu el valor pronstico de la
deteccin de clulas tumorales diseminadas a travs CK20 en pacientes con CC por RTPCR yNested PCR.
En CC la deteccin de ARNm de CK20 se ha relacionado con un peor pronstico, ya que
su presencia en SP o MO sugiere un mayor avance en el estadio tumoral, mayor
nmero de recurrencias y peor SG17,19,23,25. Sin embargo, otras publicaciones con
metodologa similar muestran resultados contradictorios20-22,24.
En este estudio se mejor la sensibilidad y especificidad de la tcnica de amplificacin,
complementando al RT-PCR con el uso de nested PCR. Se detect CK20 en 41% de los
56 pacientes lo que es concordante con otros estudios que han reportado frecuencias
entre 30% y 47%31-33.
En el anlisis de subgrupos la deteccin de CK20 fue de 37,5% en estadio II, 44,4% en
estadio III y 33,3% en estadio IV. En los estudios publicados la dispersin de
resultados de CK20 positiva por estadio es muy amplia probablemente debido a la

seleccin de pacientes, diferencias en la obtencin de las muestras y el uso de distintas
tcnicas o equipos al realizar RT-PCR (Tabla 1).
Los pacientes con metstasis expresaron CK20 en 33,3%. Wharton34 ha descrito que
en el 20%-40% de los casos no se detecta CK20 por RT-PCR en sangre debido a
variaciones en la expresin de ARNm intertumoral, lo que hara variar los niveles de
deteccin entre distintos pacientes. Estudios experimentales de metstasis han
demostrado que su circulacin ocurre en conglomerados de distintos tamaos lo que
puede provocar una variacin de muestra a muestra y limitar el valor de la deteccin;
para evitar esto, se ha usado PCR cuantitativo, la deteccin de 2 marcadores
simultneos (CK20 y antgeno carcinoembrionario), seleccin inmunomagntica de
clulas epiteliales con posterior PCR cuantitativa de CK2035 y el uso de mltiples
muestras por paciente logrando aumentar el porcentaje de deteccin a 70%-80%36-37.
La presencia de inhibidores en algunos tejidos y fluidos, la menor expresin de CK20
en la metstasis y la presencia de clones pobremente diferenciados que no expresan el
marcador pueden explicar los falsos negativos38.
Los falsos positivos en el grupo control fueron 6%, lo que contribuy a disminuir la
especificidad del mtodo, el usarnested PCR puede aumentar este porcentaje al
aumentar la sensibilidad de la tcnica. En otros estudios de CK20 con RT-PCR el
porcentaje de falsos positivos oscila entre 5% y 100% (Tabla 1). Entre las variables
que pueden determinarlo estn la contaminacin de las muestras con clulas
epidrmicas, transcripcin ilegtima de CK20, pseudogenes, las condiciones del
termociclador38 y la expresin de CK20 en clulas hematopoyticas26. Al respecto hay
evidencia que demuestra una mayor transcripcin de ARNm de CK20 en tejidos
normales y una menor regulacin en tejidos tumorales27.
El seguimiento de la cohorte mostr SG y SLR similar a lo reportado en series
aleatorizadas, demostrando la efectividad de los tratamientos aplicados. En estadios
localizados (estadios II y III) no se logr confirmar el valor predictivo en recurrencia y
muerte de CK20. Las posibles explicaciones son: que las clulas tumorales circulantes
detectadas no necesariamente sean responsables del desarrollo de metstasis, que
circulen en conglomerados, que sean destruidas por mecanismos inmunolgicos39, a
una variacin en la expresin intratumoral de CK20 o a que la tcnica empleada tenga
tan alta sensibilidad que detecte clulas que no tengan trascendencia clnica. Al
respecto puede plantearse que exista un umbral ptimo de deteccin. Koch public un
estudio en 2006 donde incluy 90 pacientes en etapa II y mostr que CK20 era un
predictor independiente de SLR, pero no se analiz SG*. En nuestra cohorte el nmero
de pacientes en esta etapa es muy pequeo para hacer un anlisis comparativo.
Ya que utilizamos un nmero considerable de pacientes y controles, depuramos la
tcnica de toma de muestra, aumentamos la sensibilidad del RT-PCR con el nested PCR
y usamos un marcador altamente expresado en CC, podemos plantear que CK20 no
sera predictor de recurrencia o muerte en CC.
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Recibido el 14 de mayo, 2007. Aceptado el 14 de diciembre, 2007.

Correspondencia a: Dr. Manuel Alvarez Z. Centro de Cancer, Pontificia Universidad
Catlica de Chile. Diagonal Paraguay 319, Santiago, Chile. Fono: 56-2-3546919. Fax:
56-2-247232. E mail: malvarez@med.puc.cl
RT-PCR y evaluacin inmunohistoqumica de los ganglios linfticos

centinela despus de mapeo en vivo con azul patente V en pacientes
con cncer de colon.
Traduccin automtica
Resumen
Acerca de este artculo
AUTORES Kelder W , van den Berg A , van der Leij J , Bleeker W , Tiebosch
AT , Grond JK - More
CATEGORA Estudio primario
REVISTA Scandinavian journal of gastroenterology
AO 2006
ENLACES Pubmed , Sitio web del Publicador
Este artculo est incluido en 1 Systematic Review
OBJETIVO:
estado de los ganglios linfticos es el factor predictivo ms importante en el
tratamiento del cncer colorrectal. Como ganglio linftico centinela (SLN)
biopsia podra eclipsar la etapa II del cncer de colon, podra tener
consecuencias teraputicas en el futuro. Se investig la viabilidad in vivo de
deteccin del GC con azul patente V tinte y evaluamos ganglionar
microestadificacin y ultrastaging mediante inmunohistoqumica citoqueratina
y reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Material y mtodos: En 30 pacientes consecutivos operados de cncer de
colon, la inyeccin subserosa con azul patente se utiliz para la deteccin de
ganglio centinela en cuatro hospitales diferentes bajo la supervisin de un
coordinador regional. En la bsqueda de micrometstasis ocultas, cada SLN fue
examinado en tres niveles. En SLNs tumores negativos a la rutina hematoxilinaeosina (H & E) examen (pN0) se realiz CK8/CK18 inmunohistoqumica (IHC) y
RT-PCR para el antgeno carcinoembrionario (CEA).
RESULTADOS:
Se obtuvo xito en 29 de 30 pacientes (97%). El ganglio centinela fue negativo
en 18 pacientes detectados por H & E y de IHC. En 16 pacientes la no-GLC
tambin fue negativo, lo que lleva a un valor predictivo negativo del 89% y una
precisin del 93%. Eclipsando ocurri en 10 pacientes (33%) - 7 por IHC y 3

mediante RT-PCR. Drenaje linftico aberrante se observ en 3 pacientes (10%).
CONCLUSIONES:
El concepto SLN en el carcinoma de colon usando azul patente V es viable y
precisa. Esto lleva a eclipsar del estado ganglionar en el 33% de los pacientes
cuando IHC y tcnicas de PCR se combinan. Por lo tanto, el valor clnico de SLN
debe ser objeto de nuevos estudios.
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Citoqueratinas

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