I.

PENDAHULUAN
Menurut perkiraan, kira-kira 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh
tertumbuhan (atau kira-kira 1x10 ton/tahun) diubah menjadi flavonoid atau senyawa
yang berkaitan erat dengannya (Smith,1972). Sebagian besar tanin pun berasal dari
flavonoid. Jadi, flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam yang terbesar.
Sebenarnya, flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau sehingga pastilah
ditemukan pula pada setiap telaah ekstrak tumbuhan. Oleh karena itu, perlu kiranya
para kimiawan, biokimiawan, fisiologiwan tumbuhan, dan biologiwan umumnya
mengetahui cara mengenali, mengisolasi, dan mengidentifikasi bahan alam tersebut
dalam bentuknya yang berbagai-bagai itu. Pembahasan berikut ini dirancang untuk
menyajikan pengantar dasar flavonoid bagi pendatang baru dalam bidang ini.
1.1 Keragaman struktur flavonoid-umum
Dalam tumbuhan, aglikon flavonoid (yaitu flavonoid tanpa gula terikat) terdapat
dalam berbagai bentuk struktur. Semuanya mengandung 15 atom karbon dalam inti
dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C-C-C, yaitu dua cincin aromatic yang
dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tak dapat membentuk cincin
ketiga. Agar mudah, cincin diberi tanda A, B, dan C; atom karbon dinomori menurut
system penomoran yang menggunakan angka biasa untuk cincin A dan C, serta angka
beraksen untuk cincin B (lihat gambar 1.

Gambar 1
Semua varian flavonoid saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama, yang
memasukkan prazat dari alur sikimat dan alur asetat-malonat (Hahlbrock &
grisebach, 1975; Wong, 1976), flavonoid pertama dihasilkan segera setelah kedua alur

itu bertemu (gambar 1.1). Sekarang, flavonoid yang dianggap pertama kali terbentuk
pada biosintesis ialah khalkon (Hahlbrock, 1980), dan semua bentuk lain diturunkan
darinya melalui berbagai alur (gambar 1.1). Modifikasi flavonoid lebih lanjut
mungkin terjadi pada berbagai tahap dan menghasilkan: penambahan (atau
pengurangan) hidroksilasi; metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoid; isoprenilasi
gugus hidroksil atau inti flavonoid; metilenasi gugus orto-dihidroksil; dimerisasi
(pembentukan biflavonoid); pembentukan bisulfat, dan yang terpenting, glikosilasi
gugus hidroksil (pembentukan flavonoid O-glikosida) atau inti flavonoid
(pembentukan flavonoid C-glikosida).

Gambar 1.1
1.2 Flavonoid O-glikosida
Flavonoid biasanya terdapat sebagai flavonoid O-glikosida; pada senyawa tersebut
satu gugus hidroksil flavonoid (atau lebih) terikat pada satu gula (atau lebih) dengan
ikatan hemiasetal yang tak tahan asam (misalnya (2)). Pengaruh glikosilasi
menyebabkan flavonoid menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air
(cairan); sifat terakhir ini memungkinkan penyimpanan flavonoid di dalam vakuol sel
(disinilah biasanya flavonoid berada). Walaupun gugus hidroksil pada setiap posisi
dalam inti flavonoid dapat diglikosilasi, kenyataannya hidroksil pada tempat tertentu
mempunyai peluang yang lebih besar untuk terglikosilasi ketimbang tempat-tempat
lain, misalnya 7-hidroksil pada flavon, isoflavon, dan dihidroflavon, 3-(dan 7-)
hidroksil pada flavonol dan dihidroflavonol; dan 3- (dan 5-) hidroksil dalam
antosianidin. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat, walau pun

galaktosa, ramnosa, xilosa, dan arabinosa sering juga terdapat. Gula lain yang kadangkadang ditemukan ialah alosa, manosa, fruktosa, apiosa, dan asam glukuronat serta
galakturonat. Disakarida sering juga terdapat terikat pada flavonoid, misalnya
soforosa (2-O--D-glukosil-D-glukosa), gentibiosa (6-O--D-glukosil-D-glukosa),
rutinosa (6-O-a-L-ramnosil-D-glukosa), neohesperidosa (2-O-a-L-ramnosil-Dglukosa), dan kadang-kadang tri atau bahkan tetrasakarida. Sudah diakui bahwa dalam
tumbuhan O-glikosilasi (dan metilasi) terjadi sebagai salah satu tahap akhir pada
biosintesis dan dikatalisis oleh enzim yang sangat khas. Ada kalanya glikosida
mengalami modifikasi lebih lanjut, yaitu asilasi. Glikosida terasilasi mempunyai satu
gugus hidroksil gula (atau lebih) yang berkaitan dengan asam seperti asam asetat atau
asam ferulat. Dalam hal ini, ikatannya ikatan ester; asam teresterifikasi secara efektif
dengan gula seperti pada contoh (3). Cakupan flavonoid O-glikosida yang terdapat di
alam telah diikhtisarkan (Harborne dkk., 1975) dan baru-baru ini telah diperbarui
(Harborne dan Mabry, 1982).

Gambar (2) ; Gambar (3)

1.3 Flavonoid C-glikosida
Gula dapat juga terikat pada atom karbon flavonoid dan dalam hal ini gula tersebut
terikat langsung pada inti benzene dengan suatu ikatan karbon-karbon (misalnya (4))
yang tahan asam (bandingkan dengan O-glikosida). Glikosida yang demikian
disebut C-glikosida. Sekarang gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada
atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoid. Jenis gula yang terlibat ternyata jauh
lebih sedikit ketimbang jenis gula pada O-glikosida, biasanya dari jenis glukosa yang
paling umum (misalnya viteksin, orientin), dan juga galaktosa (misalnya apigenin 8C-galaktosida), ramnosa (misalnya violantin), xilosa (misalnya visenin-1), dan
arabinosa (misalnya skaftosida). Jenis aglikon flavonoid yang terlibat pun sangat
terbatas. Jadi, walaupun isoflavon, flavonon, dan flavonol kadang-kadang terdapat
yang paling lazin ditemukan. Seperti Oo-glikosida, C-glikosida ternyata sering

mengalami O-glikosilasi lebih lanjut (pada hidroksil gula atau fenol) atau mengalami
asilasi (biasanya pada hidroksil gula).

Gambar (4)
1.4 Flavonoid sulfat
Golongan flavonoid lain yang mudah larut dalam air yang mungkin ditemukan hanya
flavonoid sulfat. Senyawa ini mengandung satu ion sulfat, atau lebih, yang terikat
pada hidroksil fenol atau gula. Secara teknis senyawa ini sebenarnya bisulfate karena
terdapat sebagai garam, yaitu flavon-O-SOK. banyak yang berupa glikosida
bisulfate, bagian bisulfate terikat pada hidroksil fenol yang mana saja yang masih
bebas atau pada gula (Harborne, 1977). Tampaknya senyawa ini terdapat terbatas
hanya pada angiospermae dan terutama pada angiospermae yang mempunyai
hubungan ekologi dengan habitat air (Harborne, 1975).
1.5 Biflavonoid
Seperti yang ditunjukkan oleh namanya; biflavonoid adalah flavonoid dimer, walau
pun prosianidin dimer (satuan dasarnya katekin) biasanya tidak dimasukkan ke dalam
golongan ini. Flavonoid yang biasanya terlibat ialah flavon dan flavonon yang secara
biosintesis mempunyai pola oksigenasi yang sederhana 5,7,4 (atau kadang-kadang
5,7,3,4) dan ikatan antar-flavonoid berupa ikatan karbon-karbon atau (kadangkadang) ikatan eter (Geiger & Quinn, 1975). Monomer flavonoid yang digabungkan
menjadi biflavonoid dapat berjenis sama atau berbeda, dan letak ikatannya berbedabeda. Jenis ikatan karbon-karbon yang lebih sering ditemukan ialah: ikatan -6,8
(golongan amentoflavon, misalnya (5)), ikatan -6,3 (golongan robustaflavon), dan

ikatan 3,8. Jenis ikatan eter ialah: ikatan -6,4 (golongan hinokiflavon, misalnya (6))
dan ikatan -3,4 (golongan oknaflavon).

Gambar (5) amentoflavon

Gambar (6) hinokiflavon

Banyak sifat fisika dan kimmia biflavonoid menyerupai sifat monoflavonoid
pembentuknya (misalnya spectrum UV-tampak, uji warna, dll), dan akibatnya,
kadang-kadang biflavonoi sukar dikenali. Meski demikian, kromatografi pada silica
gel dapat membedakan monomer dan dimer dengan jelas (Chexal dkk, 1970) dan
dapat dipastikan dengan cara peleburan basa atau dengan spektroskopi massa.
Biflavonoid jarang ditemukan sebagai glikosida, dan penyebarannya terbatas, terdapat
terutama pada gimnospermae.
1.6 Aglikon flavonoid yang aktif-optik
Dari struktur pada gambar 1.1 jelas tampak bahwa sejumlah aglikon flavonoid
mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan demikian menunujukkan keaktifan
optic (yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar). Yang termasuk dalam golongan
flavonoid ini ialah flavanon, dihidroflavanol, katekin, pterokarpan, rotenoid, dan
beberapa biflavonoid. Putaran (menurut perjanjian pada 589,3 nm, garis D natrium)
aglikon flavonoid alam berkaitan dengan stereokimia-mutlak flavonoid. Jadi, (-)flavanon putar kiri, yang normal, mempunyai konfigurasi S pada C-2, yaitu
mempunyai konfigurasi 2S, sedangkan (+)-flavanon mempunyai konfigurasi 2R; pada

konfigurasi ini proton dan cincin B dapat dipertukarkan (lihat Cahn & Ingold, 1951
dan Cahn dkk, 1956 untuk perincian tata nama dan kaidah kekiralan).
1.7 Pedoman penyebaran jenis flavonoid di alam
Flavonoid merupakan kandungan khas tumbuhan hijau dengan mengecualikan alga
dan hornwort. Flavonoid sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk
daun, akar, kayu, kulit, tepung saro, nectar, bunga, buah buni, dan biji. Hanya sedikit
saja catatan yang melaporkan adanya flavonoid pada hewan, misalnya dalam kelenjar
bau berang-berang, propolis (sekresi lebah), dan di dalam sayap kupu-kupu; itu pun
dengan anggapan bahwa flavonoid tersebut berasal dari tumbuhan yang menjadi
makanan hewan tersebut dan tidak dibiosintesis di dalam tubuh mereka (Harborne,
1967).
Segi penting dari penyebaran flavonoid dalam tumbuhan ialah adanya kecenderungan
kuat bahwa tetumbuhan yang secara taksonomi berkaitan akan menghasilkan
flavonoid yang jenisnya serupa. Jadi, informasi yang berguna tentang jenis flavonoid
yang mungkin ditemukan pada tumbuhan yang sedang ditelaah sering kali dapat
diperoleh dengan melihat pustaka mengenai telaah flavonoid terdahulu dalam
tumbuhan yang berkaitan, misalnya dari marga atau suku yang sama.
II. ISOLASI DAN CARA ANALISIS
1. Sifat kelarutan flavonoid
Aglikon flavonoid adalah polifenol dank arena itu mempunyai sifat kimia senyawa
fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi harus diingat,
bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yang
akan terurai (lihat bab mengenai spectrum serapan UV-tampak). Karena mempunyai
sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih, atau suatu gula, flavonoid merupakan
senyawa polar, dan seperti kata pepatah lama suatu golongan akan melarutkan
golongannya sendiri, maka umumnya flavonoid larut cukupan dalam pelarut polar
seperti etanol (EtOH), methanol (MeOH), butanol (BuOH), aseton, dimetilsulfoksida
(DMSO), dimetilformamida (DMF), air, dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada
flavonoid (bentuk yang umum ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoid lebih
mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air
merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang

polar seperti isoflavon, flavonon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi
cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.
2. Memilih, menyiapkan, dan mengekstraksi bahan tumbuhan
Tumbuhan seghar merupakan bahan awal yang ideal untuk menganalisis flavonoid,
walau pun cuplikan kering yang telah disimpan hati-hati selama bertahun-tahun
mungkin masih tetap dapat memberikan hasil yang memuaskan. Contoh herbarium
yang telah disimpan lebih dari 100 tahun ternyata masih dapat digunakan untuk
menganalisis flavonoid (Harborne, 1976b), bahkan flavonoid telah diisolasi dari fosil
yang berumur 25 juta tahun (Niklas & Gianassi, 1978). Tetapi, dalam bahan tumbuhan
yang sudah lama, ada kecenderungan glikosida diubah menjadi aglikon karena
pengaruh fungi, dan aglikon yang peka menjadi teroksidasi.
Bila menggunakan bahan tumbuhan segar, setelah cuplikan dipilih sebagai tanda
bukti, disarankan untuk mengeringkan sisanya cepat-cepat (untuk mencegah kerja
enzim) dalam tanur bersuhu kira-kira 100C. selanjutnya, bahan tumbuhan yang telah
dikeringkan dapat disimpan dalam kantung plastic yang ditutup rapat untuk digunakan
kemudian, atau digiling menjadi serbuk halus untuk diekstraksi dengan pelarut. Bila
bahan tumbuhan yang sudah dikeringkan itu sukar diserbuk dengan lumpang dan alu,
bahan dapat dimaserasi dalam pelumat dengan atau tanpa pelarut yang akan
digunakan untuk mengekstraksi. Sering kali, merupakan tindakan yang bijaksana bila
kkita mengekstraksi cuplikan bahan tumbuhan yang belum dikeringkan untuk
kemudian dipakai pada pemeriksaan secara kromatografi untuk melihat apakah proses
peengeringan mengubah susunan flavonoid atau tidak.
Setelah menimbang sebagian dari bahan tumbuhan yang telah digiling, ekstraksi
paling baik dilakukan dalam dua tahap: pertama kali dengan MeOH:HO (9:1) dan
kedua kali dengan MeOH:HO (1:1). Pada setiap tahap pelarut ditambahkan
secukupnya sehingga terbentuk bubur cair, lalu campuran dibiarkan selama 6-12 jam.
Penyaringan untuk memisahkan ekstrak dari bahan tumbuhan dapat dilakukan dengan
cepat dengan memakai sumbat wol kaca atau kapas pasa leher corong, atau lebih baik
dengan mengisap memakai corong Buchner (kertas saring yang disarankan ialah
Whatman no. 54 atau 541, atau yang setara). Kedua ekstrak kemudian disatukan dan
diuapkan sampai volumnya menjadi sepertiga volum asal, atau sampai hamper semua
MeOH menguap. Lalu, ekstrak-air yang diperoleh dapat dibebaskan dari senyawa
yang kepolarannya rendah seperti lemak, terpena, klorofil, xantofil, dan lain-lain

dengan ekstraksi (dalam corong pisah) dengan heksana atau klloroform. Ekstraksi
harus dilakukan beberapa kali dan ekstrak kemudian disatukan. Walau pun tidak
mungkin mengandung flavonoid, ekstrak yang disatukan tersebut jangan dibuang
sebelum diperiksa secara kromatografi. Lapisan air yang telah diekstraksi dengan
pelarut dan mengandung bagian terbesar flavonoid lalu diuapkan sampai kering pada
tekanan rendah dengan menggunakan penguap-putar.
Cara di atas cocok untuk ekstraksi kebanyakan flavonoid, tetapi tidak untuk antosianin
atau flavonoid yang kepolarannya rendah (yang kadang-kadang terdapat pada bagian
luar tumbuhan). Untuk antosianin, daun segar atau daun bunga jangan dikeringkan
tetapi harus digerus dengan MeOH yang mengandung 1% HCl pekat. Ekstraksi
hamper segera terjadi seperti terbukti dari warna larutan, dan kromatografi atau
analisis spektroskopi ekstrak harus dilakukan segera setelah ekstraksi, yaitu untuk
memperkecil kemungkinan terjadinya hidrolisis glikosida. Flavonoid yang
kepolarannya rendah dan yang kadang-kadang terdapat pada bagian luar tumbuhan
padang pasir, paku, dan lain-lain, paling baik diisolasi hanya dengan merendam bahan
tumbuhan segar dalam heksana atau eter selama beberapa menit. Ekstrak yang
diperoleh mengandung juga lilin dan lemak yang dapat dipisahkan lebih lanjut dengan
kromatografi.
3. Kromatografi kertas dan cara mengenali flavonoid
Kromatografi kertas (KKt) mungkin merupakan cara kromatografi yang paling umum
dan berguna yang tersedia bagi kimiawan flavonoid pada saat ini. Karena alasan
tersebut, cara ini akan dibahas agak terinci di sini. Analisis pendahuluan ekstrak
tumbuhan untuk menguji adanya flavonoid tepat sekali dilakukan dengan cara ini,
sedangkan pemisahan biasanya dilakukan dengan kromatografi kertas dwiarah (KKt
2A), menurun.
3.1 Cara umum
Kertas yang disarankan untuk tujuan ini ialah kertas Whatman 3MM (46x57 cm) atau
yang setara. Kertas harus dilipat seperti yang diperlihatkan pada gambar 2.1 (a) agar
dapat dipasang dalam wadah untuk kromatografi turun. Kemudian, larutan ekstrak
tumbuhan ditotolkan pada kertas di suatu titik kira-kira 8 cm dari tepi kertas dan 3 cm
dari lipatan akhir (gambar 2.1 (a1)). Ekstrak harus ditotolkan merata pada lingkaran
bergaris tengah 3 cm yang berpusat pada titik itu. Pengeringan bercak dibantu dengan

menggunakan pengering rambut. Jumlah ekstrak yang ditotolkan dapat merupakan

factor kritis yang menentukan mutu pola flavonoid yang terjadi kemudian. Bila
ekstrak ditotolkan terlalu sedikit, bercak flavonoid yang terbentuk mungkin sukar
dideteksi, sedangkan bila terlalu banyak akan terjadi pencorengan dan resolusi jadi
jelek. Bila ragu-ragu, suatu petunjuk umum yang baik ialah menotolkan sejumlah
ekstrak yang diperoleh dari 50-100 mg bahan tumbuhan kering.
Bejana kromatografi yang ukurannya sesuai untuk lembaran besar dapat dibeli,
misalnya chromatatank Panglass Shandon (serba-kaca dan disarankan) dan
choramatocap Research Specialties Company (Berkley) atau dibuat sendiri (Mabry
dkk, 1970). Bejana serba-kaca yang lebih kecil dapat dipakai bila lembar kertas dibagi
dua atau empat sebelum ekstrak ditotolkan. Tetapi, bila hal ini dilakukan, ukuran
bercak yang bergaris tengah 3 cm dan jumlah yang ditotolkan harus disesuaikan.

Gambar 2.1 Cara Kromatografi Kertas

Untuk penilaian pendahuluan kandungan flavonoid suatu ekstrak, sudah menjadi
kebiasaan umum utuk menggunakan pengembang berakohol pada pengembangan
pertama pada kromatografi kertas, misalnya BAA atau TBA, menurut rah tepi kertas
terpanjang. Garis depan pengembang akan mencapai ujung lembaran kertas dalam
waktu 12-30 jam, ini tergantung pada suhu kamar (diperlukan kira-kira 50-60 ml
pengembang per lembar). Kemudian, kertas diangkat dari bejana kromatografi dan
dikeringkan di dalam lemari asam. Lalu, bagian kromatogram yang dilipat digunting
dan kromatogram dilipat kembali untuk kromatografi-turun menurut arah kedua
(gambar 2.1 (b)). Untuk itu biasanya digunakan pengembang berupa larutan dalam air

seperti larutan asam asetat 15%, dan harus dipakai bejana lain. Waktu yang
diperlukan untuk pengembang arah kedua ini 4-6 jam. Untuk antosianin, pengembang
yang setara yang disarankan ialah (Harborne, 1973) BAA atau Bu/HCl untuk arah
pertama dan HCl 1% untuk arah kedua.
Kebanyakan flavonoid tidak terlihat pada aras yang dijumpai pada kromatogram
kertas, kecuali antosianin (bercak jingga sampai lembayung yang menjadi biru bila
diuapin NH) dan khalkon, auron, dan 6-Hidroksi flavonol (kuning). Karena alas an
tersebut, untuk mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366 nm,
bukan 254 nm). Untuk memeriksa, sinar UV dapat ditempatkan diatas atau dibawah
kromatogram, tetapi kepekaan yang lebih besar dicapai bila sinar berasal dari bawah.
Sepotong kaca tebal yang diletakkan di atas lampu UV dapat dipakai sebagai tumpuan
untuk meletakkan kromatogram dan sekaligus akan menyaring sinar UV berenergi
tinggi yang merusak. (pada setiap pemeriksaan kromatogram dengan sinar UV, kita
harus selalu memakai kaca mata yang menyerap sinar UV. Menguapi kromatogram
yang sudah betul-kering dengan uap NH (dari botol yang berisi NHOH 0,88:HO,
1:1) umumnya akan meningkatkan kepekaan deteksi dan menghasilkan perubahan
warna yang ada kaitannya dengan struktur senyawa yang bersangkutan (lihat di
bawah). Bila semua bercak yang tampak telah ditandai dengan pensil, kita dapat mulai
dengan mempertimbangkan sifat kimia setiap bercak.
3.2 Informasi struktur flavonoid dari data KKt
Kenyataan bahwa bercak terlihat juga pada kondisi ini merupakan petunjuk bahwa
senyawa tersebut senyawa fenol. Sering kali bercak yang terlihat (dengan sinar UV)
kebanyakan disebabkan oleh flavonoid walaupun bercak berfluoresensi biru, merah
jambu, keputihan, jingga, dan kecoklatan harus dianggap bukan flavonoid sebelum
diperiksa lebih lanjut (dengan spektroskopi UV-tampak). Bercak glikoosida flavon
dan glikosida flavonoid yang khas tampak berwarna ijas (lembayung tua) dengan
sinar UV dan menjadi kuning atau hijau kuning bila diuapi NH, tetapi dijumpai juga
sejumlah kombinasi warna lain. Rentang warna bercak yang dapat dihubungkan
dengan flavonoid bersama-sama dengan hubungannya dengan struktur flavonoid yang
mungkin.
Sumber informasi struktur lain yang berharga ialah letak bercak pada KKt dua arah.
Jadi, bila kita memandang kromatogram yang diletakkan sedemikian rupa sehingga
titik awal berada pada sebelah kanan bawah, kromatogram akan menunjukkan semua

aglikon flavonoid sepanjang bagian atas dan pada bagian kiri, sedangkan glikosida
ditunjukkan pada seluruh daerah sisanya.
3.3 Pengembang dan perbaikan pemisahan bercak
Kadang-kadang kelompok bercak yang terdiri atas dua bercak atau lebih pada KKt
tidak terpisahkan dengan baik. Jika dalam suatu pengembang, kelompok bercak ini
kelincahannya rendah, dan dalam pengembang lain kelincahannya cukup, maka
kromatografi lewat-kembang mungkin dapat memisahkannya dengan lebih baik. Pada
kromatografi lewat-kembang, kromatogram tidak diangkat dari bejana pada akhir
pengembangan yang normal, tetapi pengembang dibiarkan merambat terus, yaitu
menetes dari ujung bawah kertas (agar pengembang dapat menetes dengan seragam,
sebaiknya ujung bawah kertas dibuat bergerigi). Jauhnya lewat-kembang dapat
dikendalikan dengan mengatur banyaknya pengembang yang digunakan. Jadi, jika
pengembangan normal memerlukan 50 ml pengembang per kromatogram, untuk
lewat-kembang dapat diperbanyak dua atau tiga kali menjadi 100 atau 150 ml
pengembang per kromatogram. Kita dapat menganggap, dengan melipatduakan
pengembang, jarak yang ditempuh bercak menjadi dua kali lebih jauh. Dengan
demikian, bila kita memperhatikan KKt asal yang tidak terpisahkan dengan baik itu,
kita akan mendapat petunjuk seberapa jauh kita dapat melakukan lewat-kembang agar
bercak tidak terbawa menetes.

Gambar 2.3 Petunjuk Penyebaran Jenis Flavonoid Pada Kromatogram

Cara lain ialah dengan menggunakan pengembang yang berbeda. Sebagian besar
pengembang tersebut baru boleh diicoba setelah mencoba TBA atau BAA yang
biasanya merupakan pengembang terbaik dari segi kekuatan pelarut dan pemisahan
bercak.

Para peneliti flavonoid berbeda pendapat mengenai pilihan pengembang, apakah BAA
atau TBA, dan rasanya pada tempatnyalah bila di sini disebutkan mengenai pro dan
kontra masing-masing pengembang tersebut. Kelebihan BAA dibandingkan TBA
ialah waktu pengembangannya yang lebih pendek per kromatogram (16-18 jam pada
15C, sedangkan TBA 24-36 jam). Tetapi, ini diimbangi oleh kekurangan nisbinya,
yaitu (a) kebanyakan flavonoid kelincahannya rendah (kira-kira 20%) dalam BAA
(misalnya Pangon dkk., 1974), dan (b) diperlukan penyetimbangan dan pemisahan
kedua fase sewaktu pembuatan (TBA merupakan campuran pelarut yang
tercampurkan sempurna). Susunan kedua pengembang berubah dengan berjalannya
waktu karena terjadi pengesteran sehingga keduanya tidak boleh disimpan lebih dari
beberapa hari sebelum dipakai.
3.4 Bilangan Rf
Kelincahan suatu senyawa dalam pengembang tertentu disebut bilangan Rf senyawa
itu dalam pengembang tersebut, dan menurut teori, Rf merupakan cirri senyawa
tersebut yang terulangkan. Bilangan Rf didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh
oleh senyawa dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan pengembang
(diukur dari garis awal). Karena itu, bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.
Pembandingan bilangan Rf flavonoid yang belum dikenal dengan Rf flavonoid yang
telah dikenal dan yang sejenis merupakan cara yang berguna untuk membandingkan
flavonoid yang sedang diidentifikasikan dengan flavonoid yang tak ada di
laboratorium. Data Rf flavonoid baku dapat diperoleh dari sejumlah sumber, termasuk
himpunan yang cukup besar yang telah disusun oleh Jiracek & Prochazka (1963) dan
Mabry dkk. (1970) (TBA, HOAc 15%). Tetapi, harus ditekankan bahwa
bilangan Rf hanya kira-kira saja terulangkan di beberapa laboratorium dank arena alas
an tersebut, adanya korelasi nyata dengan bilangan Rf pustaka harus dianggap sebagai
petunjuk identifikasi saja sebelum kedua senyawa tadii dikromatografi berdampingan
pada kertas yang sama (mengenai pemastian identitas, lihat bab 7).
3.5 Pereaksi semprot dan deteksi kepekaan tinggi
Dengan menyemprot kromatogram memakai pereaksi yang berlainan, kita dapat
memperoleh informasi yang terbats mengenai strukutr flavonoid. Tetapi, hal ini
umumnya dapat diperoleh secara lebih baik dengan cara lain. Menurut pengalaman
pengarang, pemakaian pereaksi semprot yang paling menguntungkan ialah dalam
meningkatkan kepekaan mendeteksi bercak flavonoid, misalnya pada kromatogram

yang ditotoli cuplikan yang jumlahnya sedikit atau bila mencari kandungan yang tak
tampak atau kandungan tambahan. Ada empat penyemprot yang berguna, terutama
untuk tujuan ini, yaitu:
1. AlCl. Larutan AlCl 5% yang bisa digunakan untuk spektroskopi UV-tampak (lihat
bab 3) bila disemprotkan pada KKt yang kemudian dikeringkan, menunjukkan semua
5-hidroksi-flavonoid sebagai bercak berfluoresensi kuning bila dilihat di bawah sinar
UV (366 nm). Selain itu, bercak yang semula tak tampak menjadi terlihat;
2. Kompleks difenil-asam borat-etanolamin (Naturstoffreagenz A). Pemakaian larutan
1% dalam MeOH pada KKt menunjukkan (setelah pengeringan) semua 3,4dihidroksi-flavon dan 3,4-dihidroksi-flavonol sebagai bercak jingga (UV atau
tampak). 4-Hidroksi-flavon dan 4-hidroksi-flavonol tampak berupa bercak hijau
kuning;
3. Asam sulfanilat yang terdiazotasi. Pereaksi dibuat sebagai berikut: larutan asam
sulfanilat 0,3% dalam HCl 8% (25 ml) dicampur dengan larutan natrium nitrit 5% (1,5
ml) tepat sebelum digunakan. Kertas disemprot dengan campuran ini, lalu dengan
larutan natrium karbonat 20% sebelum dikeringkan. Kebanyakan senyawa yang
mempunyai gugus hidroksi fenol akan terlihat sebagai bercak kuning, jingga, atau
merah;
4. Vanillin-HCl. Larutan vanillin 5% dalam EtOH dicampur dengan HCl pekat dengan
perbandingan 4:1 tepat sebelum digunakan. Bercak merah atau merah-lembayung
terbentuk segera setelah penyemprotan dan pemanasan (dengan pengering rambut)
oleh katekin dan proantosianidin, dan terbentuk lebih lambat oleh flavonon dan
dihidroflavonol. Pereaksi bereaksi dengan semua flavonoid yang mempunyai pola
oksidasi lingkar-A floroglusinol dan lingkar-C jenuh. Senyawa yang demikian sering
kali tidak tampak pada kromatogram bila disinari dengan sinar UV.
3.6 KKt preparative untuk mengisolasi flavonoid
Untuk mengisolasi flavonoid satu persatu agar dapat ditelaah lebih lanjut, kita harus
meningkatkan skala cara KKt dwiarah (KKt-2A) bila kita akan menggunakan KKt
untuk tujuan tersebut. Membebani KKt dwiarah sampai kapasitas maksimumnya dan
melakukan kromatografi dalam jumlah besar merupakan satu cara untuk memisahkan
masing-masing flavonoid. Lalu, bercak yang sesuai digunting dari setiap

kromatogram,digabungkan, dan setelah digunting menjadi potongan kecil-kecil

dimaserasi dengan larutan yang cocok (biasanya aglikon dengan MeOH dan gliikosida
dengan MeOH-HO, 1:1). Setelah dibiarkan beberapa jam, sambil kadang-kadang
dikocok (atau lebih baik lagi dikocok terus menerus), cairan dienap-tuangkan. Agar
ekstraksi efisien, cara ini harus diulangi dua atau tiga kali. Selanjutnya, ekstrak
digabung, disaring, dan diuapkan sampai kering. Bila perlu, pemisahan lebih lanjut
dapat dilakukan dengan KKt memakai pengembang yang berbeda.
Cara yang lebih efektif, bila dapat dilaksanakan, ialah KKt satu arah (KKt 1A). bila
KKt-2A menunjukkan bahwa pemisahan komponen yang kita telaah dapat dilakukan
hanya dengan salah satu pengembang saja, maka KKt-1A merupakan cara yang
cocok. Ekstrak tidak ditotolkan sebagai bercak bundar pada garis awal, tetapi berupa
pita lebar 1-3 cm (lihat gambar 2.1 (c)). Cara ini memungkinkan kita memisahkan
ekstrak secara kromatografi yang jumlahnya 10-15 kali jumlah ekstrak yang dapat
dipisahkan secara KKt-2A dan dengan demikian meminimumkan waktu dan biaya
yang diperlukan. Setelah pengembangan KKt-1A, pita yang terjadi dapat dipotongpotong dan diekstraksi dengan pelarut (llihat uraian di atas). Yang lebih baik,
digunting berbentuk pita dan kemudian dielusi dalam bejana kromatografi dan eluat
ditampung dengan gelas piala (lihat gambar 2.1 (d)). Cara yang terakhir ini, walau pun
lebih lambat, menghasilkan larutan flavonoid pekat yang bebas serat. Bila perlu,
pemisahan KKt-1A dapat digabung dengan KKt-1A atau KKt-2A yang lain agar
diperoleh flavonoid murni. KKt juga mempunyai potensi untuk ditingkatkan lebih
lanjut skalanya, yaitu dengan menggunakan kertas kromatografi yang lebih tebal,
misalnya, Whatman No. 17 (yang mempunyai kapasitas hamper tiga kali kapasitas
kertas Whatman 3MM, tetapi resolusinya lebih rendah).
Flavonoid yang diisolasii secara KKt mungkin masih mengandung sedikit cemaran
polisakarida yang larut, dan paling baik dimurnikan lebih lanjut secara kromatografi
memakai Sephadex LH-20 (lihat bagian 2.4.3).
3.7 Petunjuk tentang penguapan pelarut
Tahap padat karya pada isolasi kebanyakan flavonoid murni yang sering ditimbulkan
oleh cara di atas ialah penguapan larutan yang diperoleh. Untuk penguapan cepat
larutan dalam air, jelas penguap-putar yang disertai pemanasan merupakan pilihan
utama. Kebanyakan flavonoid dan glikosidanya mantap pada kondisi tersebut, tetapi
bila diduga terjadi penguraian, mongering-bekukan larutan merupakan cara pilihan

lain yang cocok. Pada akhirnya, semua volum yang besar dikurangi menjadi volum
kecil dan masing-masing harus dialihkan ke dalam botol kecil dan diuapkan.
Penguapan-akhir ini dapat dilakukan dengan baik dalam desikator hampa udara pada
tekanan rendah. Sejumlah besar cuplikan bervolum kecil dapat diuapkan serentak, dan
dengan menggunakan silika gel yang baru dikeringkan (mengandung indikator) dan
pompa arus-air, kebanyakan larutan yang bervolum 1-2 ml akan menguap sempurna
dalam semalam. Jika kita ingin menguapkan suatu cuplikan dengan lebih cepat, botol
kecil dapat diletakkan dalam labu bundar dan labu ini dipasang pada penguap-putar.
Cara lain lagi untuk mencapai tujuan itu ialah dengan memanaskan botol kecil di atas
penangas air sambil mengalirkan gas nitrogen di atas permukaan larutan. Cara ini
dapat menguapkan cuplikan dengan sangat cepat.
4. Kromatografi kolom pemisahan skala besar
Dengan menggunakan cara ini skala isolasi flavonoid dapat ditingkatkan hamper ke
skala industri. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid
(berupa larutan) di atas kolom yang berisi serbuk penjerap (seperti selulose, silica,
atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut
yang cocok. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada
salah satu ujung, dan ukurannnya sedemikian rupa sehingga nisbah garis tengah
terhadap panjang kolom dalam rentang 1:10 sampai 1:30 (lihat gambar 2.3). Ukuran
(volum) yang diperlukan untuk suatu pemisahan dapat dihitung secara kasar bila
bobot campuran flavonoid diketahui. Pada umumnya kita menganggap bahwa untuk
pemisahan yang didasarkan pada partisi (yaitu kromatografi pada selulose dan silica),
nisbah cuplikan terhadap kemasan kolom harus dalam rentang 1:50 sampai 1:500;
nisbah 1:500 cocok untuk campuran rumit dan nisbah 1:50 untuk campuran
sederhana. Pada kolom poliamida (dan sampai taraf tertentu kolom silika), pengisian
cuplikan dalam rentang 1:50 umumnya memuaskan.

Gambar 2.3 Radas Kromatografi Kolom

Kemasan kolom harus dipilih dari jenis yang dipasarkan khusus untuk kromatografi
kolom karena ukuran partikel penting. Jika partikel terlalu kecil, laju aliran pengelusi
mungkin terlalu lambat, sedangkan bila terlalu besar, mungkin pemisahan komponen
secara kromatografi tidak baik. Kemasan niaga biasanya dalam rentang 100300 mesh.
4.1 Cara mengemas kolom dan menempatkan cuplikan
Mengenas kolom harus dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom kemas yang
serba sama. Jika kolom tidak mempunyai penyaring kaca maser yang sudah terpasang,
mula-mula kita harus menyumbat leher kolom dengan segumpal kaca wol atau kapas.
Kemudian, sumbat ini harus terendam dalam pelarut pengelusi yang tingginya kirakira 10 cm (lihat di bawah). Selanjutnya, kemasan kolom dijadikan bubur dalam gelas
piala memakai pelarut yang sama, lalu dituangkan hati-hati ke dalam kolom,
sebaiknya semuanya dilakukan dengan tidak terputus-putus untuk mencegah
terbentuknya lapisan. Setelah itu, kemasan dibiarkan turun, dan pelarut yang
berlebihan dikeluarkan melalui keran. Pada poliamida (dan sampai taraf tertentu
kolom selulose), dianjurkan agar sebelum mengisi kolom, kemasan direndam dulu
sampai satu jam supaya menggembung. Cara ini mempunyai keuntungan lain, yaitu
menghilangkan bahan yang larut dari kemasan bila pelarut perendam diganti, tepat
sebelum kolom diisi. Setelah kolom dikemas, cucilah kolom ini sebaik-baiknya.
Langkah pertama pada kromatografi kolom ialah menempatkan larutan cuplikan pada
(di bagian atas) kolom sedemikian rupa sehingga terbentuk pita yang siap untuk

dielusi lebih lanjut. Untuk mencapai ini, cuplikan harus dilarutkan dalam pelarut yang
volumnya sesedikit mungkin. Pelarut yang dipaki harus sama dengan pelarut untuk
mengelusi (lihat di bawah) dan sebaiknya pelarut yang kepolarannya paling rendah
walau pun hal ini tidak selalu dapat dilakukan karena adanya masalah kelarutan.
Menempatkan larutan pekat pada kolom harus hati-hati agar permukaan kemasan
tidak terganggu, dan untuk ini dianjurkan menggunakan pipet. Kemudian, pekatan
cuplikan dibiarkan meresap perlahan-lahan ke dalam kolom dengan membuka keran
sedikit. Bila bagian atas kemasan sudah terbuka lagi, keran ditutup, dan sedikit
pelarut pengelusi dimasukkan lagi dengan hati-hati (juga dengan pipet). Ini pun
dibiarkan meresap ke dalam kolom sebelum sejumlah besar pelarut pengelusi
ditambahkan dan proses kromatografi mulai.
Jika masalah kelarutan tidak memungkinkan kita menempatkan cuplikan dengan cara
di atas, dapat digunakan cara prajerapan. Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut
sebarang yang cocok dan dicampur dengan sedikit penjerap (cukup untuk membentuk
pita 1-3 cm pada bagian atas kolom yang telah disiapkan). Lalu, penjerap dikeringkan
dan ditaburkan pada bagian atas kolom semerata mungkin sebagian serbuk. Agar
penempatan rata, dapat dibantu dengan adanya pelarut beberapa cm pada bagian atas
kolom.
4.2 Memilih kemasan kolom
Kemasan kolom yang tersedia sangat banyak dan senarai di bawah memberikan
pedoman mengenai pemakaian dan cirri sejumlaj jenis kemasan yang berguna.
Keterangan yang lebih terinci dapat dilihat dalam Markham (1975).
Selulose. Pemakaian selulose serupa dengan kertas, yaitu ideal untuk memisahkan
glikosida yang satu dari glikosida yang lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon,
serta untuk memisahkan aglikon yang kurang polar. Kapasitasnya rendah. Jenis niaga
yang cocok termasuk: selulose mikrokristal (Merck) (Macherey & Nagel) dan
Whatman CF-11 (berserabut dan kurang memuaskan).
Silika. Bahan ini paling berguna untuk memisahkan aglikon yang kurang polar,
misalnya isoflavon, flavonon, metal flavon dan flavonol. Sering kali lebih baik dicuci
dulu dengan HCl kuat untuk menghilangkan sesepora besi yang menyebabkan banyak

flavonoid terikat kuat pada kemasan kolom. Kapasitas: pertengahan. Jenis niaga yang
cocok. Kiselgel 60, 70-230 mesh (Merck).
Poliamida. Bahan ini cocok untuk memisahkan semua flavonoid, meski juga ideal
untuk memisahkan glukosida. Merupakan pelengkap untuk KKt karena melibatkan
penjerap dan pengembang yang berlainan. Sebelum dipakai harus dicuci dulu baikbaik dengan MeOH dan HO agar poliamida yang larut tidak mencemari semua fraksi
(lihat bagian Sephadex LH-20 di bawah). Mungkin perlu diayak untuk memperoleh
ukuran partikel yang memadai. Kapasitasnya tinggi. Yang termasuk poliamida niaga:
Polyclar AT (General Aniline and Film Corporation), Polypenco 66D (Polymer
Corporation), dan Polyamida (Woelm).
Gel sephadex (deret G). Bahan ini dirancang untuk memisahkan campuran, terutama
berdasarkan pada ukuran molekul (bila digunakan pelarut air); molekul besar terelusi
lebih dulu. Pada cara ini sephadex berguna untuk memisahkan poliglikosida yang
berbeda bobot molekulnya. Bila sebagai pengelusi dipakai pelarut organic, gel
sephadex deret G berperilaku kromatografi seperti selulose, tetapi kapasitasnya lebih
besar karena ukuran partikelnya lebih teratur. Pada kedua cara di atas, sebelum
dikemas, gel harus digembungkan dulu dalam pengelusi selama 12 jam. Jenis niaga
yang ada termasuk: G-10 (untuk bobot molekul 0-700) dan G-25 (untuk bobot
molekul 100-1500).
Gel sephadex (LH-20). Sephadex LH-20 Pharmacia dirancang khusus untuk
digunakan memakai pelarut organic, dan dapat digunakan dua cara. Karena bahan ini
menghasilkan eluat tanpa sisa, LH-20 sangat cocok untuk pemurnian akhir aglikon
flavonoid dan glikosida yang telah diisolasi dari kertas, selulose, silica, atau
poliamida. Umumnya, pelarut yang cocok ialah MeOH, meski pada mulanya
diperlukan sedikit air untuk melarutkan flavonoid. Di sini pun sel perlu direndam
(seperti di atas), dengan MeOH.
4.3 Memilih pelarut dan mengelusi kolom
Untuk sebagian besar, pelarut yang paling cocok untuk memisahkan harus ditentukan
melalui percobaan. Sering kali yang paling sederhana ialah dengan menyelidiki
kemungkinannya melalui cara kromatografi lapis tipis (q.v.) sebelum dilakukan
kromatografi kolom. Tetapi, pada umumnya, kolom harus dielusi dengan pelarut atau
campuran pelarut yang berurutan, dimulai dengan pelarut yang paling kurang polar

dan sedikit demi sedikit meningkat sampai ke yang paling polar. Kepolaran nisbi
pelarut yang biasa digunakan ditunjukkan dengan eluotropik yang disenaraikan
berikut ini.
Selulose, silica. (disenaraikan menurut urutan kepolaran pelarut yang menurun). HO,
asam format, MeOH, HOAc, isopropyl alcohol (i-PrOH), aseton, n-PrOH, -tetra
hidrofuran, t-BuOH, 2-BuOH, metal etil keton, n-amil alcohol, etil asetat, eter,
CHCl, benzene. Hubungan antara kepolaran sebagian besar pelarut tampak pada
gambar 2.4. Di situ, setiap garis tengah lurus menunjukkan campuran pelarut yang
berlainan tetapi mempunyai daya mengelusi yang setara, misalnya ririt (garis putusputus) menunjukkan bahwa daya elusi hidrokarbon-etil asetat 50:50 sama dengan
hiidrokarbon-aseton 33:67 dan eter-etil asetat 8:92.
Poliamida (disenaraikan menurut keefektifan yang menurun sebagai pengelusi).
Larutan urea dalam air, dimetilformamida, formamida, larutan NaOH, aseton, MeOH,
HO, dikloroetana, atau CHCl.
Gambit pembukaan yang dianjurkan dalam memilih system pelarut dari setiap
senarai ialah sebagai berikut: pelarut yang disebut pertama adalah pelarut awaal yang
kemudian sedikit demi sedikkit berganti ke pelarut kedua, dan seterusnya.
Modifikasi dan perluasan system pelarut yang dianjurkan di sini dapat diciptakan
dengan mengacu ke deret eluotropik yang disenaraikan di atas.
Jika diperlukan pemisahan flavonoid yang baik, mengelusinya dari kolom harus
perlahan-lahan. Pita yang memisah dalam kolom mungkin tampak kuning atau dapat
dideteksi dengan sinar UV (366 nm). Dalam hal ini, cara yang sederhana ialah dengan
mengumpulkan setiap pita dalam wadah yang terpisah. Tetapi, jika pita tak kelihatan,
kita harus menampung semua fraksi pada selang waktu yang teratur (misalnya setiap
25 atau 50 ml), dan kemudian, setiap fraksi dianalisis secara KKt atau KLT untuk
menentukan fraksi mana yang dapat digabung. Pengumpul fraksi otomatis merupakan
alat yang ideal untuk tujuan tersebut. Kerepotan menyediakan dan memasukkan
pelarut ke dalam kolom dengan tangan dapat dikurangi dengan menggunakan corong
pisah sebagai tendon yang mengisi sendiri (tendon otomatis) (lihat gambar 2.3).
5. Cara kromatografi lain yang berguna

5.1 Kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mikroanalisis cepat

Nilai utama KLT pada penelitian flavonoid ialah sebagai cara analisis cepat yang
memerlukan bahan sangat sedikit. Tulisan mengenai cara KLT sendiri sudah banyak
(misalnya Kirchner, 1967; Stahl, 1969; Touchstone & Dobbins, 1978). Demikian pula
mengenai manfaatnya dalam analisis flavonoid (Stahl, 1969; Markham, 1975). Karena
itu, pembahasan disini diusahakan secukupnya saja.
Menurut pengalaman pengarang, KLT terutama berguna untuk tujuan berikut :
a. mencari pelarut untuk kromatografi kolom;
b. analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom;
c. menyigi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi;
d. identifikasi flavonoid secara ko-kromatografi;
e. isolasi flavonoid murni skala kecil.
Penyerap dan pengembang yang digunakan umumnya sama dengan penjerap dan
pengembang yang telah dibahas secara terinci untuk KKt dan kromatografi kolom
(tetapi lihat di bawah) dan cara untuk mendeteksi bercak sebagian besar seperti yang
telah diikhtisarkan untuk KKt. Pelat KLT dari plastic terutama dianjurkan karena
tembus sinar UV (untuk mendeteksi bercak) dan dapat dipotong dengan mudah
menjadi sebarang ukuran. Pelat seperti ini dipasarkan oleh Schleicher & Schull
(selulose F1440, kiselgel F1500; mikropoliamida A1700), Merck (selulose; kiselgel;
poliamida 11F), dan Macherey-Nagel (poligram selulose 300 UV). Lembaran 20x20
cm ini dapat dipotong menjadi pelat 8x4 cm dan kromatografi dapat dilakukan di
dalam gelas piala bertutup, atau lebih baik, dalam bejana kaca baku 9x9x4 cm
(dipasarkan misalnya oleh Kodak dan Desaga). Pelat berukuran ini biasanya
dikembangkan dalam waktu 10-100 menit, tergantung pada pengembang yang
dipakai.

Gambar 2.4 Perbandingan Kepolaran Beberapa Pelarut yang Lazim

Pelat KLT selulose dapat dibuat dengan menggunakan penyaput KLT baku (misalnya
Camag, Corning, dll). Selulose mikrokristal Merck, yaitu Avicel terutama sangat
cocok untuk keperluan ini dan disaputkan paling baik sampai ketebalan 0,25 cm (agar
lapisan tidak retak). Untuk menyaput lima pelat 20x20 cm, 20 g selulose sudah cukup
(diaduk kuat-kuat dengan HO 70 ml selama lima menit).
5.2 Elektroforesis kertas untuk analisis flavonoid bisulfit dan glukuronida
Pemakaian elektroforesis kertas pada analisis flavonoid, terbatas, karena untuk dapat
bergerak flavonoid harus dalam keadaan terionkan pada pH larutan elektrolit yang
dipakai. Contoh pemakaian yang berguna ialah pengenalan dan identifikasi flavonoid
bersifat dan pembedaan antara glukuronida dan glukosida. Jadi, pada pH 2,2 (dapar
format-asetat) dan dengan kertas Whatman no. 3 dan tegangan 400 V/cm, flavonoid
bisulfat bergerak kea rah anoda, sedangkan flavonoid lain tidak (Kruzaler &
Hahlbrock, 1973; Harborne, 1977). Pembedaan antara glukuronida dan glukosida
pada aras rendah dapat dilakukan dengan baik pada pH 4 (kalium hydrogen ftalat
0,01M) pada lembaran selulose asetat tegangan 400V (3 mA). Pada kondisi
iniglukuronida bergerak ke arah anoda, tetapi glukosida tidak (Markham, 1980).
Untuk pekerjaan ini biasanya digunakan satuan elektroforesis Shandon Southern yang
dilengkapi dengan sumber tenaga voKam. Beberapa kelincahan nisbi berbagai
flavonoid bisulfat disenaraikan oleh Harborne (1977).
5.3 Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) untuk mikroanalisis kuantitatif
Di sini kami tidak bermaksud untuk membahas KCKT, yang sudah cukup diliput
dalam berbagai pustaka seperti Pryde & Gilbert (1979). Tetapi, mengingat

kepopuleran cara ini yang meningkat dengan cepat, ulasan singkat mengenai
manfaatnya pada analisis flavonoid dapat dibenarkan.
Kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya ialah suatu bentuk kromatografi kolom
yang menggunakan kolom yang terbuat dari bahan kemasan dengan partikel
berukuran kecil dan berbentuk teratur. Karena kehalusan kemasan, maka untuk
mendapatkan laju aliran yang memadai, digunakan tekanan sampai 5000 lb/inci atau
sekitar 2000 kg/cm. cara ini memungkinkan peneliti menganalisis komponen
flavonoid dalam suatu campuran secara kuantitatif pada aras resolusi dan kepekaan
yang tinggi (< 50 ng); segi kuantitatif inilah yang terutama membedakan KCKT dari
cara kromatografi lain. Pengukuran kuantitatif dilakukan dengan menyigi eluat yang
keluar dari kolom secara otomatis menggunakan spektromonitor UV berpanjang
gelombang berubah dan kromatogram direkam pada kertas gaftar berupa deretan
puncak.
Berbagai kombinasi kemasan untuk flavonoid telah dilaporkan dalam pustaka dan
tinjauan mengenai hal ini telah diterbitkan oleh kingstone (1979). Sudah jelas bahwa
untuk sebagian besar, analisis yang cocok ialah kolom fase balik (hidrokarbon terikat
pada silika). Jenis -Bondapak C-18 (waters associates). Pengembangan seperti
HO/MeOH, HO/MeOH/HOAc, dan HO/asetonitril (dalam berbagai perbandingan)
telah digunakan dengan berhasil pada kromatografi flavon, flavonol, katekin,
dihidroflavonoid, antosianin dan flavonoid glikosida. Dalam berbagai peristiwa,
mengubah susunan pengembang ternyata bermanfaat.
Kekurangan cara ini ialah tingginya biaya yang dikeluarkan oleh pompa dan
persyaratan yang harus dipenuhi dalam hal penyuntikan larutan, yaitu harus bebas
partikel untuk mencegah penyumbatan dan kerusakan kolom. Jika campuran
flavonoid tersedia cukup, analisis kuantitatif komponen dapat dilakukan dengan baik
dan murah dengan menggabungkan KKt (untuk memisahkan komponen) dan
spektroskopi UV-tampak (untuk pengukuran kuantitatif komponen).
6. Cara penghabluran ulang
Jika flavonoid tersedia cukup (4 mg atau lebih), maka cara memurnikan yang paling
efektif ialah penghabluran ulang, dimaksudkan untuk menghilangkan flavonoidtambahan lain dan bahan kromatografi yang larut. Titik leleh flavonoid yang
dimurnikan dengan cara ini merupakan cirri yang berguna untuk membandingkan

senyawa yang sedang diidentifikasi dengan flavonoid yang pernah diisolasi

sebelumnya, sedangkan penentuan titik leleh campuran (q.v.) merupan cara yang
sangat baik untuk menentukan identitas flavonoid berdasarkan flavonoid lain.
Flavonid berbentuk hablur merupakan bahan awal ideal untuk analisis gula karena
mereka bebas dari polisakarida yang larut, yang selalu mencemari flavonoid yang
diisolasi dengan KKt.