INGENIERA DE PROTENAS

PROGRAMA DE TEORA
BIBLIOGRAFA
SISTEMA DE EVALUACIN

PROGRAMA DE PRCTICAS
OBJETIVOS

PROGRAMA DE TEORA

I. Introduccin.
1.

Bases conceptuales y metodolgicas del rediseo y modificacin funcional de las

protenas. La cuestin bsica: secuencias peptdicas y estructuras asociadas.

2.

Anlisis estructural de pptidos y protenas: revisin general de mtodos

difractomtricos y espectromtricos. Alcance y limitaciones de las diferentes
tcnicas empleadas.

3.

Plegamiento, estructura nativa y estabilidad de pptidos y protenas: interacciones

implicadas en la estabilizacin conformacional de las cadenas polipeptdicas.
Modelos de plegamiento: criterios cinticos y termodinmicos. Factores
coadyuvantes del plegamiento.

II. Modelizacin y Diseo de Protenas: Mtodos Tericos y Computacionales.

4.

Aplicacin de mtodos tericos y computacionales al la modelizacin y al diseo

de protenas: introduccin al problema. Bases de datos secuenciales y estructurales
de protenas. Acceso y utilizacin de PIR, SwissProt y Brookhaven Protein Data
Bank: recursos telemticos y metodologa bsica.

5.

Cartografa e infografa molecular de protenas. Diagramacin y proyeccin

cartesiana de coordenadas atmicas. Determinacin de ngulos y distancias.
Definicin de superficies: radios de Van der Waals, superficies accesibles y
superficies de contacto. Descripciones numricas y analticas de superficies.
Proyecciones en redes. Teselacin. Mapas estricos. Otros sistemas de
representacin.

6.

Hidrofobicidad. Perfiles hidrofbicos y mtodos de prediccin y diseo basados

en medidas de hidrofobicidad residual. Anlisis topolgico de protenas
integrales de membrana. Prediccin y diseo de determinantes antignicos.
Anlisis secuencial de flexibilidad. Diseo de secuencias "lider" y de
canalizacin celular de protenas recombinantes.

7.

Anlisis de periodicidad estructural. Distribucin axial de hidrofobicidad a lo largo

de la secuencia y su significado topognico: anlisis predictivo de anfipata axial.
Momentos hidrofbicos. Transformada de Fourier de perfiles hidrofbicos.
Diagramas de Stroud. Momentos de variabilidad.

8.

Anlisis predictivo y diseo de elementos estructurales secundarios de protenas:

Conceptos y algoritmos bsicos. Criterios de asignacin de elementos secundarios
en estructuras conocidas. Secuencias determinantes de patrones de plegamiento.
diseo de elementos supersecundarios.

9.

Identificacin y diseo de elementos estructurales y funcionales a partir de motivos

secuenciales. Descripciones "lineales" de motivos secuenciales: PROSITE.
Descripciones y mtodos matriciales. Perfiles de Griskov. Concepto y medida de la
"distancia" entre residuos isotpicos de secuencias homologas. La matriz de
Dayhoff y otras matrices de distancia.

10.

Tcnicas de alineamiento y anlisis de homologa entre secuencias polipeptdicas.

Algoritmo de Needleman-Wunch. Indices de similaridad y parmetros
relacionados. Generalizacin del algoritmo de Needleman-Wunch: alineamiento
mltiple de protenas. Dendrogramas y rboles filogenticos.

11.

modelizacin estructural mediante homologa. Tcnicas de superposicin

estructural. Desviacin cuadrtica media entre C. Ajuste de regiones
estructuralmente conservadas (SCRs). Asignacin estructural de regiones variables.

12.

Anlisis

conformacional

de

protenas:

mtodos

variacionales

de

minimizacin de energa y mecnica molecular ("force-fields"). Mtodos de

convergencia para el clculo de potenciales. Problemtica de los factores
entrpicos y la simulacin del disolvente.

13.

Simulacin dinmica molecular. Barreras conformacionales. Estrategias de

calentamiento

equilibrado.

Anlisis

combinado

simulacin

dinmica-

minimizacin. Compresibilidad.
14.

Metodologa asociada al diseo racional de proteinas. Mtodos heursticos basados

en datos previos ("knowledge-based"). Memorias asociativas y redes neuronales.
Mtodos de clasificacin ("clustering")

15.

Diseo de ligandos

y frmacos. Interaccin protena-ligando. Anlisis

conformacional de molculas no enalzadas ("docking"). Mtodos de evaluacin

estructura-funcin. QSAR.
III. Mtodos Experimentales y Aplicaciones.
16.

Estrategias genticas para la modificacin y expresin de protenas recombinantes:

revisin de los mtodos bsicos de la ingeniera gentica.

17.

Mutagnesis dirigida por oligonucletidos. Mtodos de seleccin "in vivo":

"gapped duplex", "single primer", "coupled priming". Mtodos de seleccin "in
vitro": "Epstein". Mtodos basados en el empleo de la PCR. Estrategias de
mutagnesis sitemtica: "cassete mutagnesis". Mutagnesis completa aleatoria.

18.

Vectores especficos para mutagnesis y secuenciacin. Derivados de M13.

FagJmidos. Vectores de expresin en procariotas : sistemas pET, pGEX y pMAL
de E coli. Otros sistemas optimizados de expresin en procariotas.

19.

Estrategias de produccin de protena recombinante. Amplificacin e insercin de

fragmentos. Ajuste del marco de lectura. Protenas quimJricas y de fusin.
Protenas nativas. Redireccionamiento ("targeting") y translocacin de protenas
recombinantes. Secrecin de protenas recombinantes.

20.

Sistemas de expresin de alto rendimiento en procariotas. Optimizacin de

promotores transcritos. Optimizacin de mensajeros. Purificacin y estabilidad de
protenas recombinantes. Estabilidad de clones recombinantes. Produccin a escala
industrial.

21.

Vectores y estrategias de expresin en levadura. Promotores de levadura.

Estabilidad de mensajeros y protenas recombinantes. Redicreccionamiento y
secrecin de protenas recombinantes en levadura.

22.

Expresin de alto rendimiento en eucariotas : sistema de expresin mediante

baculovirus. Descripcin del proceso infectivo. Vectores derivados de baculovirus:
estructura y estrategias de expresin asociadas: transfeccin de clulas y de larvas
de insecto. Modificaciones post-translacionales. Produccin a escala industrial.

23.

Libreras combinatoriales de pptidos sintticos: sntesis, barrido y verificacin

estructural. Libreras de exposicin en fago ("phage display"). Descripcin
detallada de la tcnica de phage display en vectores de M13. Estrategias de
reconocimiento y seleccin (panning) de fagos recombinantes. Sistemas de
evolucin "in vitro" y libreras combinatoriales qumicas. Aplicaciones al diseo de
frmacos y enzimas sintticos.

24.

Sistemas de transcripcin y traslacin "in vitro". Promotores empleados en la

transcripcin "in vitro" (SP6, T3, T6). Produccin "in vitro" de mRNAs sintticos.
Traslacin a partir de reticulocitos de conejo. Traslacin a partir de extractos de
germen de trigo.

25.

Sntesis qumica de genes. Mtodos del fosfodiJster y del fosfotriJster. Sntesis de

oligonucletidos en fase slida: mtodo del fosfitotriJster. Dispositivos automticos
para la sntesis de oligonucletidos. Estrategias de diseo de genes sintticos.

26.

Sntesis qumica de pptidos bioactivos y protenas. Induccin de plegamiento

mediante restricciones estructurales. Estabilizacin funcional mediante enlaces
disulfuro. Estudio detallado de algunas protenas sintticas: quimotripsina esterasa,
linfoquina murina IL-3, otras.

27.

Diseo y modelizacin funcional de protenas y enzimas. Rediseo de centros

catalticos y reguladores. Modificacin de la especificidad cataltica de una enzima.
Estudio detallado de algunos modelos experimentales: subtilisina, anticuerpos
catalticos, otros. Diseo "de novo" de nuevas proteinas y enzimas.

28.

Aplicaciones de la ingeniera de protenas a la investigacin bsica. Anlisis del

plegamiento y de la estabilidad estructural y funcional de protenas. Aplicacin al
estudio de mecanismos de catlisis enzimtica. Estudio detallado de algunos
ejemplos.

29.

Aplicacin de la ingeniera de protenas al diseo de frmacos y al desarrollo de

terapias gnicas e inmunotxicas: Inmunotoxinas y citotoxinas dirigidas ("sitedirected"). Otras aplicaciones al campo de la biomedicina, zootecnia, agricultura e
industria.

PROGRAMA DE PRCTICAS

a) Mtodos computacionales.- A lo largo de la asignatura se propondrn y resolvern, de

manera sistemtica, problemas y casos prcticos de prediccin estructural y diseo que
tendrn que ser resueltos con ayuda del ordenador y del software especfico en cada caso.
Se preve, para ello, la utilizacin, via red, de la infraestructura existente en el Centro de
Informtica de la Universidad de Granada, y el empleo tanto de software local como del
existente en otros Centros y Servidores nacionales y europeos, en la medida en que puedan
ser accedidos a travs de Internet.
1.

Acceso, bsqueda y adquisicin de datos estructurales del Brookhaven Protein

Data Bank. Localizacin de servidores de datos via Internet. Bsqueda y
adquisicin de documentacin y software especfico sobre temas definidos.

2.

Infografa y cartografa molecular de protenas con el programa RASMOL:

2.1

Funciones bsicas del programa y lenguaje de comandos. Identificacin de

estructuras y elementos secundarios. Localizacin de dominios y motivos
estructurales.

2.2.

Confeccin de "scripts" sencillos de tareas combinadas. Tratamiento y

conversin de imgenes y comunicacin con otros programas.

3.

Prediccin estructural y anlisis de homologa: comparacin de resultados entre

diferentes algoritmos y programas (ProGraph, Multalin, ClustalV, Sybyl, Insight II,
otros).
3.1.

Obtencin de perfiles hidrofbicos. Identificacin de protenas integrales

de membrana y prediccin de su topologa bsica. Diseo de secuencias
transmembrana.

3.2.

Anlisis de la estructura secundaria de protenas modelo. Prediccin y

diseo de elementos secundarios.

3.3.

Rastreo de bases de datos secuenciales a travs de Internet. FASTA,

TFASTA, BLAST, BLITZ. Identificacin de secuencias relacionadas con
una secuencia problema.

3.4.

Alineamiento mltiple de una familia de secuencias. Comparacin de

diferentes algoritmos y elaboracin del rbol filogentico.

3.5.

Anlisis de homologa estructural entre secuencias mediante clculo de la

desviacin cuadrtica media entre C".

4.

Anlisis estructural de un fragmento peptdico mediante mecnica molecular y/o

simulacin dinmica. Estudio del efecto de mutaciones puntuales. Caracterizacin
estructural de familias de mutantes en el Brookhaven PDB.

5.

Desarrollo e implementacin completa de un algoritmo bsico: identificacin de

determinantes antignicos mediante el procedimiento de Hoops y Wood.
Valoracin del mtodo predictivo y diseo de un determinante antignico sobre un
"bundle" tetrahelicoidal sinttico.

b) Mtodos experimentales.- En funcin de las disponibilidades existentes, los alumnos

realizarn un ciclo de sesiones experimentales en torno a uno de los siguientes tpicos
propuestos:
2. Expresin de un marcador plasmdico en E. coli. Control de la expresin y efecto de
los promotores empleados.

3. Identificacin, mediante inmunoprecipitacin, de los productos de traslacin "in vitro"

a partir de reticulocitos de conejo.
4. Mutagnesis dirigida por oligonucletidos mediante el mtodo de Eckstein: anlisis de
protenas recombinantes.

BIBLIOGRAFA
Introduction to Protein Structure. C. Branden, J. Tooze (1991). Garland Publishing
Inc. New York.
Proteins : Structures and Molecular Properties (2nd Edition). T. E. Creighton (1993).
W. H. Freeman and Company. New York.
Methods in Enzimology Vol. 202 : Molecular Design and Modeling (part A :
Proteins, Peptides and Enzymes). (1991) Academic Press Inc. New York.
Methods in Enzimology Vol. 183 : Molecular Evolution : Computer Analysis of
Protein and Nucleic Acid Sequences. (1991) Academic Press Inc. New York.
Methods in Enzimology Vol.185: Gene Expression Technology. Academic Press Inc.
New York.
Molecular Mechanics. ACS Monograph 177. U. Burkert , N. L. Allinger. (1982)
American Chemical Soc. Washington D.C.
Computational Chemistry : An emphasis on Practical Calculations. M. D : Johnston
Jr. (1988). Elsevier. Amsterdam.
Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation. G.D.
Fasman. (1990). Plenum Press. New York.
Protein Folding. T. E. Creighton. (1992) .W. H. Freeman and Company. New York
Anlisis Vectorial (Sexta Edicin). H. F. Davis, A. D. Snider (1992). McGraw-Hill.
Madrid-New York.
Basic Microcomputer Models in Biology J. D. Spain (1982). Addison-Wesley
Publishing Co. London.
Principles of Gene Manipulation (fifth Edition, reprinted). R. W. Old, S. B.
Primrose (1995). Blackwell Science. Oxford.

 Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual.D. R. OReilly, L. K. Miller,

V. A. Luckow (1992). Freeman and Company. New York.
DNA Cloning 2. A Practical Approach. Core Techniques (Second Edition,
reprinted). D. M. Glover and B. D. Hames eds. (1996). IRL Press. Oxford.
Protein Architecture : A Practical Approach. A. M. Lesk. (1990). Oxford.
Concept in Protein Engineering and Design. P. Wrede, G. Schneider. (1994). Walter
de Gruyter, Berlin.
17.- Combinatorial Libraries : Synthesis, Screening and application potential. R. Cortese.
(1996). Walter de Gruyter, Berlin.

SISTEMA DE EVALUACIN
Los alumnos debern resolver, a lo largo del curso, varias relaciones personalizadas de
actividades que les sern propuestas peridicamente, en estrecha relacin con los
contenidos del programa. Para su resolucin, los alumnos debern localizar y consultar
bibliografa especializada, resolver problemas numricos, interpretar resultados
experimentales, emplear programas de ordenador y recursos de red (Internet), elaborar
diseos experimentales y redactar breves informes o revisiones bibliogrficas sobre
aspectos puntuales de la asignatura. La elaboracin, con todo ello, del correspondiente
cuaderno de actividades y su preceptiva presentacin, al final del curso, constituir la base
de la evaluacin de la asignatura.

OBJETIVOS

Introducir al alumno en el conocimiento de las bases conceptuales y metodolgicas

para el rediseo y la modificacin funcional de protenas recombinantes, as como su
produccin en sistemas experimentales de expresin adecuados.

Analizar con detalle algunos de los problemas centrales en el campo del denominado
diseo racional de protenas, haciendo especial hincapi en la utilidad, alcance y
limitaciones de las principales tcnicas biocomputacionales de prediccin y
modelizacin estructural de protenas.

Familiarizar al alumno con las principales estrategias y sistemas experimentales de

expresin de protenas recombinantes en sistemas procariotas y eucariotas, as como en
algunos de los avances metodolgicos ms significativos en el campo del diseo
combinatorial de pptidos y protenas y sus aplicaciones.