Fevereiro/2004
INTERESSES
Tcnica analtica poderosa utilizada para identificar compostos desconhecidos,
quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades qumicas e estruturais de
molculas; pode ser realizada com quantidades bem pequenas (ao nvel do picograma) e a
concentraes bem baixas em misturas quimicamente complexas (ppt); gera informaes
valiosas a um grande nmero de profissionais fsicos, engenheiros de controle de processos,
qumicos, astronautas, bilogos etc.
USOS
INSTRUMENTAO
Grande variedade, diferentes princpios fsicos, separao de ons pela razo massa/carga:
I. disperso em um setor magntico ou em um campo eltrico radial;
II. movimento em um campo eltrico com radiofrequncia;
III. tempo de vo, aps acelerao atravs de um potencial fixo;
IV. freqncia ciclotron em um campo magntico.
A primeira etapa na maioria dos experimentos aps a ionizao a acelerao dos ons para
fora da fonte em direo ao analisador de massas.
Os Componentes
de um
Espectrmetro de Massas
Separao dos ons
Fonte
Analisador
Detector
Manipulao
dos
dados
Introduo
da
Amostra
Espectro
de
Massas
Figura 1: Esquema dos principais componentes de um espectrmetro de massas.
FONTE INICA
Gerao de ons (mais comum): bombardeamento de molculas gasosas com um feixe de
eltrons.
Impacto de eltrons (70 eV): mistura de ons positivos e negativos e espcies neutras.
ons positivos: direcionados para o analisador pela aplicao de voltagem positiva no
repeller. Focalizao pela voltagem aplicada nas lentes.
ons negativos e eltrons: atrados para um catodo positivo.
Molculas e fragmentos neutros no ionizados: bombeados para fora do sistema.
No processo de ionizao por impacto de eltrons (IE), a energia dos eltrons geralmente
muito maior do que a energia das ligaes qumicas das molculas;
Quando eltrons de alta energia interagem com molculas, ocorre a ionizao; ligaes so
rompidas e fragmentos formados. Esta a razo porque no s ons da molcula intacta
aparecem nos espectros de massas;
Embora ons positivos e negativos sejam gerados na fonte ao mesmo tempo, uma
polaridade escolhida, e o espectro de massas consiste de ons positivos ou ons negativos.
Partculas neutras no so detectadas;
Espectro de massas de ons positivos so normalmente os mais utilizados.
Esquema:
Figura 2: Esquema de uma fonte de ons com ionizao por impacto de electrons.
PRODUO DE ONS
de fundamental importncia a gerao de um feixe intenso, contando ons caractersticos
das molculas no dissociadas e dos processos de fragmentao relacionado estrutura:
Impacto de eltrons (IE)
Ionizao qumica (IQ)
Ionizao por dessoro qumica (DCI)
Ionizao por campo/dessoro por campo (FI/FD)
Espectrometria de massas de ons secundrios (SIMS)
Bombardeamento por tomos rpidos (FAB)
Dessoro por plasma (PD)
Dessoro por laser (LD)
Termospray (TSI)
Electronspray (ESI)
Ionizao presso atmosfrica (API)
Espectrometria de massas por neutralizao - reionizao (NRMS)
4
SETOR MAGNTICO
elemento de foco direcional pois ons monoenergticos, que deixam a fonte em um feixe
divergente, so atrados ao foco do coletor,
mv/z = rB
ons de massas diferentes mas com a mesma energia cintica emanados do mesmo ponto,
seguem trajetrias diferentes atravs do raio central do setor magntico
Fonte
Inica
Para o vcuo
Magneto
Feixe de ions
separados
Coletor de
ions
Tubo
do
analizador
Sada
dos
ions
SETOR ELTRICO
setor eltrico cilndrico;
dispersa os ons com a razo energia cintica/carga;
elemento de foco direcional;
on positivo em um campo eltrico est sujeito a uma fora na direo do campo e o
percurso do on no campo curvo;
o raio da curvatura (rc), da trajetria do on depende da energia do on e da fora do campo
eltrico;
analisador de energias - serve para limitar a faixa de energias do feixe inico;
faixa de energias - fator de limitao da resoluo dos analisadores de deflexo magntica.
Somente ons de energia Ve segue a trajetria de raio r; ons com energias maiores ou
menores seguem trajetrias de raios maiores ou menores. r = 2V/E
INSTRUMENTOS DE SETORES
ons de massas grandes apresentam trajetrias de raios maiores do que ons de massas
pequenas;
pode-se obter uma resoluo to alta que a massa de uma partcula medida com trs ou
quatro casas decimais;
resolve-se ons de mesma massa nominal mas com frmulas qumicas diferentes como N2
e CO a m/z 28.
Figura 4: Esquema de um espectrmetro de massas de duplo foco, com analisador de ons por
campo eltrico e magntico.
QUADRUPOLO
analisador de massas;
apenas ons com uma determinada razo m/z conseguiro atravessar o analisador;
gera baixa resoluo (unitria), mas mais facilmente interfaceada aos vrios sistemas
de introduo de amostra.
-18
mol;
n
espectrometria de massas de estgios mltiplos, (EM) n < 13; podendo utilizar mtodos
diferentes de decomposio de ons (coliso com gs, irradiao com fton, interao com
superfcie);
determinao inequvoca do caminho de fragmentao real;
gerao de ons na cmara por ionizao por impacto de eltrons, ionizao qumica,
injeo efetiva dos ons gerados de outras fontes por APCI, ESI, MALDI;
manipulao fcil;
efetivo para reaes on-molcula;
avaliao da polaridade de ons gasosos.
10
end-cap
Filamento
Detector
Anel eletrodo
Voltagem rf
suplementar
TEMPO DE VO
t = L/v ; mv2/2 = zv ;
ideal para anlise de ons gerados por dessoro por plasma ou laser (pulsada), pois o
t = Lm1/2 /(2zv)1/2
mtodo capaz de gerar uma anlise de massas completa para cada evento de ionizao
discreto (alta velocidade de varredura).
Sinal
Partida
Fenmeno de desoro
Separador
Fonte
Grade
Detector
Sinal
Final
12
DETECTORES
corrente de ons extremamente pequena, mas pode variar rapidamente em uma faixa bem
grande;
-14
-11
a 10
semelhante ao box-and-grid.
13
Multiplicadores com diodo contnuo: uma alta voltagem negativa, tipicamente 1800v
aplicada atravs de uma trombeta de vidro cujo interior coberto com xido de titnio. A
cobertura serve como uma superfcie de emisso.
para prevenir a perda de eltrons pela entrada da trombeta e parra definir o potencial de
ons positivos so atrados fortemente para o multiplicador devido a alta voltagem negativa
em sua entrada. Os ons devem ser atrados para uma rea definida sem se chocarem com as
placas protetoras.
para ons pesados, o gradiente mnimo de potencial necessrio para contornar esta inrcia dos
ons e atra-los maior do que para os ons de massa baixa. Isto fixa o limite mnimo
dependente da massa para a voltagem do multiplicador.
tipicamente, o multiplicador deve ser operado acima de 1700v para um instrumento de 800u.
Raios-X: quando ons colidem com os polos de um sistema quadrupolo, raios-x brandos
podem ser gerados. Raios-x colidindo com multiplicadores pode levar a emisso de eltrons
da superfcie pela ao fotoeltrica. A corrente devido ao raios-x pode mascarar
completamente o sinal de fluxo de ons, levando a um aumento no sinal e rudo
contornar : multiplicador deve ser montado atrs de uma placa protetora contra raios-x.
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DETECTORES
Post acceleration
Microchannel plate
Photo diode array
Eletron multiplier
com plano focal
Microchannel plate: placa fina constituda de milhes de microcanais. Uma cobertura
metlica de Ni-Cr depositada nas duas faces da placa assegura contato e emisso. Os ons
incidentes colidem com as paredes internas do canal devido a sua inclinao e provocam a
emisso de eltrons secundrios. Estes so acelerados por um campo eltrico entre as duas
faces das placas. Por choque contra a parede, os eltrons provocam uma avalanche de
eltrons, sendo recolhidos por um anodo.
sistema de deteco com plano focal: coletam todos os ons por uma faixa de massa ao
mesmo tempo. Foi aplicado por vrios anos utilizando foto-placas. Detectores com plano
focal tm se tornado disponvel comercialmente. Aumenta a sensibilidade por um fator de
100.
M ic ro c h a n n e l P la te
PCM 2
PCM 1
o n s
e-
e-
300v
1 Kv
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O on Molecular
M+. - informao mais valiosa de um espectro de massa; sua massa e composio elementar
mostram os limites nos quais os fragmentos se situam.
para determinados tipos de molculas, o on molecular no suficientemente estvel para ser
encontrado em quantidades apreciveis no espectro por impacto de eltrons;
deve ser o on de maior massa no espectro;
dever ser um on com nmero mpar de eltrons (OE+. : odd-electron ion);
deve ser capaz de gerar ons importantes na regio de massa alta do espectro pela perda lgica
de espcies neutras
no espectro por IE, a amostra se ioniza pela perda de um eltron, deixando um eltron
desemparelhado, e o on molecular se torna uma espcie radicalar. Tal on, molecular ou
fragmento, com um eltron desemparelhado denominado OE e representado pelo smbolo
+.
EE (even-electron): ons nos quais os eltrons da camada externa se encontram
compartilhados. O smbolo + utilizado (EE+);
facilidade de ionizao destes eltrons se encontra na ordem n > > ;
ons contendo somente eltrons emparelhados (EE+) so geralmente mais estveis e
conseqentemente so fragmentos mais abundantes nos espectros de IE;
Abundncia do on molecular X estrutura:
[M+.] - depende da sua estabilidade ;
[M+.] - um indcio da estrutura molecular;
[M+.] - usualmente aumenta com o aumento de insaturaes e nmero de anis;
[M+.] - usualmente diminui com o aumento do tamanho da cadeia de uma estrutura;
[M+.] - diminui com as ramificaes
Em geral, a estabilidade da molcula se assemelha a estabilidade do on M+., e refletido na
abundncia do M+. .
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Figura 11: Espectros de Massas de alcanos lineares e isoprenide, salientando suas principais
posies de clivagem.
Ionizao
abrangem duas classes : enrgica e branda;
ionizao enrgica, com eltrons de 70eV, produz uma grande proporo de molculas
ionizadas com energias internas to altas que elas se fragmentam antes de sarem da fonte
inica;
as massas desses fragmentos so as informaes bsicas das subestruturas utilizadas na
interpretao;
ionizao branda minimiza tais fragmentaes.
ionizao por eltrons: o feixe de eltrons de alta energia so gerados de um filamento
incandescente e atravessam a cmara de ionizao em direo ao anodo do outro lado. O fluxo
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-3
-5
de molculas da amostra vaporizada a uma presso de ~10 Pa (10 Torr) entra na fonte e
interage com o feixe de eltrons formando uma grande variedade de produtos, incluindo ons
positivos;
so empurrados para fora da fonte por um pequeno potencial (repeller) e so acelerados para
o analisador de massas;
maior parte das molculas so removidas por bombas de vcuo na fonte inica.
a energia de 70 eV se encontra ~10eV acima da energia necessria para ionizar as molculas.
A presso da amostra na cmara de ionizao mantida bem baixa garantindo que colises
secundrias dos ons com molculas ou eltrons sejam negligenciveis;
o resultado inicial da interao do eltron com a molcula a formao do on molecular pela
ejeo de outro eltron (OE+. );
parte ou todos os ons moleculares decompe-se posteriormente, levando aos fragmentos.
somente reaes unimoleculares so importantes na fragmentao por IE; a presso da amostra
baixa o suficiente para evitar reaes entre ons e molculas.
ionizao branda: aumentando a presso da cmara de ionizao para ~100 Pa (0,75 Torr), se
garante que a molcula da amostra sofrer centenas de colises antes de sair.
bombardeamento por eltrons no metano ou outros gases a tais presses em uma fonte inica
+
fechada (sada para o vcuo pequena) produz os ons reagentes em abundncia como o CH5
.
eles reagiro com a amostra atravs de reaes on-molcula; algumas sero bandas gerando
ons produtos estveis representando molculas no dissociadas.
+
subestruturas;
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maior intensidade
Perdas neutras lgicas: h somente um certo nmero de fragmentos neutros de pequena massa
que so comumente perdidos na decomposio dos ons moleculares;
a presena de um on importante separado do on de maior massa por uma massa anmala
indicativo que o ltimo no o on molecular;
perda de fragmentos neutros a partir do on molecular so aqueles comumente conectados por
ligaes simples;
+
Hidrocarbonetos
clivagem allica;
21
Exemplo: 5--pregnano
estereoqumica dos anis A/B tem efeito caracterstico neste processo: ismero 5--(cis)
a razo [m/z 149]/[m/z 151] menor do que no ismero 5-.
on significante m/z 54 vem de reao tipo Retro Diels-Alder, reao gera um fragmento
dieno e monoeno e pode ser bem especfica da ligao dupla, mesmo em molculas como
os terpenos e alcalides.
Hidrocarbonetos aromticos
on mais caracterstico desta srie corresponde a ruptura da ligao benzlica com perda
do maior grupo alquila;
on molecular diminui;
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+.
+.
reaes posteriores pela eliminao de CnH2n leva aos ons caractersticos OE a m/z 44,
+.
+.
Fenis
+.
ons (M - 18 )
- efeito orto
+.
(M - H2O) e (M - C2H4) .
+
on aclio mais abundante usualmente formado pela perda do maior grupo alquila,
apresentam as sries caractersticas a m/z 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, devido a
+
CnH2n+1CO e CnH2n+1 .
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steres
on molecular observado;
sofrem clivagem ;
MECANISMOS DE FRAGMENTAO
Na espectrometria de massas convencional as reaes so unimoleculares.
Fatores que influenciam a abundncia de um on:
CH3NH2+. e . CH2N+H3 podem ser mais estveis que seus correspondentes clssicos.
Regra de Stevenson
+.
estabilidade do produto neutro: H2 , CH4, H2O, C2H4, CO, NO, CH3OH, H2S, HCl,
CH2=C=O, CO2 ;
efeitos estricos/entropia.
Alcanos lineares
vrios grupos de picos separados por 14 u (srie separadas por grupos CH2); outros tem
separaes menores, 12 ou 13u (srie de ons separadas por CH e C);
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26
27
12
C = 12,00000000, ento
14
16
cada istopo tem um nico e caracterstico defeito de massa, e a massa do on, o qual mostra
o defeito de massa total, identifica sua composio isotpica e elementar.
exemplo: on com massa 43,0184 pode ser C2H3O+ e no pode ser C3H7+ (m = 43,0547) ou
C2H5N+ (m = 43,0421).
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Figura: Espectro de massas do 4-fenilcicloexeno e mecanismo de fragmentao do tipo retroDiels-Alder gerando seus principais fragmentos.
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IONIZAES BRANDAS
IONIZAO QUMICA
Baseia-se na transferncia de espcies carregadas entre um on reagente e a molcula
alvo, produzindo um on que pode ser analisado.Espcies formadas no modo positivo so
normalmente adutos entre a molcula alvo e ons pequenos como H+, H3O+ e NH4+ e, no modo
negativo, resulta da perda de prtons, captura de eltrons, dentre outros.
Gs
Helio
42
Metano
127
Vapor de gua
167
Isobutano
195
Amnia
207
se molcula for ionizada com pouco acrscimo de energia, fragmentao ser reduzida e o
on molecular ser mais abundante.
IQ - basicamente a molcula est rodeada pelos ons reagentes e a carga passa para a
molcula por uma interao qumica sem muita transferncia de energia.
prtons ou mesmo entidades grandes carregadas podem ser adicionadas a molcula sem
muita transferncia de energia.
gs reagente introduzido na fonte inica (~0,5 - 1,0 Torr) a uma concentrao de 104 :1 para
a amostra e ionizada pelo bombardeamento de eltrons (~500V).
o on R+. inicialmente formado pode reagir com outra molcula de R para formar espcies
inicas reativas que depois ataca a molcula M da amostra.
R + e-
R+. + 2e42
R+. + R
RH+ + M
R + MH+ (protonao)
mais comum: protonao que favorecida para molculas com afinidade por prton maior
do que o reagente.
abstrao de hidreto: comum para molculas com baixos valores da afinidade por prton
(alcanos).
troca de carga: favorecido para reagentes de alta energia de ionizao como hlio.
Exemplo: acetado de lavanduila (PA = ~8.7 eV); CH4 (PA= 5.7eV); (i-C4H8 = 8.5eV);
(NH3 = 9.0eV)
com metano: posterior fragmentao quase completa para a espcie CH5+ altamente
exotrmica.
CH4+ + CH4
C2H5+ + CH3
C2H5+ + CH4
C3H5+ + H2
Isobutano: tambm tem aplicao geral. Tem maior afinidade por prton do que metano,
menor grau de fragmentao (se ocorrer a ionizao).
IQ: sensibilidade e especificidade podem ser aumentadas para muitos compostos. Massa
molecular pode ser identificado. Menor fragmentao, gerando espectros mais simples e
mais fceis de serem entendidos. Ismeros qumicos e estereoismeros podem ser
distinguidos. Compostos podem ser seletivamente ionizados em misturas complexas.
Informao obtida complementar a IE.
CL/EM: a fase lquida entra na fonte de ons, vaporizada e se torna o reagente da IQ.
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Figura: Espectros de massas do acetato de lavanduila por ionizao qumica utilizando metano
isobutano e amnia, respectivamente, como gs reagente.
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Figura: Espectro de massas da Reserpina por impacto de eltrons e ionizao qumica utilizando
metano como gs reagente.
ELECTROSPRAY
nova e poderosa tcnica de ionizao, produzindo gotas altamente carregadas a partir de
solues.
mtodo de se gerar gotas altamente carregadas das quais ons so ejetados pelo processo de
evaporao.
Evaporao do on: um processo no qual ons so emitidos de gotas carregadas diretamente
para a fase gasosa.
pulveriza-se um lquido contendo ons pr-formados na forma de gotas carregadas e emisso
subsequente dos ons das gotas para a fase gasosa.
Electrospray e Ionspray: um campo eltrico gerado na extremidade do pulverizador
aplicando-se uma alta voltagem diretamente no pulverizador (4kV), com o contra-eletrodo
(1kV) localizado a milmetros. ons de uma determinada polaridade so preferencialmente
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atrados para as gotas pelo campo eltrico enquanto so separadas do lquido. A separao
incompleta e cada gota contm ons de ambos os sinais. Somente o excesso de ons de um
sinal se encontra disponvel para evaporao e somente uma frao deles que realmente
evaporam.
gera somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo eltrico.
operado a presso atmosfrica e temperatura ambiente.
limitada a baixo fluxo: 1-10 ml /min.
gera ons altamente carregados de compostos que possuam vrios stios de carga (peptdeos,
oligonucleotdeos). Situao vantajosa para a observao de espcies de alto peso molecular
onde cargas mltiplas produzem ons com valores de razo m/z na faixa de massas de um
instrumento tipo quadrupolo, permitindo a determinao rotineira de pesos moleculares de
compostos na faixa de kilodalton.
uma protena de peso molecular de 15.000 adicionada de 15 prtons, por exemplo, tem uma
razo massa/carga de 1000, sendo facilmente detectada por um quadrupolo.
Eleva a capacidade de se detectar e medir acuradamente o peso molecular de compostos que se
encontram bem alm da faixa de massa normal de um quadrupolo.
gotas altamente carregadas so dispersas em aerosol de um capilar em um forte campo eltrico
a presso atmosfrica. Gs quente e/ou seco aplicado nas gotas para auxiliar na evaporao
do solvente. ons multicarregados expelidos das gotas durante o processo de evaporao so
ento direcionados para um orifcio de entrada para a regio de vcuo do espectrmetro.
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um espectro de massas por ESI de uma protena caracterizado por uma srie de picos de ons
carregando nmeros diferentes de cargas (diferentes valores de massa/carga).
Software disponvel para converter a multiplicidade dos picos dos ons oriundo de cada
espcie em um nico pico correspondendo ao peso molecular da molcula neutra.
solventes tpicos so gua/Metanol 50/50 ou gua/ Acetonitrila contendo 1-5% de cido
actico ou frmico ;
concentrao de protena de 1-10pmol/ml.
ESI tem demonstrado futuro promissor na verificao de estruturas simples caracterizao de
substncias desconhecidas. Pode-se obter informaes em detalhes estruturais de ordens
maiores, isto , mudanas na conformao induzida por solventes, na desnaturao refletida no
grau de protonao, mudana hidrognio/deutrio e estabilidade CID.
Processo de emisso: mecanismo pelo qual ons podem ser emitidos de um lquido para a fase
gasosa.
proposto inicialmente por Irebane e colaboradores em 1976. Quando uma gota carregada
evapora no ar, um ponto crtico pode ser atingido no qual cineticamente e energeticamente
possvel para os ons na superfcie do lquido evapora para o ar.
Gerao da gota: gotas podem ser formadas de vrios modos, todos envolvendo o rompimento
da superfcie do volume de lquido com uma fonte de energia suficiente para sobrepor a
energia da superfcie. Em um nebulizador pneumtico, uma velocidade alta do jato de ar forma
gotas a partir do fluxo de lquido. Aplicao de um campo eltrico na extremidade do
nebulizador auxilia na disperso das gotas e gera uma carga lquida em cada gota.
ESI, um alto campo eltrico na superfcie do lquido cria um stress eltrico, que gera gotas
sem a necessidade de qualquer jato de gs.
50
51
IONSPRAY
Fonte de ons electronspray pneumaticamente assistido.
Caractersticas
alta sensibilidade para compostos biolgicos;
ons moleculares sem degradao trmica;
baixo consumo de amostra;
compatvel com uma variedade de mtodos de separao (CL, CZE);
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53
O processo de emisso
+
+ -+
-+-+-+
+ - + - + -+
+-+
++- -++- +
++--+
+ -+
-+
+-+
++-+
+-
+
+
+
Gota original
contm
ons de ambas as
polaridades sendo
uma predominante
Com a evaporao
do solvente, o campo
eltrico aumenta
e os ons se movem
para a superfcie
A um campo
eltrico
crtico, ons so
emitidos da gota
Resduo
involtil
permanece
como uma
partcula seca
Figura: Esquema do processo de emisso que ocorre em uma fonte de ons tipo eletronspray.
TERMOSPRAY
outro processo que cria gotas carregadas.
Operado a baixa presso e temperatura elevada, a qual necessria para o processo de
pulverizao e gerao de carga, entretanto, leva a decomposio trmica de algumas espcies
sensveis.
Gera ons de ambas as polaridades.
No h aplicao de um campo eltrico externo, devido principalmente a presso reduzida.
54
Figura: Esquema de uma espectrmetro de massas com fonte inica do tipo Termospray.
Termospray - Electrospray Ionspray: como fontes de um espectrmetro de massas capaz de
gerar ons pseudo-moleculares de compostos inicos e polares, as trs tcnicas diferem em
suas caractersticas. As diferenas se encontram principalmente em como as gotas so criadas
e carregadas e como os ons so amostrados, do que como os ons so realmente gerados.
Electrospray e Ionspray: operados a presso atmosfrica e temperatura ambiente. Geram
somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo eltrico. Podem gerar
ons altamente carregados de compostos que possuem vrios stios de carga.
baseada na dessoro por laser de ons orgnicos, uma tcnica inicialmente concebida no
incio dos anos 70.
tcnica de dessoro por laser assistida por matriz introduzida por Hillenkamp e Karas
(1988)
limitao de massa da dessoro por laser pode ser contornada colocando as amostras em
uma matriz slida ou lquida que contenha substncia que absorva na regio ultravioleta.
55
matriz serve para absorver a energia do laser e prevenir a decomposio das espcies de
interesse; isolar as biomolculas uma das outras para evitar agregao que deve interferir na
anlise; aumentar a produo de ons.
ferrlico
(cido
trans-3-metoxi-4-hidroxicinmico),
cido
cinmico,
cido
Laser:
a absoro da luz do laser leva a dessoro dos ons relacionados a matriz e a molcula
intacta.
o espectro de massas utilizando cido nicotnico como matriz dominado pelo pico do
tetrmero. Utilizando cido sinapnico, somente o on molecular da subunidade monomrica
observado, possivelmente porque a soluo dessa matriz denatura a protena. Isto indica
que a dessoro por laser pode refletir a conformao da molcula antes da dessoro.
56
protenas com pesos moleculares superior a 200.000Da tem sido analisadas, assim como um
grande nmero de glicoprotenas.
Anticorpo: contm pouco ou nenhum pico que possa ser atribudo a fragmentos formados
durante ou antes da dessoro.
melhores matrizes em termos de abundncia e reprodutibilidade dos espectros foram 4nitroanilina e 4-nitrofenol.
M a tr iz o a s p e c to c h a v e d o M A L D I - T O F - M S
L aser
o n s
M a tr i z
c o n te n d o
a a m o s tr a
D e te c to r
A lta
V o lta g e m
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58
Figura: Espectro de massas da albumina srica bovina obtida por analisador de massas do tipo
tempo de vo e laser para desorver e ionizar a molcula. Massa molecular de 66650 Daltons.
envolve exposio de uma amostra no voltil ao impacto com fragmentos de alta energia.
ionizao obtida pelo impacto de ons primrios com energia da ordem de 100MeV
anlise de massas efetuada com tempo de vo. 105 - 107 espectros so acumulados para se
obter ons estatisticamente suficientes.
59
LIQUID SIMS
a ionizao por
Liquid SIMS
acelerados a 30-35 kV colidem com uma amostra posicionada sobre uma superfcie e so
produzidos ons (ons secundrios).
tem sido utilizado para a anlise da superfcie de materiais inorgnicos (como SIMS) e, mais
recentemente, para substncias orgnicas pouco volteis (como LSIMS)
sugere-se que LSIMS seja mais sensvel devido possibilidade de focalizao para o feixe
de ons de Csio.
+
C s+
C s+
V ac = 8 kV
V ac + 35 kV
C s+
60
Tcnicas Hifenadas
seletividade da amostra pode ser ajustada , levando a uma maior velocidade de anlise ou
uma melhora nos limites de deteco.
CL/EM
CLAE tem se tornado uma das tcnicas mais utilizadas na anlise de compostos
orgnicos.
tem vantagens sobre a cromatografia com fase gasosa pois os compostos no precisam
ser vaporizados para a anlise, necessita-se menos pr-tratamento da amostra e tem maior
grau de seletividade .
Interfaceamento CL/EM
MBI - acoplamento via correia mvel
PBI - feixe de partcula (particle beam)
HNI - nebulizador aquecido
CF-FAB - FAB com fluxo contnuo
61
E s tr a t g ia d e In te r fa c e a m e n to C L /E M
E flu e n te d a C o lu n a
R e m o o d o S o lv e n te
N e b u liz a o
Io n iz a o D ire ta
S o lu to V a p o riz a d o
Io n iz a o
D e sso lu o d a g o ta
Io n iz a o n a fa se g a s o sa
C F -F A B
M B I, P B I
E v a p o ra o d o o n
T S P , E S I, H N I
62
Polar
Inico
MBI
PBI
TSP , HNI
ml/min
l/min
CF-FAB
ESI
ESI
Fase Normal
(Fase Mvel
ex. Hex./solv.
Polar 9:1)
Fase Reversa
(Fase Mvel
gua/Metanol
(8:2)
Ion-exchange
Ion-par
sensibilidade
especificidade no volteis e compostos
Cromatografia lquida est rapidamente se tornando o mtodo de escolha na separao de
compostos que no podem ser analisados por cromatografia gasosa devido a sua baixa
volatilidade.
o eluente de uma coluna cromatogrfica de grande dimetro introduzido diretamente na fonte
API onde o lquido pulverizado em um vaporizador aquecido brandamente.
rpida retirada do solvente e vaporizao das gotas minimiza a decomposio trmica e
preserva a identidade molecular para a ionizao por transferncia de prton na fonte APCI.
introduo de toda a amostra da coluna resulta no limite de deteo na faixa do picograma.
tampes so tolerados pela fonte a presso atmosfrica sem problemas de contaminao
significante e a rpida vaporizao do eluente pulverizado permite o uso de 100% de gua.
Descrio da Interface
consiste em um pulverizador acoplado a uma cmara aquecida de dessoluo/vaporizao.
o eluente flui atravs de um tubo de ao inoxidvel de grande dimetro diretamente a um
nebulizador onde convertido em uma neblina fina por um jato de ar ou nitrognio a alta
velocidade.
gotas so carreadas por uma capa de gs.
o gs aquecido (120oC) e a mistura da amostra fluem do tubo para a regio de reao da fonte
de API onde a amostra quimicamente ionizada pela transferncia de carga ou de prton pelos
ons reagentes.
a fase mvel vaporizada atua como gs reagente, produzindo ons [M+H]+ no modo positivo e
[M-H]+ no modo negativo.
a cortina de gs previne que qualquer solvente, amostra ou tampo entre a regio do analisador
e mantm o sistema de vcuo, lentes e os polos do quadrupolo sem contaminao.
molculas agrupadas (clustered) so retiradas dos ons ao passarem pela cortina de gs e
pelo orifcio de amostragem atmosfera-vcuo.
a grande quantidade de solvente, amostra e tampo que so constantemente pulverizados para
a fonte so carreados pelo fluxo de gs para fora da regio de reao de 760 Torr. Uma bomba
de ar utilizada para bombear o gs para fora da fonte.
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Vaporizao da amostra
a incompatibilidade entre CL e EM tem sido a dificuldade de se converter molculas
relativamente no volteis solvatadas em um lquido em uma molcula gasosa sem induzir
decomposio excessiva.
processo nesta interface um de se dispersar o fluxo de lquido na forma de pequenas gotas
suspensas em um gs carreador.
a uma temperatura suficientemente alta, as gotas so vaporizadas a uma velocidade que
permite que molculas orgnicas intactas sejam dessorvidas das gotas ou partculas com o
mnimo de decomposio trmica.
o processo de evaporao por pulverizao rpida atua para preservar a identidade molecular
de compostos involteis e relativamente lbeis, para formar um vapor molecular no gs
carreador til para uma ionizao qumica branda.
Ionizao da amostra
as molculas da amostra vaporizada so carreadas no fluxo de gs direto para uma regio de
reao on-molcula a presso atmosfrica
a ionizao primria cria ons reagentes do vapor do solvente o qual flui atravs da regio.
a probabilidade de fragmentaes durante a ionizao pequena e resulta em ons moleculares
e quase-moleculares .Gera informaes sobre o peso molecular e o domnio dos ons quasemoleculares ideal para experimentos EM/EM onde se obtm informaes estruturais.
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100
tR
0
21.00
21.75
22.50
23.25
24.00
24.75
25.50
100
195
(B)
197
199
0
100
150
200
m/z
250
CG/EM
vem se tornando rotineiro desde a dcada de sessenta.
o acoplamento de um mtodo de separao como a cromatografia com fase gasosa com a
espectrometria de massas aumenta grandemente a especificidade da anlise e a CG/EM
atualmente uma ferramenta rotineira na anlise de misturas orgnicas complexas.
Aplicaes: estudos estruturais, para compostos desconhecidos, anlise de misturas (obter
informaes de muitos componentes ou identificar e quantificar alguns componentes).
Principais limitaes: vaporizao trmica da amostra seguida pela ionizao na fase gasosa;
somente molculas apolares ou de mdia polaridade, termoestveis e volatilizveis so
analisadas. Molculas polares somente so analisadas via derivatizaes.
Exemplo: acares, lcoois, cidos, molculas polifuncionalizadas.
maioria dos compostos de interesse biolgico no se vaporizam ao serem aquecidos.
Derivatizaes se faziam necessrias.
problemas com as colunas empacotadas: baixas eficincias das colunas e grande tempos de
reteno.
Colunas capilares permitem a separao de misturas com alta resoluo. Desta forma,
possvel analisar misturas cada vez mais complexas em espaos de tempo cada vez menores.
As quantidades de amostra que podem ser injetadas nas colunas capilares so muito pequenas,
acarretando a necessidade de injetores especiais e detectores mais rpidos e sensveis.
o espectrmetro de massas pode ser acoplado diretamente ao cromatgrafo a gs, de modo que
os componentes que eluem vo diretamente para a fonte de ons, que operam sob vcuo. Desta
forma, uma parte da coluna trabalha em presses baixas. Portanto, o controle do gs de arraste
mais crtico, havendo sempre alguma perda da eficincia da coluna.
Gases: hlio (melhor e mais caro) e Hidrognio (explosivo e mais barato). Com estes gases as
colunas capilares trabalham com maior eficincia de separao.
SCAN: velocidade de varredura dos espectros.
os tempos de varredura so suficientemente rpidos para permitir a obteno de vrios
espectros de massas completos durante a eluio de um nico pico (vrios espectros de massas
por segundo) na unidade de cromatografia com fase gasosa.
velocidade de varredura afeta a acurcia da medio on-molcula.
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ideal que sejam obtidos de 8 a 15 medidas de cada pico. Caso sejam efetuadas um nmero
menor de medidas, pode-se perder informaes do cromatograma, comprometendo a sua
resoluo.
J um nmero excessivo de medidas pode provocar o acmulo desnecessrio de informaes,
saturando a capacidade do disco e tornando demoradas as operaes de tratamento dos dados
adquiridos.
Cromatogramas de massas ou fragmentogramas: so o registro da variao da intensidade
correspondente aos ons de uma determinada relao m/z.
SIM : Monitoramento Seletivo de ons - MSI.
descreve a operao na qual as intensidades de vrios ons especficos so registrados ao invez
do espectro de massas inteiro.
alta especificidade e sensibilidade de deteco podem ser obtidos para compostos escolhidos
previamente.
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(A)
16.00
20.00
24.00
28.00
32.00
(B)
16.00
20.00
24.00
28.00
32.00
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SUMRIO CG/EM
VARREDURA LINEAR
DETECO SELETIVA
DETECO DE COMPONENTES
TRAOS
PERFIS DE DISTRIBUIO DE
FAMLIAS CONHECIDAS
NO EXISTE ESPECTRO DE MASSAS
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ENVOLVENDO
SEPARAO CROMATOGRFICA DE
MISTURAS COMPLEXAS
IONIZAO DE COMPOSTOS
SEPARADOS
SEPARAO DOS ONS
DETECO DOS ONS
ANLISE DA DISTRIBUIO DOS ONS
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(A)
(B)
Figura: Anlise de uma mesma amostra contendo fenantreno e antraceno (mesma concentrao,
mesmo volume de injeo). No se atenha a diferena no tempo de reteno. (A)
fragmentograma m/z 178; (B) Monitoramento seletivo do on m/z 178.
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H30
m/z 191
H29
T21
H31
T23
Ts
G
H33
H35
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
m/z 218
C27
R
C29
C28
S
35.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
Figura: CG/EM-MSI, fragmentos m/z 191 e m/z 218, ons caractersticos de srie de hopanos e
esteranos de frao de hidrocarbonetos alifticos de amostra de petrleo de bacia brasileira.
CZE/MS
tem emergido como uma aquisio importante no campo da qumica analtica, combinando
velocidade e alta eficincia de separao e baixo consumo de amostra gerado pela CZE, com
a sensibilidade e universalidade da espectrometria de massas.
CZE uma tcnica de separao de compostos inicos em um tubo aberto pela aplicao de
um gradiente de voltagem. Compostos migram diferentemente pelo tubo como resultado de
sua mobilidade eletrofortica. O fluxo eletroosmtico da CZE lquida uma tcnica
instrumentalmente simples, utilizando normalmente um capilar de slica fundida (50-100 cm)
contendo uma soluo tampo como coluna de separao, aplicando-se uma voltagem de 2076
60kV em uma das extremidades da coluna e com deteco UV ou fluorescncia atravs das
paredes do capilar.
Smith e colaboradores (1988) desenvolveram uma interface via electrospray para a CZE/MS,
sendo atualmente o mtodo de ionizao em espectrometria de massas mais favorvel.
a interface faz um contato eltrico com o tampo eletrofortico por intermdio de uma
pequena agulha ou um fino filme de metal depositado na superfcie do capilar. O solvente da
nebulizao produzida deste modo evaporado com N2 quente antes que os ons entrem no
analisador de massas.
Desvantagem da CZE: pequeno volume de amostra que pode ser injetado. Resultado a
necessidade de solues mais concentradas a ser injetadas do que ocorre na CL/EM.
uma interface via FAB com fluxo contnuo tambm foi descrita para CZE/MS. Nesta, o
efluente da CZE combinado com um fluxo de matriz glicerol-gua via um capilar de slica
fundida coaxial.
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formao de cargas mltiplas o que amplia a faixa de massa do analisador e permite a anlise
de biopolmeros na faixa de massa do kDa, uma aplicao tpica de CZE.
md+ + mn
instrumentos de baixa energia, se o gs for espcie quimicamente reativa, pode ocorrer uma
reao de associao on/molcula;
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mp+ + N
md+ + mn
classe de compostos pode incluir uma subestrutura particular que forma um on bem estvel.
ons pais derivados de membros desta classe tendem a se dissociar levando a um on desta
subestrutura. Quando h um on filho comum, este pode ser fixado e se faz uma varredura
para detectar todos os ons pais.
EM/EM: limites de deteco melhores do que um espectrmetro de massas de estgio nico.
A sensibilidade e limite de deteco de um espectrmetro de massas no est limitado pelo
rudo do detector mas pelo rudo qumico.
Rudo Qumico: sinal medido no espectro de massas devido a gerao de ons de outros
componentes da amostra, contaminao de fundo da amostra do sistema de introduo de
amostra e da fonte de ons do espectrmetro de massas.
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campo. Outros instrumentos tm regies de reao nos quais campos eltricos so utilizados
para confinar um fragmento.
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devido ao tamanho, polaridade e baixa volatilidade dos peptdeos e protenas, sua anlise por
espectrometria de massa s se tornou realmente til aps a descoberta da tcnica de ionizao
por dessoro, a PDMS em 1974 e FAB em 1981.
necessrio que a tcnica seja aplicada a
protenas/peptdeos simples
protenas/peptdeos conjugados (a carboidratos, lipdeos, fosfatos)
Produzindo
= (M+nH)/n
segue-se que a MM (M=n(m-H)) pode ser rapidamente calculada pela razo massa para carga
medida se n for achado.
pode-se determinar n atravs de qualquer dois picos consecutivos diferindo de um prton na
srie
m2 =(M+nH)/n
m1= (M+(n+1)H)/(n+1)
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