Meza Aguilar Rosa Guadalupe

Departamento de Fisiologa, Biofsica y Neurociencias

Mtodos de Biologa Celular Avanzada
Biosntesis de esteroides gonadales
La reproduccin de los roedores, como en otros rdenes de mamferos, est
relacionada con la funcin de las gnadas, en las cuales se lleva a cabo la
gametognesis y la produccin de hormonas, destacando entre stas las hormonas
esteroides (HE). Las HE regulan diferentes procesos en la biologa reproductiva de las
especies (v. gr. despliegue de caracteres sexuales secundarios durante la poca de
apareamiento) y se clasifican, tanto por sus caractersticas fsico-qumicas como por
su funcin, en progestinas, andrgenos, estrgenos y corticosteroides
(mineralocorticoides y glucocorticoides).A los tres primeros grupos de hormonas
tambin se les conoce como hormonas esteroides sexuales debido a su participacin
en diversos procesos de la reproduccin sexual. La progesterona (P4) es la hormona
esteroide representativa de las progestinas; la testosterona (T) de los andrgenos y el
estradiol (E2) de los estrgenos.
Cada una de estas hormonas tiene un papel en la funcin reproductiva; por ejemplo, la
P4 coadyuva a la implantacin del embrin sobre el endometrio; la T regula etapas
especficas de la espermatognesis y el E2 estimula la ruptura del folculo durante el
proceso de la ovulacin.
En los machos la produccin de andrgenos, y en particular de la T, se lleva a cabo en
las clulas de Leydig del tejido intersticial. Su sntesis se inicia con la
biotransformacin del colesterol en pregnenolona (P5), esteroide a partir del cual se
biosintetizan los cuatro grupos de HE. La produccin de andrgenos, como son la
dehidroepiandrosterona (DHA), el androstendiol (AD), la androstendiona (A) y la T, se
efecta por dos vas esteroidognicas alternas: la 5 y la 4. Esta terminologa se
refiere a la posicin del enlace insaturado de los esteroides intermediarios que se
forman durante los procesos de sntesis de la testosterona. Los
esteroidesintermediarios de la va 5 son la 17hidroxi-pregnenolona (17P5), la DHA y
el AD. Por su parte, en la va 4 los esteroides intermediarios son la P4, la 17hidroxiprogesterona(17P4) y la androstendiona (A4). El que prevalezca una va sobre la otra
depende de la especie; por ejemplo, en ratones (Mus musculus ) y ratas
(Rattusnorvegicus) de laboratorio la va que predomina es la 4 (Henricks, 1991). La
conversin de pregnenolona a testosterona en la va referida como la de la
progesterona o la 4 requiere la accin de la actividad de cinco enzimas contenida en
tres protenas: 3 b-hidroxiesteroidedeshidrogenasa y 5,4 isomerasa; 17--hidroxilasa
y 17,20-liasa; 17--hidroxiesteroidedeshidrogenasa. La ruta 4 se muestra en el lado
derecho de la figura 1. La va 5 que es tambin referida como la de la
dehidroepiandrosterona se muestra en el lado izquierdo de la misma figura, y al
parecer es la que predomina en los testculos humanos. Las cinco actividades
enzimticas estn localizadas en la fraccin microsomal de los testculos de rata, y hay
una asociacin funcional cercana entre las actividades de la 3-OHSD y 5,4
isomerasa y entre las de la 17-hidroxilasa y la 17,20-liasa. Estos pares de enzimas,
ambos contenidos en una misma protena, se muestran en la secuencia general de
reaccin de la figura 1.
La testosterona puede ser considerada una prohormona, ya que es convertida en
un compuesto mucho ms potente (dihidrotestosterona DHT) y ya que su conversin
ocurre fuera de los testculos. Una fraccin de estradiol se forma a partir de la
aromatizacin perifrica de la testosterona en los machos como se muestra en la
figura 2. La aromatizacin perifrica de la testosterona a estradiol E2 representa el
80% de la produccin de sta ltima en machos.
Finalmente, la conversin de androstendiona A4 a estrona E1 por aromatizacin es la
mayor fuente de
este estrgeno en machos, e incluso en las mujeres

postmenopusicas. La sntesis de E1 representada en la figura 3 es casi exclusiva del

ovario. En machos, bajo ciertas condiciones como la criptorquidia o la castracin, o
incluso en infecciones parasitarias como por Tripanosoma cruzi, puede llegarse a
sesgar la va metablica hacia la formacin de E1, ya que las enzimas
esteroidognicas para la biosntesis estn presentes.
En los machos, la concentracin alta de hCG por produccin o administracin
ectpica, estimula la esteroidognesis y la actividad de aromatasa en las clulas de
Leydig testiculares, con lo cual aumenta la produccin de estrgenos.
Finalmente, tambin un aumento en el nivel de adenosn monofosfato cclico
(AMPc) que funge como segundo mensajero en la va de transduccin, provoca la
estimulacin de la sntesis de testosterona en las clulas de Leydig.

Fig.1

La ontogenia de los eventos fisiolgicos, endocrinos y etolgicos, caractersticos de su

respectiva biologa reproductiva, est ampliamente documentada en la rata y el ratn
de laboratorio (Chambers 1995, Meites 1995, Ojeda &Urbanski 1994, vomSaalet al.
1994, Vornbergeret al. 1994). En esta prctica se evalu la produccin de 17-ahidroxiprogesterona 17-a-OHP4, androstenediona A4, testosterona T, 17-b-estradiol
(E2) y estrona E1(intermediarios 4), a partir de la biotransformacinin vitro de
progesterona P4 y androstendiona A4 en los testculos de rata.

Fig.2
Esteroides sexuales de referencia
Se usaron 4-pregneno-3,20-diona (progesterona, P4); 17-hidroxi-4-pregneno-3,20diona (17-hidroxiprogesterona, 17P4); 4-androsteno-3,17-diona (androstendiona, A);
17-hidroxi-4-androsteno-3-ona (testosterona, T),estrona E1 y 17 estradiolE2.
Preparacin de medios
El medio base para el cultivo contena 500 mL de agua, DMEM, albmina de suero
bovino al 0.1% , antimictico al 1%, ajustado a pH 7.4. Se prepararon dos medios a
partir de ste para las distintas etapas del cultivo primario de clulas testiculares. El
primer medio para las clulas contena 20 mL del medio DMEM de base, al que se le
agreg 3 mg de colagenasa para la disgregacin tisular; el medio que servira para la
estimulacin de la biosntesis esteroidognica contena 50 mL del medio DMEM de
base a los que se les aadi 1.2 mg de xantina /100 mL de DMEM y 200 mg
dehCG/mL de medio. Los medios se filtraron en la campana de cultivo para
esterilizarse.

Homogeneizacin de tejidos
Se sacrificaron dos ratas machos, una para hacer el seguimiento de la biosntesis a
partir del precursor progesterona P4 y la otra para el seguimiento de la biosntesis a
partir del precursor androstendiona A4. Se extirparon y se disecaron los testculos, se
retir la tnica albugnea y se partieron en tres fragmentos cada uno colocando el
tejido gonadal en el medio con colagenasa para someterlos posteriormente a vigorosa
agitacin durante 20 min a 37 C para disgregar los tbulos seminferos y obtener una
suspensin homognea. Se filtr la suspensin y se desech el lquido filtrado,
recuperando nicamente el tejido homogeneizado al que se le adicionaron 20 mL de
medio de base y se centrifug a 1500 rpm durante 10 minutos. La pastilla celular que
se obtuvo se recuper decantando el medio y nuevamente se le adicion 20 mL de
medio de base, se resuspendieron las clulas y se volvi a centrifugar. La pastilla
celular que se obtuvo esta vez se recuper decantando nuevamente, y por cada 100
mL de material celular se agreg 1 mL de medio adicionado con xantina y hCG. De
cada una de las dos suspensiones que se obtuvieron en paralelo (una de cada rata)
se hicieron 6 alcuotas colocando 1/6 del volumen total en distintos viales. En total se
obtuvieron 12 alcuotas de tejido homogeneizado. Se realiz el conteo celular en la
cmara de Neubauer obtenindose una concentracin de 1804000 cl viables/mL.
Biotransformacin de progesterona P4 y androstendiona A4 tritiados
De las 12 alcuotas, a cuatro de ellas (el ensayo se hizo por cuadriplicado) se les
aadi 3H-P4 para evaluar la biotransformacin del precursor 3H-P4 en cada uno de los
esteroides sexuales a analizar; dos alcuotas se emplearon como blanco de este
experimento; y a otras cuatro se les aadi 3H-A4 para evaluar tambin la
biotransformacin del precursor 3H-A4, quedando las dos alcuotas restantes como sus
respectivos blancos.
Los viales experimentales (con precursores tritiados) y los viales de blanco (sin
precursores tritiados), se incubaron a 35-37 C durante 2 h. Para detener las
reacciones metablicas se congelaron los viales y se almacenaron hasta su anlisis.
Extraccin de Esteroides Totales.
La extraccin de los esteroides totales contenidos en las alcuotas de cada
homogeneizado se hizo con ter dietlico. Una vez mezclado vigorosamente el
disolvente y el homogeneizado durante un minuto, esperamos 20 minutos para que se
separaran bien la fase etrea y la acuosa. La fase orgnica que contena el extracto
total de esteroides se separ de la fase acuosa colocando los viales en hielo seco:
acetona. Congelada la fase acuosa, la fase orgnica se decant a otro vial y se
evapor a sequedad en bao mara.
Separacin y Valoracin de Esteroides Sexuales.
A cada vial conteniendo su correspondiente extracto total de esteroides, as como a
cada vial control, se le agregaron 100 L de etanol que se transfirieron a
cromatoplacas cubiertas con gel de slice. Se aplicaron 20 L de cada una de las
muestras y los blancos colocando gota a gota y evaporando con nitrgeno para evitar
la prdida de los metabolitos. Los precursores, intermediarios y productos
(progesterona
P4,
17-hidroxi-progesterona17-OH-P4,
androstendiona A4,
testosterona T, estrona E1 y 17-estradiol E2) obtenidos por la biotransformacin de
los precursores 3H-P4 y 3H-A4 que estaban contenidos en los extractos y blancos
aplicados sobre las cromatoplacas, se separaron por cromatografa sobre capa fina
CCF, utilizando como fase mvil el sistema cromatogrfico diclorometano:acetato de
etilo: (8:2, v/v). La zona correspondiente a cada uno de los esteroides de referencia
aplicados en las cromatoplacas, se visualiz con una lmpara de UV y con cido
sulfrico.

Luego se cuadricul la cromatoplaca y se cort para cada muestra y blanco el rea del
esteroide a ser valorado que coincida con la distancia relativa de separacin (Rf) de
cada esteroide de referencia. El esteroide adsorbido al slice en cada recorte se
separ con disolucin de centelleo y la elusin se recolect en viales de vidrio para
cuantificar el metabolito radiactivo en un espectrofotmetro de centelleo lquido.
La produccin de T, E1, E2 y sus intermediarios 4 se estim a partir de valorar el
porcentaje de biotransformacin de los precursores3H-P4 y 3H-A4 en cada uno de los
esteroides biosintetizados.
Resultados

Los
resultados que se presentan en la siguiente tabla corresponden a los cpm y a los
porcentajes de biotransformacin de las muestras tratadas con el precursor 3H-A4.

Resumen de los resultados:

Discusin:
Fig.3 Produccin de
esteroides
sexuales (ES) por
los testculos de
ratas
Winstar
machos
adultas
con el precursor
3
H-A4
.
La
produccin de T
(testosterona),
estrona E1 y 17estradiol

E2 estn
referidas como el
porcentaje
de
biotransformacin

Produccin total de esteroides sexuales. Al analizar la

produccin de los esteroides sexuales testosterona T,
estrona E1 y 17-estradiol E2 a partir de la biotransformacin
por los testculos de las ratas Winstar adultas machos,
se constat que el esteroide de mayor produccin fue
la de T seguida por la de E2 y E1, respectivamente
(Fig. 3) siendo la produccin de T con respecto a la de
los estrgenos E1 y E2 significativamente muy
superior. En casi todas las muestras la E1 estuvo por debajo del

rango mnimo de deteccin o quenching (radiactividad detectada por

el espectrofotmetro en los viales que contienen nicamente el lquido
de centelleo) por lo que los datos no nos permiten estimar su
produccin pero si nos dan informacin de que es mnima ya que esta
tcnica es muy sensible.
Como partimos del precursor A4 y obtuvimos un alto porcentaje de biotransformacin en
testosterona (superior a 50% en todas las muestras), estos resultados nos permiten constatar

la eficiente conversin hacia testosterona mediante la ruta metablica 4 y de hecho, aunque

los datos no son mostrados aqu (resultados tratados y presentados por Helga Palma,
integrante del equipo de trabajo), la presencia de niveles crecientes de produccin encontrados
en 17P4, A4 y T, intermediarios de la ruta 4 sugieren que esta ruta esteroidognica predomina
en la biosntesis de andrgenos en la rata Winstar, tal como podra esperarse de acuerdo a lo
reportado en la literatura. Sin embargo, para evaluar la eficiencia de la va 5 alterna en la rata
Winstar sera necesario evaluar tambin la produccin de los respectivos esteroides
intermediarios (17P5, DHA y AD). Por otro lado, para que las condiciones fueran ptimas en la
realizacin de este experimento y el aprendizaje de la tcnica de ccf y seguimiento por marcaje
radiactivo, las ratas de las que se obtuvo el tejido intersticial testicular rico en clulas de Leydig
eran machos adultos, edad en la que la esteroidognesis alcanza su mximo. Adems se
aadi al medio de cultivo hCG que estimula la esteroidognesis en machos principalmente
para la sntesis de estrgenos, que de otro modo, podra se que no se detectara. Estos
resultados son acordes a lo que sucede fisiolgicamente en la esteroidognesis testicular, en la
que la sntesis de estrgenos es reducida, a diferencia de la ovrica, lo que resulta lgico si
consideramos la importancia estrognica en diferentes procesos de la maduracin y
reproduccin sexual femenina. Por otro lado, la sntesis de E2 es ms alta que la de E1 lo que
parece coherente si consideramos que el sustrato para el complejo enzimtico aromatasa en la
sntesis de E2 es la testosterona mientras que el sustrato para la aromatasa en la sntesis de
E1 es A4 y la ruta 4 favorece en primera instancia la sntesis de testosterona en gran
proporcin, lo que hace que el sustrato para la formacin de E2 se halle en exceso mientras
que la A4 prcticamente se agota y queda sin sustrato la enzima para la sntesis de E1.
La tcnica de cromatografa en capa fina para el seguimiento de la biosntesis de andrgenos
es una tcnica muy sensible con la ventaja de ser relativamente sencilla en la prctica, y nos
proporciona informacin valiosa para identificar distintos metabolitos en un mismo experimento
si se cuenta con los estndares apropiados y con sistemas de disolventes que permitan la
correcta resolucin de las muestras. Los datos que obtuvimos nos permiten establecer que en
ratas macho Winstar la produccin gonadal de testosterona sigue principalmente la va 4 y
que en esta etapa de madurez sexual los porcentajes de produccin andrognica son elevados,
lo que da cuenta de la importancia crtica de los andrgenos, principalmente la testosterona,
para la reproduccin masculina.

Referencias:
Murray R, Granner D; Mayes P, Rodwell V; HarpersillustredBiochemistry; 26 ed;
McGrawHill;2003
Doyle A; Griffiths B; LaboratoryProcedures in Biotechnology; Wiley; 1999
Salame-Mndez et al.: Evaluacin de esteroides en testculos del ratn de orejas
obscuras. Acta Zoologica Mexicana (n.s.) 20(2): 103-114 (2004)
Henricks, D. L. 1991. Biochemistryandphysiologyofthe gonadal hormones. Chp 3. Pp.
81-118In: Perry T. Cupps (Ed.) Reproduction in domesticanimals. AcademicPress, Inc.,
San Diego,CA. USA.