MTODO DO INDOFENOL

PARA DETERMINAO DE NITROGNIO EM AMOSTRAS DE SOLO

Fernanda Veronesi Marinho Pontes
Bolsista de Inic. Cientfica, Qumica Tecnloga, UFRJ
Maria Ins Couto Monteiro
Orientadora, Qumica Analtica, D. Sc.
Llian Irene Dias da Silva
Co-orientadora, Fsico-Qumica, M. Sc.
Manuel Castro Carneiro
Co-orientador, Qumica Analtica, D. Sc.

RESUMO
destilador. A melhoria experimental
diminuiu os valores de branco em
cerca
de
73%,
reduzindo
consequntemente o limite de
deteco (65%). O conhecimento da
estabilidade do indofenol torna o
mtodo flexvel, particularmente
quando um grande nmero de
amostras deve ser analisado. A
soluo
de
nitroprussiato-fenol
apresentou estabilidade de at pelo
menos 29 dias, reduzindo o tempo de
trabalho e o consumo dos reagentes.
Os resultados mostraram boa
preciso (RSD < 8%) e no
apresentaram diferena significativa
dos valores certificados de Ntotal,
quando aplicado o teste t-pareado,
para um nvel de confiana de 95%.

Foi
utilizado
o
mtodo
Kjeldahl/indofenol para determinao
de Ntotal em trs materiais de
referncia certificados de solo, NCS
DC 73319, 73321 e 73326. O mtodo
do indofenol para a determinao de
NH4+ se baseia na formao de um
composto azul intenso, resultante da
reao do on amnio com um
composto fenlico na presena de
um oxidante e um catalisador. O
mtodo
geralmente
apresenta
valores altos e variveis de branco.
Portanto, foi proposta a utilizao de
um banho termostatizado, contendo
gua Milli-Q, para estabilizar a
temperatura do condensador e
fornecer
gua
isenta
de
contaminao para a caldeira do

1. INTRODUO
A determinao de nitrognio total (Ntotal) em solos e outros materiais
heterogneos complexos contendo vrias formas de nitrognio apresenta
muitas dificuldades, sendo maiores com solos, devido ao desconhecimento

das formas de nitrognio presentes na amostra. A concentrao de Ntotal em

solos varia de < 0,02% em sub-solos a > 2,5% em turfas (BREMNER 1965).
O mtodo Kjeldahl tem sido utilizado desde 1883 para a determinao de
Ntotal em diferentes materiais (YASUHARA e NOKIHARA 2001). baseado
na converso do N a on amnio (NH4+) por digesto da amostra com cido
sulfrico concentrado, contendo catalisadores que aceleram a oxidao da
matria orgnica. O NH4+ ento convertido, em meio bsico, a NH3, que
recolhida em meio cido, e transformada em NH4+ (BREMNER 1965).
O on NH4+ tem sido determinado por diferentes mtodos, sendo que os mais
utilizados so os mtodos espectrofotomtricos: mtodo do indofenol (reao
de Berthelot), procedimento de difuso de gs/indicador cido-base e do
reagente de Nessler. O mtodo colorimtrico de Berthelot, geralmente
apresenta valores altos e variveis de branco, e na faixa de concentrao
micromolar, a preciso raramente melhor que cerca de 10% (PATTON e
CROUCH 1977). Outros mtodos tambm utilizados so a titrimetria e
eletrodo on seletivo (VAN STADEN e TALJAARD 1997). Para anlise de
solos geralmente utilizado o mtodo titrimtrico (BREMNER 1965,
EMBRAPA 1999).
O mtodo do indofenol para a determinao de NH4+ se baseia na formao
do composto azul intenso de indofenol, resultante da reao do on amnio
com compostos fenlicos na presena de um agente oxidante. Os reagentes
oxidantes utilizados foram: hipoclorito (SCHEINER 1976, VERDOUW et al.
1977, VAN STADEN e TALJAARD 1997, KEMPERS e KOK 1989) e dicloro
isocianato de sdio (DCIC) (Mc LEOD 1992). Os compostos fenlicos
utilizados foram: fenol (SCHEINER 1976, VAN STADEN e TALJAARD 1997),
o-fenilfenol (KANDA 1995) e o salicilato (VERDOUW et al. 1977, KEMPERS
e KOK 1989, Mc LEOD 1992). Foram utilizados diferentes catalisadores,
principalmente o nitroprussiato de sdio (SCHEINER 1976, VERDOUW et al.
1977, KEMPERS e KOK 1989, KANDA 1995, STANDARD METHODS 1998)
e o ferrocianeto de potssio (VERDOUW et al. 1977). Apesar do mecanismo
da reao no ser conhecido em detalhes, geralmente a reao pode ser
assim representada, quando so utilizados o fenol e o hipoclorito
(SCHEINER 1976, VERDOUW et al. 1977):
NH3 + 2

O + 3ClO

O + 2H2O + OH + 3Cl

Foi observado que o mecanismo da reao de formao do indofenol

dependente da luz, temperatura, catalisador e pH. Foram obtidos bons
resultados, quando o mtodo foi aplicado anlise de guas, utilizando luz
UV durante o desenvolvimento da cor, na presena do catalisador
ferrocianeto de potssio. Contudo, alguns pesquisadores observaram que o
desenvolvimento da reao no escuro elimina as interferncias induzidas
pela luz, utilizando nitroprussiato como catalisador. Alguns autores preferiram
a utilizao de ferrocianeto de potssio a nitroprussiato de sdio, devido
maior estabilidade da cor , tanto na luz quanto no escuro. O aumento da
temperatura afetou a velocidade de formao do indofenol, mas no
influenciou o comprimento de onda de mxima absoro (VERDOUW et al.
1977).
O mtodo do indofenol, utilizando a soluo de nitroprussiato- fenol tem sido
estudado e aplicado para anlise de guas de superfcie e subterrnea
(FEEMA 1983), guas (VAN STADEN e TALJAARD 1997), guas doces
(VERDOUW et al. 1977, SCHEINER 1976), guas de despejo (SCHEINER
1976), efluentes industriais (VAN STADEN e TALJAARD 1997, FEEMA 1983)
e gua do mar (KANDA 1995). Para anlise de solos e plantas foi empregado
o mtodo do indofenol, utilizando nitroprussiato-salicilato e como oxidante,
DCIC (Mc LEOD 1992), sendo que a faixa de deteco foi de 5 -100 mg L-1NNH4+. Na literatura no foi encontrada aplicao do mtodo do indofenol,
utilizando nitroprussiato-fenol e o agente oxidante hipoclorito, para anlise de
solos.
Para maior exatido do mtodo do indofenol, so recomendados alguns
procedimentos, quais sejam: a) todos os reagentes devem estar
temperatura ambiente; (b) as solues-amostra devem ser protegidas da luz,
caso as absorvncias sejam lidas no dia seguinte ao do desenvolvimento da
cor; (c) estocar o reagente nitroprussiato-fenol em um frasco de vidro mbar
e refrigerado, devido ao escurecimento do reagente com o tempo,
especialmente quando exposto diretamente luz solar; (d) preparar o
reagente nitroprussiato-fenol a cada 3 semanas e (e) testar, antes do uso, o
reagente nitroprussiato-fenol, preparado h 2 semanas, com pelo menos um
padro (SCHEINER 1976).

2. OBJETIVO
O trabalho uma continuao daquele apresentado por Ferreira et al.
(2004), e teve como objetivo implementar e otimizar o mtodo do indofenol,
utilizando nitroprussiato-fenol e hipoclorito de sdio, para a determinao de
nitrognio Kjeldahl total em amostras de referncia certificadas de solo. Foi
proposta uma modificao para diminuir os valores do branco e do limite de
deteco do mtodo. As estabilidades do reagente nitroprussiato-fenol e da
cor do indofenol foram estudadas.
3. MATERIAIS E MTODOS
3.1. INSTRUMENTAL
Para a digesto das amostras foi utilizado um bloco igestor TE-008/25 com
capacidade para 8 provas micro, fornecido pela Tecnal (Piracicaba-SP,
Brasil). Foi construdo um sistema de vidro pyrex e utiizado vcuo para
suco do SO3, produzido durante a digesto das amostras.
Para a destilao da amnia foi utilizado um destilador modelo TE 036/1
Tecnal. Um banho ultratermostato Nova tica, contendo gua Milli-Q foi
acoplado ao destilador.
Foi utilizado um espectrofotmetro Perkin-Elmer Lambda 12/1.0 nm (1.3) UVVis, celas de 1 cm de caminho ptico, para medidas de absorvncia no
comprimento de onda de 630 nm, para as determinaes da espcie N-NH4+.
3.2. REAGENTES, SOLUES E AMOSTRAS
Todas as solues foram preparadas utilizando reagentes de grau analtico
(P.A.). gua destilada e deionizada foi purificada em um sistema Milli-Q.
Foram utilizados cido sulfrico e hidrxido de sdio, fornecidos pela Vetec
Qumica Fina Ltda.; sulfato de cobre, sulfato de potssio, cloreto de amnio,
fenol e nitroprussiato de sdio fornecidos pela Merck; hipoclorito de sdio da
Isofar. Foram utilizados trs materiais de referncia certificados de solo, NCS
DC 73319, 73321 e 73326. Foram preparadas as seguintes solues padro
para a construo da curva analtica:

Soluo - padro estoque de amnio 100 mg L-1 N-NH4+: dissolveram-se

0,382 g de NH4Cl anidro, previamente seco a 100oC, em gua e diluiu-se
para 1000 mL.
Soluo - padro intermediria de amnio 10 mg L-1 N-NH4+: foram pipetados
5 mL da soluo estoque de amnia e diludos para 50 mL com gua em
balo volumtrico. A soluo foi utilizada logo aps o seu preparo.
Solues - padro de amnio 0,1 a 0,5 mg L-1 N-NH4+: foram preparadas
solues - padro com concentraes finais de N na faixa e 0,1 a 0,5 mg L-1
em H2SO4 0,036 mmol L-1, diluindo-se adequadamente o padro
intermedirio. Quando as solues - padro foram submetidas s etapas de
digesto e destilao, foram utilizadas massas iniciais de NH4Cl contendo 5 a
25 g N. As solues foram usadas logo aps a sua preparao.
Na etapa de digesto foram utilizadas as seguintes misturas:
Mistura de digesto: sulfato de potssio e sulfato de cobre foram misturados
na proporo de 3:1 (em massa) e triturados num gral de gata.
Mistura cida digestora: a soluo foi preparada misturando-se 10 g da
mistura de digesto, 100 mL de gua e 100 mL de H2SO4 concentrado.
Para a etapa de destilao foram utilizadas as seguintes solues:
Soluo de hidrxido de sdio 10 mol L-1: foram pesados 400 g de NaOH e
dissolvidos em gua. A soluo foi avolumada com gua a 1000 mL.
Soluo de cido sulfrico 0,9 mmol L-1: adicionaram-se 25 mL de H2SO4
concentrado em cerca de 500 mL de gua. Aps arrefecimento da soluo
temperatura ambiente, avolumou-se com gua para 1000 mL. Pipetaram-se 2
mL desta soluo e diluiu-se novamente com gua para 1000 mL.
Para a reao colorimtrica foram utilizadas as seguintes solues:
Soluo de fenol e nitroprussiato de sdio - foram pesados 5 g de fenol e
0,025 g de nitroprussiato de sdio, dissolvidos em gua e misturados. O
volume da soluo foi completado com gua a 100 mL.
Soluo de hipoclorito de sdio e hidrxido de sdio - foram dissolvidos 2,5 g
de NaOH em um pouco de gua e misturados com uma soluo de
hipoclorito de sdio contendo aproximadamente 0,21% de cloro ativo. A
soluo foi avolumada para 100 mL com gua.Todo o material de vidro foi
mantido em soluo de Detertec (Vetec), faixa neutra, 5%v/v por 24h, e em
seguida, em soluo de H2SO4 10%v/v por 24 h. O material foi ento lavado
vrias vezes com gua deionizada.
5

3.1 PROCEDIMENTO
O procedimento de digesto, destilao e determinao espectrofotomtrica
do NH4+ pelo mtodo do indofenol foi idntico quele utilizado por Ferreira et
al.(2004).
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Estabilidade do reagente de nitroprussiato-fenol
Foi estudada a estabilidade do reagente nitroprussiato-fenol atravs da
preparao diria do complexo de indofenol em solues-padro de NH4Cl
em H2SO4 0,036 mmol L-1, contendo 0,1, 0,3 e 0,5 mg L-1 de N-NH4+, de
acordo com o procedimento descrito por Ferreira et al.(2004). O reagente
nitroprussiato-fenol foi estocado em recipiente de vidro, recoberto com papel
de alumnio, para evitar a incidncia da luz, e mantido em refrigerador (4C).
O reagente foi utilizado aps arrefecimento temperatura ambiente. Todos
os dados so estatisticamente equivalentes de acordo com os resultados do
teste t-pareado para um nvel de confiana de 95%. No h diferena
significativa entre os cinco primeiros e os cinco ltimos resultados em todas
as concentraes estudadas, indicando que o reagente permaneceu estvel
at pelo menos 29 dias.(Figura 1).
4.1 Estabilidade da cor do composto de indofenol em diferentes
concentraes de N-NH4+
O composto de indofenol foi desenvolvido em solues-padro de NH4Cl em
H2SO4 0,036 mmol L-1, contendo 0,1, 0,3 e 0,5 mgL-1 de N-NH4+, de acordo
com o procedimento descrito por Ferreira et al.(2004). As medidas de
absorvncia das solues foram subtradas do branco. As solues coloridas
foram mantidas em bales volumtricos de vidro transparente e
temperatura de cerca de 4 C, em refrigerador. As solues foram arrefecidas
temperatura ambiente antes das medidas de absorvncia. A Figura 2
apresenta o efeito do tempo na estabilidade do complexo do indofenol.
Recuperaes de 100% foram consideradas para as medidas realizadas
aps 30 min do desenvolvimento da cor. A cor foi considerada estvel para
recuperaes >90%. Considerando os resultados do teste t-pareado(P=0,05),
as solues permaneceram estveis at 8 dias, com exceo da soluo
mais concentrada, que se manteve estvel por apenas 48 horas.
6

(D)

Absorvncia

0.80

(C)
0.40
(B)
(A)
0.00
0

10

15

20

25

30

35

Tempo, dia

Figura 1. Estabilidade do reagente nitroprussiato-fenol, utilizado na

determinao de N-NH4+ pelo mtodo do indofenol. (A) branco; (B) 0,1 mg L-1 NNH4+; (C) 0,3 mg L-1 N-NH4+;(D) 0,5 mg L-1 N-NH4+. Cada ponto corresponde a uma
determinao.

120

120

(B)

(A)
100

100

80

80

60

60

40

40
0

10

20

30

10

20

30

Tempo, dia

Tempo, dia
120

(C)

Figura 2.. Estabilidade da cor

azul
do
indofenol em
diferentes concentraes de
N-NH4+ : (A) 0,1; (B) 0,3; (C) 0,5
mg L-1 N-NH4+. Cada ponto
corresponde a uma mdia de
3 determinaes.

100

80

60

40
0

10

15

20

25

30

Tempo, dia

4.2. Resultados analticos

Solues padro de NH4Cl foram submetidas s etapas de digesto,
destilao e determinao pelo mtodo do indofenol para determinao das
caractersticas analticas do mtodo (Tabela 1). Durante o estudo foram
observados valores altos de branco (absorvncia de 0,112 + 0,008). Sendo
assim, foi proposta a utilizao de um banho termostatizado contendo gua
milli-Q com a finalidade de: (a) estabilizar a temperatura do condensador do
destilador, garantindo a condensao total da amnia, e (b) fornecer gua
para caldeira, isenta de contaminao, para a diminuio do branco. Os
valores do branco e do limite de deteco foram diminuidos em cerca de 73 e
65 %, respectivamente, e foi verificada a obedincia lei de Beer na faixa de
concentrao testadas de 0,1 a 0,5 mg L-1 de N-NH4+ (R2 = 0,9974 + 0,0009)
As concentraes de nitrognio Kjeldahl total (NKT), com os desvios-padro,
das amostras certificadas de solo so apresentadas na Tabela 2. Todos os
resultados de NKT no apresentam diferena significativa dos valores
certificados de nitrognio total, validando o mtodo. O mtodo tambm
apresenta boa preciso (RSD < 8%).

Tabela 1. Caractersticas analticas do mtodo do indofenol

1

Absortividade molar (L.mol.cm- ) (n=4)

(2,3 + 0,2)x 10

Coeficiente de correlao (R ) ( n=3)

0,9974 + 0,0009

-1

+
N-NH4 )

sem banho termostatizado

0,089

-1

+
N-NH4 )

com banho termostatizado

0,031

Limite de deteco ( mg L
Limite de deteco ( mg L

-1

Faixa de concentrao da curva de calibrao( mg L

+
N-NH4 )

Medida de absorvncia do branco (n=10) sem banho termostatizado

0,1 - 0,5
0,112 + 0,008

Medida de absorvncia do branco (n=10) com banho termostatizado

0,030 + 0,006

Tabela 2. Resultados da determinao de NKT em amostras

certificadas de solos pelo mtodo do indofenol
-1

-1

Amostra

NKT (g g )

Valor certificado de N total (g g )

73319
73321
73326

1846 + 17 (3)
626 + 21 (4)
400 + 32 (8)

1870 + 54
640 + 40
370 + 43

Entre parnteses, o nmero de determinaes

5. CONCLUSES
A utilizao de um banho termostatizado, contendo gua Milli-Q para
alimentar a caldeira do destilador para o arraste da amnia diminuiu os
valores de branco e do limite de deteco em cerca de 73 e 65 %,
respectivamente.
As solues-padro contendo o composto indofenol em concentraes de 0,1
e 0,3 mg L-1 de N-NH4+ podem ser estocadas, a 4 C, por 8 dias, permitindo
flexibilizar o procedimento, particularmente quando analisado um grande
nmero de amostras. J a soluo-padro de 0,5 mg L-1 N-NH4+ pode ser
estocada por apenas 48 horas. O reagente nitroprussiato-fenol pode ser
estocado em frasco escuro a 4 C por pelo menos 30 dias, sem perda de
sensibilidade analtica.
Todos os resultados de NKT no apresentam diferena significativa dos
valores certificados de N total, validando o mtodo.
O mtodo apresentou boa preciso (RSD 8%).
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