BIOTECNOLOGIA

En trminos generales biotecnologa se puede definir como el uso de organismos

vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de
valor para el hombre.

Por tanto, podemos decir que la biotecnologa abarca desde la biotecnologa

tradicional, muy conocidas y establecidas, y por tanto utilizadas, como por ejemplo la
fermentacin de alimentos, hasta la biotecnologa moderna, basada en la utilizacin
de las nuevas tcnicas del DNA recombinante (ingeniera gentica), los anticuerpos
monoclonales y los nuevos mtodos de cultivo de clulas y tejidos.

La biotecnologa moderna est compuesta por una variedad de tcnicas derivadas

de la investigacin en biologa celular y molecular.
Estas tcnicas involucran la manipulacin deliberada de molculas de DNA con la
finalidad de la aplicacin comercial de organismos vivos modificados o de sus
productos.
Pueden ser utilizadas en cualquier industria que utilice microorganismos o clulas
vegetales o animales.

Biotecnologa microbiana
Es la disciplina que utiliza los microorganismos vivos o sus
productos en procesos industriales.
La biotecnologa microbiana se puede dividir en dos fases distintas:
1. Tecnologa microbiana tradicional, que se refiere a la fabricacin
a gran escala de productos que los microorganismos son capaces
de fabricar.
2. Tecnologa microbiana con organismos alterados genticamente
mediante procesos de ingeniera gentica.

Microorganismos Industriales y Productos Industriales

Su fuente es la naturaleza
No todos los microorganismos (MOs) tienen uso industrial
Los hongos (levaduras y mohos) y algunos procariotas (Streptomyces) son los mas
usados.
Se seleccionan los que producen uno o mas productos de inters
Se modifican gneticamente por mutacin o recombinacin para aumentar el o los
metabolitos de inters.
Las vas metablicas menores se reprimen o eliminan.
Pueden presentar propiedades de desarrollo pobres, prdida en la capacidad de
esporulacin, propiedades bioqumicas y celulares alteradas.
Las cepas modificadas son conservadas en los laboratorios de microbiologa de las
industrias y en distintas colecciones nacionales de microorganismos tipo.

Colecciones Nacionales de microorganismos tipo

Estn disponibles para fines docentes, de investigacin o industriales.
Las cepas que producen los mejores rendimientos (con derechos de propiedad o
patentadas) no estn en estas colecciones.

Mejoramiento de la cepa de Penicillum chrysogenum,

productora de la penicilina.
A travs de los aos y de numerosos procesos la
produccin de penicilina por el hongo Penicillum
chrysogenum pas de 1-10 ug/ml a 50.000 ug/ml.
Este incremento de 50.000 veces se obtuvo por el
mejoramiento de la cepa a travs de mutacin y
seleccin sin incluir manipulacin gentica y por
cambios en el medio y en las condiciones de
crecimiento. La introduccin de nuevas tcnicas
genticas condujo posteriormente a incrementos
mucho mas modestos en el rendimiento.
Conjunto de mutaciones realizadas por cuatro grupos de
investigadores para obtener una cepa de Penicillum
chrysogenum capaz de sintetizar penicilina para una
exportacin comercial. S, mutacin espontnea; X, rayos
X; UV, radiacin ultra violeta; NM, gas mostaza.
Los mtodos fermentativos habituales rinden ms de 20 g/litr

Requisitos de un microorganismo industrial

El microorganismo debe:
1- Producir la sustancia de inters
2- Obtenerse en cultivo puro
3- Ser genticamente estable.
4- Poder desarrollarse en cultivos a gran escala.
5- Poder mantener el cultivo del MO durante perodos largos en el
laboratorio y en la planta industrial.
6- Tener un tiempo de duplicacin bajo y fabricar el producto deseado
en un perodo corto.
Crecimiento rpido ocupar menos tiempo los equipos industriales
disminuir los riesgos de contaminacin.
mejor control de los factores ambientales
7- Ser susceptible de manipulacin gentica.
8-Crecer en medio de cultivo lquido relativamente barato y que se
obtenga en grandes cantidades.

Medios de cultivo industriales

Se usan muchas veces como medios de cultivo a gran escala
desechos carbonados provenientes de otras industrias.
-licor de maceracin del maz (rico en nitrgeno y factores de
crecimiento).
- suero de leche (contiene lactosa y minerales)
-otros materiales residuales de la industria con elevado contenido
en carbono orgnico.
9- En la industria se prefieren los MOs grandes como los hongos,
levaduras y bacterias filamentosas para poder separar las clulas
microbianas del medio de cultivo con facilidad ya que este proceso es
muy costoso a gran escala. Es mas econmico efectuar la separacin
por filtracin que por centrifugacin.

Condiciones que no debe tener un microorganismo industrial

Los microorganismos industriales no deben:
1- ser peligrosos para el hombre, animales y plantas de inters
econmico.
2- liberar toxinas, o si lo hacen deben poder ser eliminadas
fcilmente.

Los productos industriales de inters pueden ser de varios tipos:

1- Las clulas propiamente dichas, por ej. las levaduras cultivadas
para alimentos, panadera o cerveza.
2- Las sustancias producidas por las clulas. Ejemplos de estas
ltimas son:
- las enzimas como la glucosa isomerasa
- agentes farmacolgicos activos como los antibiticos,
esteroides y alcaloides
- productos qumicos y aditivos alimentarios como el aspartame,
edulcorante de alimentos y bebidas de bajas caloras (fabricado
a partir de L-fenilalanina mas L-cido asprtico); el L-glutamato,
utilizado para reforzar el sabor y para ablandar las carnes; el Laspartato y alanina para enriquecer el sabor de jugos de fruta;
la glicina para mejorar el sabor de alimentos edulcorados; la Llisina y la DL-metionina como aditivos nutritivos en alimentos
para animales.

Productos Industriales

Varias enzimas importantes de uso comercial son producidas por MOs, incluyendo enzimas que
digieren el almidn (amilasas), protenas (proteasas, renina) y las grasas (lipasas). Penicilina
acilasa es usada para producir penicilinas sintticas. Los metabolitos microbianos son otro grupo
importante de productos industriales. Estos metabolitos pueden ser productos de la fermentacin
como el etanol, ac. actico o ac. lctico; factores de crecimiento claves como los aminocidos, las
vitaminas, antibiticos, esteroides, alcaloides, etc.
Los agentes farmacolgicamente activos estn por lo general en la categora de
metabolitos secundarios.

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Crecimiento y formacin de productos en procesos industriales

El crecimiento microbiano comprende distintas etapas: fase de
latencia, fase exponencial y fase estacionaria.
Procesos donde lo que interesa es el metabolito microbiano.
Hay dos tipos bsicos de metabolito microbiano:
1- metabolito primario es el que se fabrica durante la fase
exponencial del crecimiento del microorganismo.
2- metabolito secundario es el que se fabrica cerca del final de la
fase logartmica de crecimiento, con frecuencia , cerca de la fase
estacionaria de crecimiento.

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Comparacin entre metabolitos primarios y secundarios

Metabolitos microbianos primarios
Un proceso tpico microbiano en el cual el producto de
inters se forma durante la fase primaria de
crecimiento es la fermentacin alcohlica (etanlica).
El etanol es un producto del metabolismo anaerbico
de la levadura y de ciertas bacterias, y se forma como
parte del metabolismo energtico. Dado que el
crecimiento slo se puede dar si se efecta la
produccin de energa, la produccin de etanol corre
paralelamente con el crecimiento.
Metabolismo microbiano secundario
Los
metabolitos
producidos
durante
la
fase
estacionaria suelen llamarse metabolitos secundarios y
son algunos de los ms comunes e importantes de
inters industrial. Este es el caso de la mayora de los
compuestos de inters farmacolgico como es el caso
de los antibiticos por ejemplo.

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Comparacin entre metabolitos primarios y secundarios

a) Metabolismo primario: formacin de
alcohol por la levadura. b) Metabolismo
secundario: formacin de penicilina por
el hongo Penicillium chrysogenum,
presentando la separacin de la fase de
crecimiento (trofofase), y la fase de
produccin (idiofase). Ntese en b) que
la penicilina no se produce hasta que el
crecimiento ha entrado en la fase media
y mayor parte del producto se forma
despus de que el crecimiento ha
entrado a la fase estacionaria. En
ambos grficos a) y b) los ejes son
aritmticos y no logartmicos.

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Trofofase e idiofase.
En el metabolismo secundario, las dos fases distintas del
metabolismo se denominan trofofase e idiofase. La trofofase es la
fase de crecimiento (el prefijo trofos, significa "crecimiento" )
mientras que la fase de produccin de metabolitos es la idiofase. Si
estamos tratando con un metabolito secundario debemos asegurar
que durante la trofofase se proporcionen las condiciones apropiadas
para un excelente crecimiento y que las condiciones se alteren
adecuadamente y en el momento oportuno para que la formacin del
producto sea excelente.

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Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas

las clulas, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre
un organismo y otro.
Las caractersticas reconocidas del metabolismo secundario son:
1- Cada metabolito secundario slo lo forman relativamente pocos
organismos.
2- Los metabolitos secundarios aparentemente no son esenciales para
el crecimiento y la reproduccin.
3- La formacin de metabolitos secundarios depende fundamentalmente
de las condiciones de cultivo, sobre todo de la composicin del medio.
Con frecuencia, se produce la represin de la formacin del metabolito
secundario.
4- Los metabolitos secundarios se producen como un grupo de
estructuras muy relacionadas. Por ejemplo, se ha encontrado que una
sola cepa de Streptomyces produce alrededor de 30 antibiticos
distintos, pero relacionados, del tipo antraciclina.
5- Se puede incrementar enormemente la sobreproduccin de los
metabolitos secundarios, mientras que los metabolitos primarios
asociados al metabolismo primario, habitualmente no pueden
sobreproducirse en la misma medida.

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Las va metablicas del metabolismo secundario surgen

del metabolismo primario.

El metabolito secundario, generalmente se produce a partir de varios

productos intermediarios acumulados ya sea en el medio de cultivo o en las
clulas, durante el metabolismo primario.
Las enzimas que intervienen en la produccin de metabolito secundario se
regulan por separado de las del metabolismo primario.
En algunos casos se han identificado inductores de metabolitos
secundarios por ejemplo, se ha identificado un inductor especfico para la
produccin de estreptomicina, compuesto que se llama factor-A.
La mayor parte de los metabolitos secundarios son molculas orgnicas
complejas que requieren una gran cantidad de reacciones enzimticas
especficas para su sntesis, (72 etapas para tetraciclina; 25 etapas para
eritromicina).

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Caractersticas de la fermentacin en gran escala

En microbiologa industrial, el trmino fermentacin se refiere a cualquier
proceso microbiano a gran escala, tanto si se realiza aerbica como
anaerbicamente, es decir tanto si es o no bioqumicamente una fermentacin.
De hecho la mayor parte de las fermentaciones industriales son
aerbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentacin industrial se
llama fermentador y el microorganismo que se utiliza se llama fermento.
El fermentador puede variar de tamao de la escala pequea de laboratorio (5
-10 litros) a la enorme escala industrial (400.000 litros). Las dimensiones
dependen del tipo de proceso y de cmo opera. Los procesos manejados en
lote o batch requieren fermentadores ms grandes que los que operan en
forma contnua o semicontnua.
Los fermentadores industriales se pueden dividir en dos clase
principales, para procesos anaerbicos y para procesos aerbicos. Los
fermentadores anaerbicos requieren poco equipo especial, excepto para la
remocin del calor generado durante la fermentacin, en tanto que los
fermentadores aerbicos requieren equipo mucho ms elaborado para
asegurar la correcta mezcla y aireacin.

17

18

Construccin de un fermentador aerbico

Los fermentadores a gran escala son casi siempre de acero inoxidable. Es
prcticamente un cilindro grande cerrado por arriba y por abajo, dentro
del cual se han ajustado varios tubos y vlvulas. Tiene una cubierta
externa de enfriamiento, a travs de la cual se hace pasar vapor o agua
de enfriamiento. En el caso de fermentadores muy grandes el intercambio
de calor a travs de la cubierta es insuficiente de modo que hay que
adaptar serpentines internos a travs de los cuales se pasa vapor o agua
de enfriamiento.
En equipos a gran escala se necesita optimizar el sistema de aireacin ya
que la transferencia de oxgeno del gas al lquido es un proceso muy difcil
porque el oxgeno es poco soluble en agua y un fermentador con una gran
poblacin microbiana tiene una tremenda demanda de oxgeno para el
cultivo. Se necesitan dos dispositivos diferentes para asegurar la
adecuada aireacin: un dispositivo de aireacin llamado difusor, y un
dispositivo de agitacin llamado impulsor. Para lograr una mezcla ms
eficiente se utilizan deflectores.
El microbilogo industrial debe conocer muy bien la extremadamente
compleja dinmica de los fluidos en los fermentadores para disear y
operar de un modo eficiente los mismos

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Fermentadores: a) de laboratorio; b) esquema de fermentador

industrial; c) interior de un fermentador industrial.

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a) Conjunto de fermentadores pequeos para investigacin usado en el

desarrollo del proceso. b) Gran batera de fermentadores al aire libre (240
m3) que se utiliza para la fabricacin de alcohol en Japn. Dada la gran
diferencia de sus tamaos, la misma fermentacin microbiana tendra que
dirigirse en forma muy distinta en los dos tipos de fermentadores.

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Control y monitoreo del proceso

Debido a los altos costos de produccin, los fermentadores industriales
estn cuidadosamente controlados. No solo se controla el crecimiento y la
produccin del producto , sino que se deben controlar otros factores
ambientales a medida que el proceso se efecta.
Los factores ambientales controlados ms frecuentes son: la
concentracin de oxgeno, pH, masa celular, temperatura y
concentracin del producto. Tambin hay que controlar la formacin de
espuma. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar los
procesos de fermentacin ya sea en la obtencin de datos o en el
control de varios factores ambientales.
La obtencin de datos a medida que el proceso de fermentacin tiene lugar
se llama adquisicin inmediata. Las computadoras tambin pueden
graficar los datos obtenidos permitiendo al operador tener una
representacin visual del progreso de la fermentacin. Las computadoras
permiten tambin almacenar los datos para poder analizarlos. Las
computadoras permiten un control inmediato del proceso a travs de la
modificacin de los parmetros ambientales a medida que la fermentacin
progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del
crecimiento evitando que el mismo sea metabolizado a productos
indeseables.

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Los procesos microbianos deben ser

controlados en forma continua,
usualmente esto se hace por medio de
computadoras, a fin de asegurar
rendimientos satisfactorios de los
productos que se desean.
a) Una gran planta de fermentacin.
Slo se ve la parte superior de los
fermentadores, que pueden tener
una altura de varios pisos.
b) Habitacin de control por ordenador
para una gran planta de
fermentacin

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Escalado de la fermentacin
Escalado o cambio de escala es la adaptacin de un proceso
industrial desde las condiciones de un pequeo laboratorio a las de una
fermentacin comercial a gran escala.
La mezcla y la aireacin son mucho mas eficientes en el matraz de
laboratorio pequeo que en el fermentador industrial grande. A medida
que
cambia
el
tamao
del
equipo,
cambia
la
relacin
superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor
para un rea superficial determinada.
El escalado de la fermentacin en el fermentador industrial es la tarea
del ingeniero bioqumico, quien esta familiarizado con la transferencia
de gases, la dinmica de fluidos y la termodinmica. El papel del
microbilogo industrial en el proceso de escalado es trabajar
estrechamente con el ingeniero bioqumico para asegurar que se han
abarcado los parmetros necesarios para una fermentacin exitosa y
que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una
fermentacin en gran escala.

24

Las distintas etapas de escalado que deben realizarse para llegar

de un proceso de laboratorio a un proceso industrial son las
siguientes:
1- Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la
primera indicacin que es posible un proceso de inters industrial.
2- El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequea,
generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el
fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio
de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos
tanto en el equipo como en los medios de cultivo.
3- La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de
300 a 3000 litros. Aqu las condiciones se acercan mas a la escala
industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el
fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa
instrumentacin y un control con computadora, de modo que las
condiciones que se obtengan sean lo ms similares a las del
fermentador industrial.
4- El fermentador industrial mismo, generalmente de 10.000 a 400.000
litros

25

En los estudios de escalado para los procesos aerbicos, el

parmetro de mayor importancia que se debe controlar durante el
aumento de escala es la velocidad de transferencia de oxigeno; se
debe mantener la tasa de oxigeno constante al incrementar las
dimensiones del fermentador.
La tasa de oxigeno expresa el consumo de oxigeno en
mMoles de O2/l/hora que se requiere para obtener el
optimo rendimiento.

26

Esquema general de un proceso de

fermentacin a gran escala.
El
producto
comercial
esta
usualmente en las clulas o en la
fraccin libre de clulas, pero no en
ambas fracciones. De acuerdo a esto
una de ambas fracciones debe ser
posteriormente procesada (sealada
con el smbolo +) o descartada
(sealada con el smbolo -).

27

Antibiticos: aislamiento y caracterizacin

Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por los MOs que
matan o inhiben el crecimiento de otros MOs.
Los antibiticos son metabolitos secundarios tpicos.
Los que se usan comercialmente son producidos por hongos filamentosos
y por bacterias del grupo de los actinomicetos.
La mayora se usa para el tratamiento de enfermedades bacteriana y
algunos pocos son contra enfermedades fngicas.
Los gneros mas comunes son Streptomyces, Penicillum y Bacillus.
Fabricar o producir comercialmente un antibitico requiere adems de un
alto rendimiento, desarrollar un mtodo eficiente de purificacin. Por
ejemplo si el antibitico es soluble en un compuesto orgnico inmiscible
en agua esto implica una purificacin sencilla y de bajo costo por la
facilidad de poder concentrarlo. Si el antibitico no es soluble en algn
disolvente, hay que separarlo por: a) adsorcin; b) intercambio inico; c)
precipitacin qumica. La meta es obtener un producto cristalino de
elevada pureza.
Para obtener cepas con altos rendimientos el qumico debe obtener cepas
que no produzcan impurezas indeseables o desarrollar mtodos para
eliminarlas.

28

Aislamiento de antibiticos y mtodo para probar el

espectro de actividad antibitico de un microorganismo
La forma tradicional por la que se descubren nuevos antibiticos
consiste en el rastreo (screening). Con este tipo de aproximaciones se
asla de la naturaleza, un gran nmero de posibles MOs productores
de antibiticos (a). En estos aislamientos se ensaya la produccin de
antibiticos viendo si producen cualquier sustancia difusible que inhiba
el crecimiento de ciertas bacterias representativas de patgenos
bacterianos usadas como control en el test (b). Aquellos aislamientos
que sean candidatos de la produccin de antibiticos se estudian
posteriormente, a fin de saber si los antibiticos que produce son
nuevos o no. Cuando se descubre un MO que produce un nuevo
antibitico, ste se produce en cantidades suficientes para poder
analizar su estructura y determinar luego su toxicidad y actividad
teraputica en animales infectados. La mayora de los antibiticos
nuevos fallan en el test en animales de experimentacin. No obstante
la bsqueda contina ya que se estima que las especies del gnero
Streptomyces producen unos 100.000 antibiticos diferente.

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Aislamiento de antibioticos
Placa de agar
Cultivo bacteriano

Hongo

Halo de inhibicin

30

31

Produccin mundial anual y consumo de antibiticos.

- Cada ao se manufacturan ms de 500 toneladas de agentes
quimioteraputicos.
- Agente quimioteraputico es todo compuesto qumico que puede usarse
por va interna para controlar las enfermedades infecciosas. Son de gran
utilidad en medicina clnica y veterinaria, as como en agricultura.
- El elemento clave de todo agente quimioteraputico es la toxicidad
selectiva, es decir , la capacidad de inhibir a las bacterias u otros agentes
patgenos sin afectar al hospedador. Se los puede agrupar en dos
categoras generales, los agentes sintticos y los antibiticos.
Cefalosporinas inhiben la sntesis de la
pared celular.
Macrlidos ej. Eritromicina inhibe
subunidad 50S (sntesis de protenas).
Quinolonas ej. cido nalidxico
interaccionan la DNA girasa.
Penicilinas. Inhiben sntesis de pared
Aminoglicsidos ej Estreptomicina
inhibe subunidad 30S (sntesis de
protenas).

32

Modo de accin de los principales

quimioteraputicos antimicrobianos

33

Espectro de accin antimicrobiana de algunos

agentes quimioteraputicos seleccionados

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Produccin industrial de la penicilina

El anillo -lactmico caracterstico de las penicilinas se muestra en color
marrn oscuro. Son producidas por varios hongos de los gneros
Penicillum y Aspergillis y por algunos procariotas. La fermentacin normal
conduce a la produccin de penicilinas naturales. Si durante la
fermentacin de aaden precursores especficos, se forman algunas
penicilinas biosintticas. Las penicilinas semisintticas se producen
aadiendo por mtodos qumicos una cadena lateral especfica al ncleo
del cido 6-aminopenicilnico en la posicin R. Las penicilinas
semisintticas son las que tienen la mayor utilidad clnica, puesto que por
lo general son activas frente a bacterias Gram negativas y pueden
administrarse por va oral.

35

Estructuras de algunas penicilinas importantes

36

Cintica de fermentacin de la penicilina con Penicillum chrysogenum.

La produccin de penicilina es un proceso
aerbico, se requiere una aireacin muy eficiente.
La penicilina es un metabolito secundario. Durante
la fase de crecimiento se produce muy poca
penicilina, pero una vez que se ha consumido la
fuente de carbono casi completamente, empieza la
fase de produccin de la penicilina. Alimentando el
fermentador con diversos componentes del medio
de cultivo, se puede alargar por varios das la fase
de produccin. El licor de maz es uno de los
principales ingredientes de la mayora de los
medios de produccin de penicilina. Esta sustancia
contiene la fuente de nitrgeno y otros factores de
crecimiento.
La
fuente
de
carbono
es
generalmente la lactosa. La penicilina se secreta al
medio y una vez que las clulas se separan por
filtracin, se baja el pH del medio y se extrae el
antibitico con un disolvente orgnico. Despus de
concentrarse en el solvente, el antibitico se
vuelve a extraer en medio acuoso a pH alcalino,
posteriormente se concentra y cristaliza. Por este
mtodo se puede obtener rpidamente penicilina
con un alto nivel de pureza.

37

Purificacin de antibiticos

38

Purificacin de un antibitico.
Instalacin para extraer un antibitico del caldo de fermentacin

39

Esquema de la produccin de clorotetraciclina con Streptomyces

aureofaciens.
En su biosntesis estn implicados ms

de 72
productos
intermediarios
y
los
estudios
genticos han mostrado ms de 300 genes
involucrados en su sntesis. Si bien la regulacin
de este antibitico es muy compleja, se sabe
que la glucosa y el fosfato reprimen su sntesis.
Se utiliza como materia prima el licor de maz,
como en el caso de la penicilina, pero la fuente
de carbono es la sacarosa en lugar de la
lactosa. Se evita el uso de glucosa porque causa
una represin por catabolito en la produccin
del antibitico.

40

Vitaminas producidas por microorganismos a escala industrial

a) Vitamina B12. Es una
cobalamina.
b) Vitamina B2 (Riboflavina)
La mayora de las vitaminas se sintetizan por mtodos
qumicos, sin embargo algunas tienen una estructura
muy complicada y se obtienen por procesos biocatalticos
como son la vitamina B12 y la Riboflavina.
En el hombre, una deficiencia importante en la vitamina
B12 produce la llamada anemia perniciosa, que se
caracteriza por la baja produccin de eritrocitos y
alteraciones en el sistema nervioso. Los requerimientos
de esta vitamina por los animales se realizan a travs de
la dieta o por la adsorcin de la vitamina producida por
los microorganismos que colonizan el intestino de los
animales. Las plantas no producen ni utilizan vitamina
B12. El rendimiento de esta vitamina se incrementa
mucho utilizando cepas sobreproductoras del gnero
Propionibacterium o Pseudomonas y aadiendo cobalto
al medio de cultivo.
La vitamina B2
importante y es
Ashbya gossypii
enormes de esta

o riboflavina es una coenzima muy

sintetizada por muchos MOs. El hongo
produce en forma natural cantidades
vitamina (hasta 7g/l).

41

Aminocidos utilizados en la industria alimentaria

Los aminocidos tienen muchos usos en la industria alimentaria, en medicina y como

precursores de la industria qumica. El ms importante comercialmente es el cido
glutmico, que se utiliza para aumentar el sabor. Otros aminocidos importantes son
el cido asprtico y la fenilalanina, que son los ingredientes del edulcorante artificial
aspartame, un ingrediente en las bebidas bajas en caloras y en otros productos sin
azcar.

42

Si bien la mayor parte de los aminocidos se puede producir por sntesis

qumica, esta ltima da como resultado las formas L y D. Si se necesita la
forma L, bioqumicamente importante, entonces es necesario aplicar un
mtodo de fabricacin enzimtico o microbiolgico. La produccin
microbiolgica de los aminocidos puede hacerse por fermentacin directa,
en la cual un microorganismo produce el aminocido en un proceso estndar
de fermentacin, o mediante sntesis enzimtica, donde el microorganismo
es la fuente de una enzima y entonces se utiliza sta en el proceso de
produccin.
Regulacin de la biosntesis de aminocidos
La sntesis de los aminocidos se lleva a cabo a travs de una serie de etapas
en las que intervienen distintas enzimas a partir de precursores de la va
glucoltica o del ciclo del cido tricarboxlico y su regulacin se efecta por
retroalimentacin, es decir que la primera etapa enzimtica, nica para una
va biosinttica de un determinado aminocido suele estar sometida a
inhibicin por retroalimentacin por el producto final de esa va. As al
aumentar la concentracin de un determinado aminocido, se inhibe la
actividad de la enzima que conduce a la biosntesis de ese aminocido, dando
como resultado una reduccin en la sntesis. Una forma de lograr la
sobreproduccin de un determinado aminocido es obtener una mutante en la
primera y nica enzima de esa va de sntesis del aminocido, de forma tal
que ya no est sometida a la inhibicin por retroalimentacin.

43

Inhibicin de la actividad enzimtica por retroalimentacin

La inhibicin por retroalimentacin se observa principalmente en la
regulacin de las rutas biosintticas complejas, tales como las rutas
implicadas en la sntesis de un aminocido o de una purina. Tales rutas
requieren muchas etapas enzimticas y el producto final, aminocido o
nucletido, est separado del sustrato inicial por muchas etapas. An as el
producto final es capaz de retroalimentar la primera etapa de la ruta y
regular su propia biosntesis. En la inhibicin por retroalimentacin, el
aminocido u otro producto final de la ruta biosinttica inhibe la actividad
de la primera enzima de esta ruta. Esto se debe a una propiedad de la
enzima inhibida conocida como alosterismo. Una enzima alostrica
tiene dos sitios de unin importantes, el sitio activo, donde se une el
sustrato , y el sitio alostrico, donde se une reversiblemente el inhibidor,
llamado a veces efector. Cuando un inhibidor se une, por lo general no
covalentemente, al sitio alostrico, la conformacin de la molcula de
enzima cambia, de manera que el sustrato deja de unirse eficientemente al
sitio activo.

44

45

Mecanismo de inhibicin
enzimtica por un efector alostrico

46

Produccin de la lisina utilizando Brevibacterium flavum.

La lisina es un aminocido esencial para el hombre y
es utilizada como aditivo alimentario. Se produce
comercialmente utilizando la bacteria Brevibacterium
flavum. La sntesis de lisina, como la de otros
aminocidos se encuentra estrictamente regulada.
Para poder obtener los aminocidos en forma
econmica
es
necesario
obtener
cepas
sobreproductoras, es decir que no sufran el fenmeno
general de inhibicin por retroalimentacin. En la va
bioqumica que conduce desde el aspartato a la lisina,
esta ltima puede inhibir por retroalimentacin la
actividad de la enzima aspartatoquinasa. La
sobreproduccin de lisina puede obtenerse aislando
mutantes en las cuales la aspartatoquinasa no est
sujeta a retroinhibicin. Esto se logra aislando
mutantes resistentes a un anlogo de la lisina, la Saminoetilcistena (AEC), que se une al sitio alostrico
de la enzima e inhibe su actividad. Las mutantes
resistentes a la AEC que se obtienen fcilmente por
seleccin positiva, producen una modificacin de la
aspartatoquinasa con un sitio alostrico alterado que
ya no reconoce la AEC o a la lisina, por lo que la
retroinhibicin por lisina est muy reducida. Dichas
mutantes pueden producir hasta 60 g de lisina por
litro en fermentadores industriales.

47

Produccin de cido glutmico

Un factor muy importante para lograr un proceso de produccin comercial
de un aminocido es conseguir la excrecin del mismo al medio de
cultivo. En general, los organismos no excretan los metabolitos
indispensables como los aminocidos. Aumentando la excrecin se
evitaran concentraciones relativamente altas dentro de la clula, que
podran ocasionar inhibicin por retroalimentacin, an en mutantes
resistentes. Una forma de obtener un nivel elevado de excrecin de un
aminocido es el que se utiliza en la obtencin del cido glutmico. La
produccin y excrecin del cido glutmico depende de la permeabilidad
celular. El organismo productor del cido glutmico, Corynebacterium
glutamicum, requiere la vitamina biotina, factor indispensable en la
biosntesis de los cidos grasos. La deficiencia en biotina daa la
membrana celular como resultado de una produccin deficiente de
fosfolpidos y bajo estas condiciones se excreta el cido glutmico
intracelular. El medio empleado para la produccin del cido glutmico
contiene en una primera etapa suficiente biotina para obtener un buen
desarrollo del microoganismo y en una segunda etapa la deficiencia de
biotina asegura la excrecin de cido glutmico al medio. El
descubrimiento del papel de la deficiencia en biotina en la produccin del
cido glutmico ha permitido el desarrollo de mtodos racionales para la
formulacin de un medio para producir este aminocido.

48

Bioconversin microbiana
Los microorganismos pueden usarse para biocatalizar reacciones
qumicas especficas. Este proceso se denomina bioconversin o
biotransformacin, e implica el cultivo del MO en fermentadores
grandes, seguido de la adicin del compuesto qumico que ha de ser
convertido, en el momento adecuado. Despus de un perodo de
incubacin, durante el cual el MO acta sobre el compuesto qumico, se
extrae el caldo de fermentacin y se purifica el producto que se desee.
Si bien la bioconversin puede usarse para varios procesos, su principal
utilizacin industrial ha sido la produccin de algunas hormonas
esteroideas.
Produccin de cortisona utilizando Rhizopus nigricans

Solo la primera reaccin es una bioconversin microbiana tpica. Esta oxidacin

altamente especfica es realizada por el hongo Rhizopus nigricans y omite una
difcil reaccin qumica. Todos los otros pasos se realizan qumicamente.

49

Enzimas
Las enzimas extracelulares (exoenzimas) se secretan al medio
de cultivo y son capaces de digerir polmeros insolubles como la
celulosa, las protenas y el almidn; posteriormente, los
productos de digestin son transportados al interior de las
clulas donde se utilizan como nutrientes para el crecimiento.
Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industrias
alimentaria, lctica, farmacutica y textil, y se producen en
grandes cantidades por sntesis microbiana. Las enzimas son
biocatalizadores especialmente tiles porque a menudo actan
en grupos funcionales qumicos que son nicos, distinguen
fcilmente entre grupos funcionales similares de una misma
molcula y, en muchos casos, catalizan reacciones de una forma
estereoespecfica, produciendo slo uno de los dos posibles
enantimeros (por ejemplo, el enantimero-D de un azcar , o
un L-aminocido.

50

Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa

Las enzimas que ms se producen comercialmente son las

proteasas, que se usan como aditivos en los detergentes para lavar
la ropa. La mayora de los detergentes que se utilizan actualmente
contienen proteasas, amilasas, lipasas, reductasas y otras enzimas.
Muchas de estas enzimas se aslan de bacterias alcalfilas del
gnero Bacillus. Otras enzimas importantes fabricadas
comercialmente son las amilasas y glucoamilasas, que se emplean
en la produccin de glucosa a partir de almidn. La glucosa se
convierte luego en fructosa (que es ms dulce que la glucosa y la
sacarosa) por accin de la enzima glucosa isomerasa. Este proceso
lleva a la obtencin de un edulcorante rico en fructosa a partir de
almidn de maz, trigo o papa.

51

En la conversin del almidn de maz en el producto llamado jarabe

de maz rico en fructosa funcionan tres reacciones en secuencia,
cada una de ellas catalizada por una enzima microbiana diferente.
1- La enzima alfa-amilasa lleva a cabo el ataque inicial sobre el
polisacrido almidn, acortando la cadena y reduciendo la
viscosidad del polmero. Esta se llama reaccin de adelgazamiento.
2-La enzima glucoamilasa produce monmeros de glucosa a partir de
los polisacridos acortados, proceso llamado sacarificacin.
3- La enzima glucosa isomerasa lleva a cabo la conversin final de la
glucosa en fructosa, proceso que recibe el nombre de isomerizacin.
Las tres enzimas se producen por fermentacin microbiana. El producto
final de esta serie de reacciones es un jarabe que contiene
cantidades aproximadamente iguales de glucosa y fructosa, el cual
se puede adicionar directamente a bebidas refrescantes y a otros
productos alimenticios. Esto permiti a Estados Unidos usar el
almidn de maz en lugar de importar la sacarosa y ahorrar millones
de dlares por aos.

52

Enzimas microbianas y sus aplicaciones

53

Extremoenzimas: enzimas de procariotas que viven en

ambientes extremos.
Algunos procariotas llamados hipertermfilos, tienen un crecimiento
ptimo a temperaturas muy altas y producen protenas termoestables
que funcionan a altas temperaturas. El trmino extremoenzimas se
refiere a enzimas que funcionan en condiciones muy altas o muy bajas
de temperatura, pH, salinidad, etc. Los organismos que las producen se
denominan extremfilos.

54

Enzimas inmovilizadas
En algunos procesos biocatalticos se desea convertir enzimas solubles en
enzimas inmovilizadas. La inmovilizacin no solo facilita la reaccin
enzimtica en condiciones de produccin continua a gran escala, sino
que tambin contribuye a la estabilizacin de las enzimas evitando su
desnaturalizacin. Existen tres aproximaciones bsicas para la
inmovilizacin de enzimas.
1- Polimerizacin (entrecruzamiento, cross-linkage) de las
molculas de enzima. El enlace de unas molculas de enzima con otras
se hace a travs de una reaccin qumica con un agente bifuncional de
entrecruzamiento como el glutaraldehido.
2- Unin de la enzima a un soporte. La unin puede hacerse por
adsorcin, enlace inico, o enlace covalente. Los soportes usados son
celulosas modificadas, carbn activado, arcillas minerales, xido de
aluminio y bolitas de vidrio.
3- Inclusin enzimtica, que comprende la inclusin de la enzima en
una membrana semipermeable. Las enzimas pueden encerrarse en
microcpsulas, geles, membranas semipermeables de polmeros, o
polmeros fibrosos como el acetato de celulosa.
Cada uno de estos mtodos tiene ventajas y desventajas y el
procedimiento utilizado depende de la enzima y de la aplicacin
industrial particular.

55

56

Clulas inmovilizadas

En algunos casos no es necesario utilizar la enzima purificada.

Se pueden utilizar clulas inmovilizadas para utilizarlas en procesos
industriales.
En general se utilizan para procesos de flujo continuo.
Se utilizan instalaciones mucho mas econmicas.
Un ejemplo es la utilizacin de clulas de Bacillus cuagulans
inmovilizadas para la conversin continua de jarabe de glucosa en
jarabe de fructosa. Este microorganismo es productor de glucosa
isomerasa, la enzima que convierte la glucosa en fructosa.

57

58

Produccin de productos de mamferos por microorganismos

modificados por ingeniera gentica.

El mayor inters esta en la produccin de protenas y de pptidos de

mamferos por medios microbianos, ya que muchos de estos compuestos
tienen un alto valor farmacutico, son costosos y difciles de obtener por
otros mtodos. A pesar de la excitante promesa de la ingeniera gentica
en la biotecnologa, lograr la comercializacin de un producto es una
empresa gigantesca. Adems de la correcta clonacin y expresin del gen
de inters en una bacteria o levadura, y de la purificacin del producto
deseado, se deben tomar en consideracin otros aspectos como las pruebas
clnicas y permisos gubernamentales. Cualquier producto sintetizado
microbiolgicamente, que se intente utilizar en el hombre, debe pasar
pruebas
clnicas
exhaustivas.
Por
ej.,
la
insulina
producida
microbiolgicamente mediante la tecnologa del DNA recombinante ha
tenido que pasar pruebas clnicas estrictas con voluntarios humanos, a
pesar de que se ha demostrado que la insulina producida
microbiolgicamente es idntica a la protena fabricada por humanos.
Si todo va bien en las pruebas clnicas, se puede pedir el permiso oficial,
pero esto puede ser un proceso que consume mucho tiempo.

59

Ejemplos de productos biotecnolgicos importantes,

fabricados por medio de DNA recombinante.

60

Produccin de insulina
La insulina es un hormona. Es una protena pancretica que regula el
metabolismo de los carbohidratos en mamferos. La diabetes es una
enfermedad caracterizada por una insuficiencia de insulina y afecta a
millones de personas. El tratamiento estndar consiste en la
administracin de sta hormona peridicamente en forma oral o
inyectable. La hormona proveniente de pncreas de terneros o de
cerdos no resulta tan eficaz como la insulina humana y , adems, el
proceso de aislamiento es caro y complejo. Por esta razn se ha
llevado a cabo la clonacin del gen de la insulina humana en
bacterias.
La insulina humana consta de dos polipptidos (A y B) conectados por
puentes disulfuro. Estos dos pptidos estn codificados por partes
separadas del mismo gen de la insulina. El gen de la insulina codifica
la preproinsulina, un pptido ms largo que contiene una secuencia
seal (implicada en la secrecin de la protena), los polipptidos A y B
de la molcula de insulina activa, y un polipptido de unin que est
ausente en la insulina madura. La proinsulina se forma a partir de la
preproinsulina, y la conversin de proinsulina en insulina implica la
ruptura enzimtica del polipptido de unin entre las cadenas A y B.

61

Procesamiento de la preproinsulina

La metionina inicial es eliminada de la cadena antes de que se

sintetice la molcula completa de preproinsulina. Tras la
eliminacin del pptido lder, la molcula de insulina se pliega y
el pptido C se elimina originando las cadenas A y B de la
insulina. Estas cadenas quedan unidas por puentes disulfuro.

62

Hasta el momento se han utilizado dos mtodos para la produccin de

insulina humana en bacterias: (1) produccin de proinsulina y
conversin en insulina mediante mtodos qumicos, y (2) produccin de
las cadenas A y B en dos cultivos bacterianos separados, as como unin
de las dos cadenas mediante procedimientos qumicos para producir la
insulina. Para sintetizar insulina, la secuencia de DNA adecuada se
realiz en forma qumica. La cadena A consta de 63 bases y la cadena B
de 90 bases. En la proinsulina existen otras 105 bases adicionales que
codifican el pptido C que conecta las cadenas A y B. Se aadieron bases
en los extremos para el corte con enzimas de restriccin adecuadas que
permitieran clonar los fragmentos dentro de un plsmido vector. Para
obtener una expresin eficaz, los genes se insertaron debajo de un
promotor adecuado de Escherichia coli, pero de manera que el
fragmento de insulina se sintetizara como parte de una protena de
fusin para que fuera ms estable. Se coloc tambin un triplete que
codifica para metionina en el punto que una el gen de la insulina con la
parte superior del gen de fusin para poder cortar luego el producto
formado con bromuro de ciangeno aprovechando la propiedad de que
la insulina no tiene residuos metionina en su molcula y el bromuro de
ciangeno corta especficamente por los residuos metionina.

63

Cuando se utiliza el mtodo de la proinsulina, la proinsulina aislada de

las bacterias por el tratamiento con bromuro de ciangeno, se
convierte en insulina cuando se forma el enlace disulfuro y se produce
la eliminacin enzimtica del pptido de unin el cual se hace por
tratamiento con las proteasas tripsina y carboxipeptidasa B, que no
tienen efecto sobre la molcula de insulina.
Cuando la insulina se produce mediante los pptidos separados A y B,
cada uno de los pptidos se aslan de un cultivo independiente y las
cadenas se separan mediante el corte con bromuro de ciangeno. Las
cadenas cortas se conectan luego mediante un tratamiento qumico
que permite la formacin de los puentes disulfuro.
En los dos casos el producto final es idntico a la protena purificada
del pncreas humano y los costos son menores que los requeridos
para la purificacin de la insulina de cerdos o de terneros.

64

Ingeniera gentica para la produccin de insulina humana en bacterias

65

Ingeniera gentica aplicada a la produccin de xantano

Xantomonas campestris es una bacteria Gram negativa del suelo aerbica
obligada que produce el biopolmero xantano de importante valor
comercial. Es un exopolisacrido que se produce como un subproducto del
metabolismo secundario. El xantano tiene un alto PM y esta compuesto
por un esqueleto de celulosa (glucosa-1,4-glucosa) que tiene el
trisacrido manosa-cido glucurnico-manosa como rama lateral en forma
alternada sobre dicho esqueleto. Posee adems los sustituyentes acetato
y piruvato sobre la primera y tercera manosa lateral.

66

El xantano tiene una viscosidad alta, es estable en ambientes fsicos y

qumicos extremos y tiene propiedades similares a las de un plstico. En
particular las propiedades fsicas lo hacen til como estabilizante,
emulsionante, adelgazante o agente para suspender otros compuestos.
Para la obtencin exitosa del xantano en forma comercial se deben
bajar los costos para lo cual se debe disponer de una fuente de carbono
de costo bajo o nulo. Xanthomonas campestris puede utilizar en forma
eficiente glucosa, sacarosa y almidn, pero no puede usar lactosa como
fuente de carbono. El suero es un subproducto de la manufactura de los
quesos. Este consta de 94% a 95% de agua, 3,4 a 4% de lactosa,
pequeas cantidades de protenas, minerales y compuestos orgnicos
de pajo PM. Diariamente se producen enormes cantidades de suero por
la industria y son un problema importante. La liberacin de este suero a
ros o lagos puede disminuir la cantidad de O2 disponible y por ende
matar a muchos organismos acuticos. El transporte de estos sueros a
distintos sitios para su degradacin puede ser extremadamente costoso
y puede ser una fuente potencial de contaminacin subterrnea. Por
otra parte los costos para remover los componentes slidos del suero
son prohibitivos. En consecuencia, se han desarrollado muchos
esquemas para deshacerse de los sueros en forma creativa.
Tericamente el suero puede ser usado como fuente de carbono para el
crecimiento industrial de microorganismos importantes.

67

Con esto en mente X. campestris fue modificado genticamente

para crecer sobre suero. Los genes lacZY de Escherichia coli, los
cuales codifican para la -galactosidasa y la lactosa permeasa
fueron clonados en un plsmido de amplio rango de husped bajo
el control transcripcional de un promotor de un bacterifago de X.
campestris. Esta construccin fue introducida en E. coli y luego
transferida de E. coli a X. campestris por conjugacin triparental.
Los transformantes que mantuvieron el plsmido y que expresaron
niveles altos de -galactosidasa y de lactosa permeasa, utilizan la
lactosa como fuente de carbono y produjeron altos niveles de
xantano usando como fuente de carbono glucosa, lactosa o suero.

68

69

Tipos de fermentadores
El objetivo de la biotecnologa es obtener productos metablicos tiles a partir de
materiales biolgicos.
La biotecnologa comprende dos fases distintas: la fermentacin y la recuperacin de
los productos.
Procedimientos de fermentacin consisten en:
1- el desarrollo de cepas mediante manipulacin gentica y/o la regulacin del
metabolismo
2- la optimizacin del medio de cultivo
3- el control adecuado de los factores fsico-qumicos que afectan al rendimiento de las
fermentaciones industriales (02, T, pH, etc.).
Recuperacin del producto o "procesamiento posterior" (del ingls downstream
processing) consiste en:
1- la extraccin de los productos
2- la purificacin de los productos biolgicos

70

Cambio de escala

Las condiciones para obtener los mejores rendimientos a gran

escala no son en general las mismas que las encontradas en
pequea escala.
Ej. Un cultivo de 200 ml en un erlenmeyer requieren un motor de 300
w para agitarlo; entonces un cultivo de
10.000 litros requeriran un agitador con un motor de 15 megawatios.
Esto no es cierto ya que el motor sera tan grande como una casa y
el calor generado hervira a los microorganismos.

71

Proceso tpico de fermentacin

Formulacin y esterilizacin del medio de cultivo.

Esterilizacin del equipamiento.
Crecimiento del cultivo de mantenimiento (5 a 10 ml).
Crecimiento posterior en un matrz de laboratorio ( 200 a 1000 ml)
Prefermentador (10 a 100 litros)
Fermentador de produccin (1.000 a 100.000 litros).
Al terminar la fermentacin las clulas se separan del cultivo lquido.

Si el producto es intracelular, las clulas se rompen, se recupera el

producto del fluido celular libre de restos celulares.
Si el producto es extracelular, se purifica del sobrenadante libre de clulas.

72

Criterios mas importantes para el diseo de un fermentador

1.- El tanque debe disearse para que funcione aspticamente durante numerosos
das, as como para las operaciones de ms larga duracin.
2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireacin y agitacin para cubrir
las necesidades metablicas de los microorganismos.
3.- El consumo de energa debe ser tan bajo como sea posible.
4.- Debe tener un sistema para el control del pH.
5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura.
7.- Las prdidas por evaporacin no deben ser excesivas.
8.- El diseo del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el
funcionamiento, recoleccin, limpieza y mantenimiento sean mnimas.
9.- El tanque debe ser verstil para la aplicacin de diversas modalidades de
procesos.

73

10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea
posible, soldaduras.
11.- La geometra del fermentador debe ser similar a otros tanques ms pequeos o
mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a
diferentes escalas.
12.- deben emplearse los materiales ms baratos que proporcionen resultados
satisfactorios.
13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.

De los 13 puntos mencionados anteriormente, los dos puntos de mayor relevancia

que hay que considerar son probablemente:
1- El mantenimiento de un ambiente asptico.
2- Las condiciones aerbicas adecuadas.
Los fermentadores ms ampliamente utilizados a nivel industrial estn provistos de
mecanismos de agitacin, dispersin y aireacin as como de sistemas para el
control de la temperatura, pH y formacin de espuma.

74

Tipos de fermentaciones
1.- Fermentacin discontinua
2.- Fermentacin alimentada (fed-batch)
3.- Fermentacin continua
4.- Reactores de enzimas o clulas
inmovilizadas

75

1.- Fermentacin discontinua

Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema
cerrado". Al inicio de la operacin se aade la solucin esterilizada de nutrientes y se
inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubacin en
condiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aade
nada, excepto oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante y cidos o
bases para controlar el pH.
La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y la
concentracin de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo
de las clulas observndose las cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia,
fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte.
En los procesos comerciales la fermentacin frecuentemente se interrumpe al final
de la fase logartmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de
muerte (metabolitos secundarios).

76

2.- Fermentacin alimentada (fed-batch)

En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de

describir, todos los sustratos se aaden al principio de la
fermentacin. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la
fermentacin alimentada que se utiliza en la produccin de
sustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, los
sustratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la
fermentacin. La formacin de muchos metabolitos secundarios
est sometida a represin catablica (efecto glucosa). Por esta
razn en el mtodo alimentado los elementos crticos de la solucin
de nutrientes se aaden en pequeas concentraciones al principio
de la fermentacin y continan aadindose a pequeas dosis
durante la fase de produccin.

77

3.- Fermentacin continua

En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La

solucin nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor y
una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con
los microorganismos, se saca simultneamente del sistema.

4.- Reactores de enzimas o clulas inmovilizadas

Consiste en pasar el medio fresco a travs de un biorreactor en el
que por diversas tcnicas hemos inmovilizado clulas (o enzimas).
En el biorreactor se producen las transformaciones bioqumicas que
deseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso por
la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de
desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clsico y adems el
producto resultante est libre de clulas. Presenta el inconveniente
de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse.

78

Reactores de enzimas o clulas inmovilizadas

Existen tres mtodos de inmovilizar las clulas:

a.- Asociacin fsica mediante resinas de intercambio inico. La
unin se puede romper fcilmente.
b.- Unin covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato,
iodo acetil celulosa. Unin fuerte aunque inactivacin.
c.- Atrapamiento mediante colgeno, gelatina, agar, alginatos,
poliacrilamida, poliestireno. Es el mtodo ms utilizado en
inmovilizacin de clulas; para ello se mezclan las clulas con el
polisacrido lquido y posteriormente se deja enfriar para que
solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en
una columna.

79

Objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones:

1- minimizar costos
2- incrementar los rendimientos.
Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de
fermentacin ms adecuado para cada paso en particular.
El coste de produccin de biomasa mediante cultivo continuo es
potencialmente inferior al de cultivo discontinuo, sin embargo, no se
utilizan de forma general en la industria debido fundamentalmente
al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de
clulas en fermentacin discontinua.

80

Limitaciones prcticas de los procesos continuos

para la fabricacin de metabolitos
Aunque muchas fermentaciones para la produccin de metabolitos
funcionan bien como procesos continuos, slo unos pocos procesos
han resultado tiles para la aplicacin prctica por varias razones:
a.- Muchos mtodos de laboratorio operan continuamente durante
solamente 20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial el
sistema debe ser estable durante al menos 500 a 1.000 horas.
b.- Mantener las condiciones estriles a escala industrial a lo largo
de un perodo de tiempo prolongado es difcil.

81

c.- La composicin de los sustratos debe ser constante a fin de

obtener una produccin mxima. La composicin de las soluciones
de nutrientes industriales son variables (lquido de maceracin del
maz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la fisiologa
de la clula y disminuir la productividad.
d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen
mutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo
continuo ms deprisa que las cepas de produccin por lo que el
rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos
clulas las que sintetizan el producto de inters.

82

FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL RENDIMIENTO

DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES

1.- Oxgeno
2.- Temperatura
3.- pH
1. Oxgeno: El suministro de O2 es uno de los factores ms crticos en
la operacin de fermentacin a gran escala.
- El oxgeno es el sustrato gaseoso ms importante para el
metabolismo microbiano y el anhdrido carbnico es el producto
metablico ms importante.
- El oxgeno no es un gas muy soluble ya que, cuando se utiliza aire,
una solucin saturada de oxgeno en agua contiene aproximadamente
9 mg /litro y 43 mg/litro cuando se utiliza oxigeno puro. A medida que
aumenta la temperatura disminuye la solubilidad del O2
-El suministro de O2 se logra pulverizando aire en el fermentador
durante el proceso.

83

2.- Temperatura. Es otro parmetro importante.

Si la temperatura es inferior a la ptima, hay un crecimiento

retardado y menor productividad.
Si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir
una respuesta de estrs al choque trmico con la consiguiente
produccin de proteasas celulares que ocasionan una disminucin
en el rendimiento de los productos proteicos.
A fin de obtener rendimientos ptimos, las fermentaciones deben
ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y en lo
posible constante.
La velocidad de produccin de calor debida a la agitacin y a la
actividad metablica de los microorganismos no se ve compensada
por las prdidas de calor que resultan de la evaporacin, por lo que
se debe recurrir a sistemas de refrigeracin. Los mas usados son
las camisas de agua.

84

 3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecen
ptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el
crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares
son liberados al medio, lo que puede originar un cambio
del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe
controlar el pH del medio de cultivo y aadir un cido o
una base cuando se necesite para mantener constante
el pH. Por supuesto que esta adicin del cido o base
debe ser mezclada rpidamente de tal manera que el pH
del medio de cultivo sea el mismo en todo el
fermentador.

85

AGITACION Y MEZCLADO

La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contacto

entre dos o varias fases. Una fermentacin microbiana puede ser
considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones
lquido-slido, gas-slido y gas-lquido.
1.- La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos.
Puede existir, en algunos casos, una segunda fase lquida si existe
un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.
2.- La fase slida consiste en clulas individuales, bolitas de
micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que
precipitan.
3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de
oxgeno, para la eliminacin del CO2 o para el ajuste del pH con
amonio gaseoso.

86

Una adecuada agitacin de un cultivo microbiano es

esencial para la fermentacin ya que produce los
siguientes efectos en las tres fases:
1.- Dispersin del aire en la solucin de nutrientes.
2.- Homogeneizacin, para igualar la temperatura, pH y
concentracin de nutrientes, en el fermentador.
3.- Suspensin de los microorganismos y de los
nutrientes slidos.
4.- Dispersin de los lquidos inmiscibles.

87

Bajo estas premisas se podra concluir que

cuanto mayor sea la agitacin, mejor ser el
crecimiento. Sin embargo, la agitacin excesiva
puede romper las clulas grandes e incrementar
la temperatura lo que ocasiona un descenso en
la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe
conseguir un balance entre la necesidad del
mezclado y la necesidad de evitar el dao
celular.

88

Los diferentes tipos de agitacin que se utilizan en las fermentaciones se

incluyen dentro de las siguientes clases:
1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecnico de
agitacin.
2.- Columnas de burbujas, la agitacin se realiza mediante la introduccin
de aire a sobrepresin.
3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o
externo. La mezcla y circulacin de los fluidos son el resultado de las
corrientes de aire introducido, las cuales causan diferencias en la densidad
dentro de las diferentes partes del fermentador.
De estos tres tipos el ms utilizado es el primero ya que es ms flexible en
las condiciones de operacin, es ms fcil de conseguir comercialmente,
provee una eficiente transferencia de gases a las clulas y es el tipo con el
que se tiene ms experiencia.

89

Esterilizacin industrial
Es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos libres
de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador
de produccin.
Hay que esterilizar:
1- El fermentador
2- Todo el equipamiento (uniones, vlvulas, electrodos)
3- Medio de cultivo
4- Aditivos (antiespumantes)
- No es necesario esterilizar los cidos y bases concentrados
- No deben existir roturas mecnicas en el fermentador que podran permitir la
entrada de microorganismos.

90

Bioreactor
Se puede esterilizar con:
1- Calor
2- Radiacin
3- Producto qumico
4- Separando los organismos viables mediante un
procedimiento fsico como la filtracin.
Durante la fermentacin se deben observar dos puntos
para asegurar la esterilidad:
- Esterilidad en el medio de cultivo
- Esterilidad del aire que entra y sale

91

ESTERILIZACION DEL MEDIO DE CULTIVO

Por calor.
Por filtracin.
Esterilizacin por calor
El exito de la esterilizacin por calor depende de:
1- el nmero y tipo de microorganismos presentes
2- la composicin del medio de cultivo
3- el valor del pH
4- el tamao de las partculas en suspensin.
Las clulas vegetativas son eliminadas rpidamente a temperaturas relativamente
bajas, pero para la destruccin de las esporas se necesitan temperaturas de 121C.
Esterilizacin por filtracin
Se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la solucin de nutrientes
que son sensibles al calor (vitaminas, antibiticos, componentes de la sangre, etc).

92

A- Esterilizacin discontnua de los medios

- Esterilizacin Indirecta: consiste en inyectar vapor en la camisa del
fermentador o en los serpentines interiores.
- Procedimiento directo: consiste en inyectar vapor en la propia solucin de
nutrientes. Pre-requisito, tener vapor puro (libre de aditivos qumicos).
Inconvenientes del proceso de esterilizacin discontinua
- Se requieren tiempos largos para alcanzar y mantener la temperatura de
121oC.
- Es un procedimiento muy costoso, si el agua caliente que se produce
durante el enfriamiento posterior del reactor no se aplica a algn uso.
- Las fases de calentamiento, esterilizacin y enfriamiento no solamente
matan a los microorganismos, sino que tambin alteran severamente la
solucin de nutrientes (caramelizacin, deterioro de la calidad del medio,
destruccin de vitaminas, cambio de pH).

93

B.- Esterilizacin continua

- La esterilizacin continua es la etapa preliminar lgica en una fermentacin
continua a escala industrial
- Para obtener posibles mayores rendimientos en el tiempo y el espacio
asignados se puede utilizar en la fermentacin discontinua
- Mientras la esterilizacin discontinua se lleva a cabo en 30-60 minutos a
121 C, la esterilizacin continua se lleva a cabo normalmente en 30-120
segundos a 140 C.
- El calentamiento del medio de cultivo para la esterilizacin continua puede
ser llevado a cabo mediante inyeccin de vapor o mediante
intercambiadores de calor.

Inconveniente en el proceso de esterilizacin contnua

- Cuando se usa el mtodo de intercambiadores de calor se pueden formar
sales insolubles (p. ej. fosfato clcico u oxalato clcico) con algunas
soluciones de nutrientes.
- Las soluciones que contienen almidn, que se hacen viscosas cuando se
calientan, son difciles de utilizar en procesos de esterilizacin continua.
- El tiempo de esterilizacin puede ser insuficiente si hay partculas insolubles
en el medio.

94

ESTERILIZACION DEL AIRE DE FERMENTACION

El aire que se suministra al fermentador debe ser esterilizado.

El nmero de partculas y microorganismos en el aire vara en gran medida
dependiendo de la localizacin de la planta, el movimiento del aire y el
tratamiento previo del aire.
Mtodos existentes para la esterilizacin de los gases:
1-filtracin
2- inyeccin de gas (ozono),
3- depuracin de gas
4- radiacin (UV)
5- calor
Solamente el calor y la filtracin fueron utilizados industrialmente.
A partir de la crisis del petrleo de los aos 70, el proceso de esterilizacin por
calentamiento elctrico ha sido reemplazado por la filtracin.

95

Esterilizacin del aire por filtracin

- En los sistemas industriales actuales el aire se esteriliza por
filtracin a travs de filtros de cartuchos que poseen una estructura
membranosa plegada (steres de celulosa, polisulfona o nylon).
- En la actualidad no existen filtros industriales absolutos para
bacterifagos.
- Los bacterifagos pueden ocasionar el fallo total de un sistema como por
ejemplo en la produccin de cido glutmico por Corynebacterium
glutamicum o al trabajar con Escherichia coli.
- El aire que sale del fermentador tambin debe ser esterilizado, sobre todo si
se trabaja con organismos recombinantes. No slo como medida de

seguridad, sino tambin para prevenir que las cepas industriales se

liberen al medio ambiente y por lo tanto estn disponibles de una
forma gratuita para los competidores.

96

I. PREPARACION Y PROPAGACION DE INOCULOS

- El tamao del inculo generalmente es del orden del 1-10% del
volumen total del medio. Si es inferior a esta proporcin puede
existir un perodo de latencia excesivamente prolongado, lo que
prolongar el perodo de fermentacin.
El proceso de fermentacin se lleva a cabo en cuatro etapas:
I. Preservacin del inculo
II. Multiplicacin del inculo
III. Cultivo de prefermentacin
IV. Fermentacin de produccin

97

Etapa I: Preservacin del inculo

Debe preservarse no solo la supervivencia de las cepas sin la capacidad

de formar el producto de inters a lo largo de un perodo de tiempo largo.
Durante el proceso de seleccin de cepas, las cepas superproductoras
estn frecuentemente daadas en su metabolismo primario y
frecuentemente degeneran durante las sucesivas transferencias,
probablemente como resultado de mutaciones espontneas (revertantes).
El objetivo de la preservacin es mantener las cepas durante tanto tiempo
como sea posible sin divisin celular.
Las cepas maestras no deberan ser cultivadas ms que una vez cada dos
aos controlando los niveles de actividad con cada uso
Dependiendo de la cepa, deben ser llevados a cabo peridicamente
programas de seleccin.
Las cepas de trabajo derivan de las cepas maestras.
Las cepas de trabajo deben ser inspeccionadas en relacin a su pureza y
su capacidad de formar producto para posteriormente ser almacenadas
hasta su uso.

98

Etapa II: Crecimiento del inculo

El cultivo preservado se reaviva inicialmente
mediante crecimiento en un cultivo lquido en
agitacin o en medio slido si se requiere la
formacin de esporas.
Las condiciones utilizadas en el cultivo inicial
(composicin del medio, temperatura de
incubacin, etc.) dependern del proceso
especfico.

99

Etapa III: Precultivo en fermentador

A fin de obtener suficiente inculo para el fermentador de produccin,

deben realizarse precultivos en fermentadores ms pequeos. Si un
fermentador de produccin se inicia con demasiado poco inculo, el
crecimiento se retrasa y la velocidad de formacin del producto puede ser
insatisfactoria.
La concentracin ptima del inculo para el fermentador de produccin
determina el nmero de etapas del precultivo de fermentacin que son
necesarias.
En general se requieren las siguientes concentraciones de inculo:
Actinomicetos...........5 - 10 %
Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 %
Hongos..................5 - 10 %
A veces el medio de cultivo de produccin se utiliza en la ltima etapa de
formacin del inculo a fin de inducir la formacin del producto.

Etapa IV: Fermentacin de produccin

Dependiendo de la fermentaci
fermentacin se utilizan biorreactores de
distinto tama
tamao y no puede darse un esquema general para la
inoculaci
inoculacin de un fermentador de producci
produccin.

100

II. RECUPERACION DE PRODUCTOS

En una etapa de recuperacin se optimiza la pureza y/o la concentracin

de un metabolito.
En un proceso ideal de recuperacin se optimizan ambos parmetros.
Las tcnicas utilizadas en la recuperacin de productos qumicos
industriales (extraccin, destilacin, dilisis, cristalizacin, precipitacin,
desecacin) fueron perfeccionadas para adaptarlas a materiales biolgicos.
No existe una operacin nica, ideal o universal, ni siquiera una secuencia
de operaciones que puedan ser recomendadas.
las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la forma
ms adecuada para cada problema particular.
En muchos casos la primera etapa de recuperacin, al final de una
fermentacin, es la separacin de los slidos del lquido que casi siempre
es acuoso.

101

El producto final deseado puede ser el propio microorganismo o un

metabolito que est presente intra o extracelularmente.
Los metabolitos intracelulares se liberan de las clulas
Las ltimas etapas en la recuperacin implican precipitacin, cristalizacin
y/o desecacin

Ejemplos de metabolitos intracelulares:

1- los cidos nucleicos
2- las vitaminas
3- las enzimas
4- ciertos antibiticos como la griseofulvina.
Ejemplos de metabolitos extracelulares:
1-los aminocidos
2- el cido ctrico
3- el alcohol
4- algunos enzimas (amilasas y proteasas)
5- la mayor parte de los antibiticos (penicilina, estreptomicina).

102

103

Principios del crecimiento bacteriano

Los microorganismos pueden crecer en cultivos en lote (batch),
lote alimentado (fed-batch) o cultivo continuo.
1-En la fermentacin en lote, el medio de crecimiento estril es
inoculado con el microorganismo apropiado y la fermentacin
procede sin la adicin de medio de crecimiento fresco.
2- En la fermentacin en lote alimentado, los nutrientes son
aadidos en forma incremental a varios tiempos durante el proceso
de fermentacin; no se remueve el medio de crecimiento hasta que
termine el proceso.
3- En el proceso de fermentacin continua, el medio fresco es
aadido en forma continua durante la fermentacin, pero al mismo
tiempo un volumen igual de medio utilizado con el microorganismo
suspendido es removido.
Para cada tipo de fermentacin se aade dentro del reactor, cuando
es necesario, el oxigeno (el cual es usualmente provisto en forma de
aire estril), un agente antiespumante, y, si es requerido, cido o
base.

104

Fermentacin en lote

Durante la fermentacin en lote, la composicin del medio de

cultivo, la concentracin de microorganismos (concentracin de la
biomasa), la composicin qumica interna de los microorganismos, y
la cantidad de la protena target o del metabolito, todas cambian
como una consecuencia del estado de crecimiento celular, el
metabolismo celular, y la disponibilidad de nutrientes. Bajo estas
condiciones, se observan usualmente seis fases de crecimiento: fase
lag, fase de aceleracin, fase logartmica o exponencial, fase de
desaceleracin, fase estacionaria y fase de muerte.

105

Durante la fase logartmica de crecimiento, la masa celular

sufre varias duplicaciones y la velocidad de crecimiento
especfica del cultivo () permanece constante.
Cuando hay exceso de sustrato (suplemento de nutrientes) y no hay
inhibicin del crecimiento por un compuesto que est presente en el medio
de crecimiento, la velocidad de crecimiento especfica es independiente de
la concentracin de sustrato. En este caso, la velocidad de incremento de
la biomasa celular con el tiempo, dX/dt, es el producto de la velocidad de
crecimiento especfico, , y de la concentracin de la biomasa, X:

dX/dt = X

La velocidad de crecimiento especfico, , es una funcin de la

concentracin del substrato limitante (por ej., la fuente de carbono o de
nitrgeno) S, de la velocidad de crecimiento especfica mxima, max, y de
una constante especfica de substrato Ks. Ambas S y Ks son expresadas
en trminos de concentracin, por ej. en gramos o moles por litro.
= max S / (Ks + S)
Algunas veces los cientficos se refieren al tiempo de duplicacin o
tiempo de generacin (t) de un cultivo ms bien que a una velocidad de
crecimiento especfica , donde t = ln2/. El tiempo de generacin de un
cultivo, es el tiempo que ste toma, bajo condiciones definidas, para que
el nmero de clulas de la biomasa celular se duplique. Cuando hay un
exceso de substrato (por ej., cuando S>> Ks), luego = max y se obtiene
la velocidad mxima de crecimiento en fase logartmica del cultivo.

106

Fermentacin en lote alimentado (Fed-Batch)

En las fermentaciones en lote alimentado, el substrato es aadido en incrementos a
varios tiempos a travs del curso de la reaccin. Estas adiciones prolongan tanto la
fase log como la fase estacionaria, de esta forma se incrementa la biomasa y la
cantidad de sntesis de metabolitos de fase estacionaria, tales como los
antibiticos. Sin embargo, los microorganismos en fase estacionaria a menudo
producen enzimas proteolticas o proteasas, y estas enzimas pueden atacar algn
producto sintetizado por un microorganismo modificado genticamente. Luego,
para las protenas producidas por microorganismos recombinantes, es importante
prevenir que la reaccin de fermentacin alcance esta parte del ciclo de
crecimiento. Generalmente, las fermentaciones en lote con alimentacin requiere
ms monitoreo y mayor control que las fermentaciones en lote y son luego
utilizadas en menor medida. La adicin peridica de substrato al cultivo microbiano
en crecimiento prolonga la fase log de crecimiento y demora el onset de la fase
estacionaria, la cual inicia las respuestas de stress celular, la produccin de
proteasas y otros cambios metablicos que afectan el rendimiento de la protena
recombinante. Una estrategia de fermentacin en fed-batch puede incrementar el
rendimiento de 25% a mas de 1.000%, comparado con la fermentacin en batch,
dependiendo del microorganismo en particular, su background gentico y la
naturaleza de la protena recombinante.
Los procesos de fed-batch no se limitan solamente a clulas microbianas sino que
pueden ser utilizados con cultivos de clulas de mamferos y de insectos.

107

Fermentacin continua.
En una fermentacin continua, una condicin de estado de equilibrio o
steady-state, donde la variacin de la concentracin de la biomasa en
funcin del tiempo es igual a cero (dX/dt = 0) se alcanza cuando el
nmero total de clulas y el volumen total en el biorector permanecen
constantes. En otras palabras, bajo esas condiciones, la prdida de
clulas debido al outflow o remocin del producto est balanceado
exactamente por la ganancia de nuevas clulas por el crecimiento
(divisin celular). Para obtener un cultivo estable termodinmicamente,
la velocidad de crecimiento especfica, , del cultivo debe ser menor que
la velocidad de crecimiento mxima alcanzable, max. En la prctica, esta
condicin se alcanza ajustando la bomba que controla la velocidad de
flujo volumtrico, mientras se mantiene el volumen del cultivo en el
birreactor constante.
El objetivo fundamental de la fermentacin industrial es minimizar los
costos y maximizar los rendimientos. Este logro se puede lograr a travs
de desarrollos tecnolgicos que permitan una fermentacin ms eficiente
para cada proceso en particular.

108

Si bien los procesos de fermentacin continua no son usados frecuentemente en

procesos industriales, principalmente debido a la mayor experiencia que los
cientficos tienen con clulas creciendo en el modelo de lote o batch, el costo de
produccin de una biomasa celular por cultivo continuo es potencialmente mucho
menor que el de producir la misma biomasa por fermentacin en batch. Los factores
que se indican a continuacin dan cuenta para el ahorro de costos.
1- Fermentaciones continuas utilizan birreactores menores que los fermentadores en
batch para producir la misma cantidad de producto.
2- Luego que una fermentacin en batch en gran escala es completada, se necesita
un equipo en gran escala para cosechar, romper las clulas, y el subsiguiente
proceso de purificacin de la protena o del metabolito. En los procesos continuos a
medida que se va produciendo el producto, ste se va procesando y de esta manera
se requieren equipos ms pequeos.
3- En las fermentaciones continuas se elimina el tiempo muerto entre corrida y
corrida que hay en los cultivos en batch, durante el cual el birreactor es preparado
para ser usado nuevamente (reparacin, lavado, esterilizacin, etc). Fermentaciones
continuas tienen menores tiempos perdidos porque una reaccin simple puede ser
mantenida por tiempos mas prolongados.
4- El estado fisiolgico de las clulas durante la fermentacin continua es ms
uniforme, debido a ello los rendimientos del producto tienden a ser ms
consistentes. En fermentaciones en batch, pequeas diferencias en el tiempo de la
cosecha de clulas (timing), la cual coincide con el crecimiento en fase media o
logartmica de crecimiento, pueden llevar a diferencias fisiolgicas significativas.
Las fermentaciones continuas pueden ser usadas para la produccin comercial de
protena celular simple, antibiticos, y solventes orgnicos.

109

110

FIN

111

a) Batera de pequeos fermentadores de investigacin. b) fermentadores

industriales

112

Produccin de vinagre
El vinagre es el producto resultante de la conversin del alcohol etlico en
cido actico por la accin de las bacterias del cido actico que son
miembros de los gneros Acetobacter y Gluconobacter. El vinagre puede
producirse a partir de cualquier sustancia que contenga etanol. La materia
prima habitual es el vino, la cerveza o el zumo alcohlico de manzana. Las
bacterias del cido actico son aerbicas pero no oxidan completamente sus
dadores de electrones orgnicos hasta CO2 y agua, sino que lo hacen hasta
cido actico, son muy tolerantes a los cidos. El problema principal en la
produccin del vinagre consiste en garantizar una aireacin suficiente del
medio. Existen tres mtodos diferentes para la produccin del vinagre:
mtodo de Orleans o de tinaja abierta, mtodo de goteo (vinagre rpido) y
mtodo del burbujeo. La tinaja se denomina generador de vinagre
Diagrama de un generador de vinagre. El
lquido alcohlico se hace goteas a travs de
virutas de madera y se deja que el aire pase
desde el fondo hacia arriba y a travs de las
virutas. Las bacterias del cido actico se
desarrollan sobre las virutas de madera y
convierten el alcohol en cido actico. La
solucin de cido actico se acumula en una
cmara colectora y se recicla a travs del
generador hasta que se alcanza un contenido
en cido actico de al menos 4%, cantidad
mnima para ser considerado vinagre.

113

Fermentacin del cido ctrico

Se produce microbiolgicamente por fermentacin utilizando el hongo Aspergillus
niger. Este hongo excreta grandes cantidades de cido ctrico cuando el medio en
el fermentador es deficiente en hierro, ya que el hongo superproduce el cido
ctrico como agente quelante para apoderarse del hierro. El medio de partida para
la obtencin del cido ctrico puede ser muy variado (almidn de papa, hidrolizados
de almidn, jarabe de glucosa procedente de almidn sacarizado, sacarosa, jarabe
de caa de azcar, melazas de caa de azcar y melazas de remolacha azucarera).
Si se utiliza almidn, las amilasas formadas por el hongo la hidrolizan a azcares.
Los azcares se catabolizan a travs de la va glicoltica y entran en el ciclo del
cido ctrico, en el que tiene lugar la produccin de citrato.

El proceso es aerbico y se realiza en grandes

fermentadores bien aireados. El cido ctrico se
produce de esta forma como un metabolito tpico
secundario. Durante la fase de crecimiento, la
sacarosa se descompone en glucosa mas fructosa
y, en el momento que se alcanza la fase
estacionaria, quedan grandes cantidades de estas
hexosas, que se convierten en cido ctrico para
contrarrestar la falta del hierro. El desarrollo de
este tipo de fermentacin aerbica industrial tubo
una gran importancia histrica y esta tecnologa se
aplic luego a otras fermentaciones de antibiticos
importantes como la penicilina.

114

Usos industriales de las levaduras

Las levaduras son los microorganismos ms importantes y ms ampliamente utilizados
en la industria. Se cultivan por sus propias clulas, por sus componentes celulares y por
los productos finales que producen durante la fermentacin alcohlica.
La produccin de clulas de levadura y la produccin de alcohol mediante levadura son
dos procesos diferentes desde el punto de vista industrial en el hecho en que el primero
requiere la presencia de oxgeno para la mxima produccin de material celular,
mientras que la fermentacin alcohlica es anaerobia. Sin embargo en casi todos los
procesos industriales se utiliza una misma especie de levadura, o especies similares de la
misma, a saber , Saccharomyces cerevisiae.

115

Produccin industrial de clulas de levadura.

Se utilizan como agente estimulante del leudado de la masa antes de la coccin. La
levadura que se utiliza en panadera o para fines alimentarios se cultiva en grandes
fermentadores aireados, en un medio que contiene melazas como agente principal. La
melazas contienen grandes cantidades de azcar que sirve como fuente de carbono y
de energa y, adems contienen minerales, vitaminas y aminocidos que son utilizados
por la levadura, se aade adems fosfatos y sulfato de amonio como fuentes de
fsforo, azufre y nitrgeno. No es conveniente aadir todas las melazas al mismo
tiempo, ya que se producir un exceso de azcar y la levadura fermentar parte de
ste azcar en alcohol y CO2, en lugar de convertirlo en clulas de levadura. Las
melazas se aaden a medida que el cultivo de levadura crece y consume este azcar.
Finalizado el perodo de crecimiento, las
clulas de levadura se recuperan del
caldo por centrifugacin y se lavan
mediante suspensin en agua y nueva
centrifugacin. La levadura de panadera
se comercializa en forma de pastillas
como levadura prensada (mezclada
con
otros
aditivos
como
agentes
emulsionantes, almidn, etc) o como
polvo seco (levadura seca activa) luego
de mezclarla con aditivos y secarla al
vaco.

116

Alcohol y bebidas alcohlicas

El uso de levadura seca en la produccin de bebidas alcohlicas es un proceso ancestral. La
mayor parte de los zumos de fruta sufren una fermentacin natural ocasionada por las
levaduras silvestres que estn presentes en la fruta. A partir de estas fermentaciones
naturales se han seleccionado algunas levaduras para conseguir una produccin ms
controlada. Las bebidas alcohlicas ms importantes son el vino, producido por la
fermentacin del zumo de fruta, la cerveza, producido por la fermentacin de cereales
malteados, y las bebidas destiladas, producidas por concentracin, mediante destilacin,
del alcohol procedente de una fermentacin.
Vinos: en general proceden de la uva. En los vinos
secos se ha fermentado casi todos los azcares del
zumo o mosto; en los vinos dulces, se deja parte
del azcar, o bien se aade azcar despus de la
fermentacin. En un vino fortificado se le agrega
algn licor despus de la fermentacin. En un vino
espumoso se encuentra presente el CO2 que surge
de una fermentacin final que realiza la levadura
directamente dentro de la botella.
Bebidas alcohlicas destiladas
Whisky, destilado de bebidas
con malta; brandy es el
destilado del vino; ron,
destilado de melazas
fermentadas; vodka destilado
de cereales de papa
fermentados.

117

Fabricacin comercial de vino

a) Equipo para transportar las uvas
hasta la bodega.
b) Tanques grandes donde tiene lugar la
fermentacin principal del vino.
c) Barricas en las que tiene lugar el
proceso de envejecimiento.

118

Fabricacin de cerveza en una planta industrial.

a, b)

Calderas de cobre donde el

mosto se mezcla con el lpulo y
luego se lo lleva a ebullicin.
Desde la caldera, el lquido se
pasa a grandes tanques de
fermentacin, en los que la
levadura fermenta la glucosa y da
lugar a etanol ms CO2.

c) En cervezas tipo lager, la

cerveza
se
almacena
barias
semanas a baja temperatura en
tanques, donde se produce la
sedimentacin
de
partculas,
incluidas las clulas de levadura.
d) La cerveza se filtra y se
deposita
en
tanques
de
almacenamiento a partir de los
que
se
envasa
en
barriles
pequeos, en botellas o en latas.

119

Bibliografa:
Brock Biologa de los Microorganismos (10 Edicin)
Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant
DNA (Second Edition). Bernard R. Glick and Jack J. Pasternak.
http://nostoc.usal.es/sefin/MI/
TEMA 12: TIPOS DE FERMENTADORES Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

120

121

Streptomyces

Streptomyces es el gnero ms extenso de Actinobacteria, un grupo de

bacterias Gram-positivas de contenido GC generalmente alto.
Las especies del gnero Streptomyces se caracterizan por poseer un
metabolismo secundario complejo (rutas metablicas no requeridas para la
supervivencia).
Producen numerosos antibiticos de uso clnico como estreptomicina, cido
clavulnico, neomicina, cloranfenicol, etc
El genoma completo de S. coelicolor A3(2), fue publicado en 2002. La
secuencia genmica de S. avermitilis fue completada en 2003.
Streptomyces spp. es objeto de investigaciones en biotecnologa para la
produccin de protenas recombinantes humanas porque tiene la habilidad
de secretar protenas recombinantes correctamente plegadas en el medio
de produccin, lo que simplifica los pasos subsecuentes de purificacin.
Esta caracterstica, entre otras, hacen Streptomyces spp. una alternativa
atractiva a otras bacterias tales como E. coli y Bacillus subtilis

122

Streptomyces en Medicina
Streptomyces es el gnero que produce el mayor nmero de antibiticos, tanto
bactericidas como fungicidas, y tambin un amplio rango de compuestos bioactivos
tales inmunosupresores.

Antibiticos antifngicos
Nistatina (S. noursei)
Anfotericina B (S. nodosus)
Pimaricina (S. natalensis)
Antibiticos antibacterianos
Eritromicina (S. erythreus)
Neomicina (S. fradiae)
Estreptomicina (S. griseus)
Tetraciclina (S. rimosus)
Vancomicina (S. orientalis)
Rifamicina (S. mediterranei)
Cloranfenicol (S. venezuelae)
Daptomicina (S. roseosporus)
Inmunosupresores
Tacrolimus

123

Desarrollo de agentes quimioteraputicos

1900 Paul Ehrlich (concepto de toxicidad selectiva). Estudi

sustancias qumicas que teian los microorganismos y no los
tejidos. Descubri el Salvarsn (compuesto que contiene arsnico)
que se usaba para el tratamiento de la sfilis.
1930 Gerard Domang estudi en animales de experimentacin
numerosos productos qumicos sintticos, principalmente
colorantes, que fuesen activos frente a enfermedades infecciosas.
Descubri las sulfamidas. El Pronotosil de la Compaa Qumica
Bayer fue el primer compuesto activo con capacidad de curar
infecciones estreptoccicas en ratones. El Pronotosil se degradaba
a sulfanilamida en el cuerpo del animal y ste era el verdadero
compuesto activo.

124

Posteriormente D.D.Woods demostr que el cido p-aminobenzoico contrarrestaba especficamente la accin inhibitoria de la
sulfanilamida y que los estreptococos requeran el cido p- aminobenzoico para su crecimiento. Esto condujo al concepto de anlogo
de factor de crecimiento, que permiti a los qumicos proseguir con
la sntesis de una gran variedad de agentes quimioteraputicos.
1929 Alexander Fleming. Trabajaba con variantes de estafilococos.
Descubri una sustancia producida por un hongo del gnero
Penicillum a la que llam penicilina.
1939 Howard Florey y colaboradores produjeron penicilina a gran
escala y demostraron que la misma era efectiva en el tratamiento de
enfermedades infecciosas.

125

Descubrimiento de la penicilina
La penicilina G o bencilpenicilina fue el primer antibitico empleado
ampliamente en medicina; su descubrimiento ha sido atribuido a Alexander
Fleming en 1928, quien junto con los cientficos Ernst Boris Chain y
Haward Walter Florey - quienes crearon un mtodo para producir en masa
el frmaco y probaron su eficacia para el control de enfermedades
infecciosas- recibieron el Premio Nobel de Medicina o Fisiolofa en 1945
por sus descubrimientos. El premio en partes iguales, lo obtuvieron for the
discovery of penicillum and its effect in various infectious diseases.

126

Descubrimiento de la PENICILINA

Penicilina

Penicillum notatum
Definida inicialmente como antisptico natural de efectos lentos

127

Historia de la penicilina

El descubrimiento de la penicilina segn Alexander Fleming ocurri el 28 de

septiembre de 1928, cuando estaba estudiando cultivos bacterianos de
Staphylococcus aureus en el stano del laboratorio del Hospital St. Mary en
Londres.
La identificacin del espcimen como Penicillium notatum la realiz Charles
Tom.
Desde 1929 y hasta 1940 slo se utiliz el caldo del cultivo del Penicillum
notatum como antisptico local.
La primera demostracin de que la penicilina era til para la medicina la
llev a cabo en 1930 el patlogo ingls Cecil George Paine discpulo de
Fleming.
En 1939 en la Sir Willam Dunn School of Pathology de Oxford los trabajos
sobre la penicilina son retomados por E. B. Chain, H. W. Florey y N. G.
Heatley. Chain se ocup de las propiedades qumicas y bioqumicas,
Heatley de su produccin (como obtener el principio activo y purificarlo de
los caldos de cultivo) y Florey se encarg de los aspectos biolgicos y
farmacolgicos y de la obtencin de fondos.

128

La purificacin de la penicilina se produjo en 1939, a cargo del bioqumico

Norman George Heatley. A Heatley no le alcanz la fama ni la publicidad ni
la fortuna. Los honores llegaron ms tarde cuando se retir, en 1978 recibi
la Orden del Imperio Britnico (OIB) y en 1990, la Universidad de Oxford le
confiri el grado honorario de Doctor en Medicina, el primero conferido en
800 aos de historia de la Universidad.
La interpretacin mas breve y acertada de esta historia es la de Henry
Harris, sucesor de Florey en la Sir William Dunn School of Pathology: To
sum it all up: without Fleming, no Chain or Florey; without Chain, no Florey;
whithout Florey, no Heatley; without Heatley, no penicillin. (Harris H. Howard
Florey and the development of penicillum. Notes Rec R Soc Lond. 1999; 53:243-52)
Sacado del editorial sobre la historia de la penicilina. La segunda lnea de Juan Antonio Barcat.
http://www.medicinabuenosaires.com/revistas/vol66-06/4/EditorialSobre%20la%20historia%20de%20la%20penicilina.pdf

129

EL PREMIO NOBEL

FLEMING

FLOREY

CHAIN

PREMIO NOBEL DE MEDICINA Y FISIOLOGA EN 1945

130

Todos sabemos que la casualidad, la fortuna o el destino, como cada

cual desee llamarlo, ha jugado un papel destacado en muchos de los
grandes descubrimientos cientficos. Esto es especialmente acertado en
el caso de la Biologa, puesto que trata de los mecanismos de la vida,
sobre la que existen multitud de lagunas en nuestro conocimiento.
A. Fleming

131

Evaluacin de antimicrobianos

132

133

Cultivos biotecnolgicos en la Argentina

Reporte Anual 2008
- Argentina es el segundo productor mas grande de cultivos
biotecnolgicos (despus de Estados Unidos), con un rea estimada de
19,8 millones de hectreas para la cosecha 2007/08 (soja, algodn,
maz).
Soja: 100%, variedad obtenida por biotecnologa (17millones de hect.)
Maz: 74%, variedad obtenida por biotecnologa
Algodn: 90%, variedad obtenida por biotecnologa
- Introduccin de la soja biotecnolgica en la Argentina en 1990.
- En Mayo del 2008 la Secretara Argentina de Agricultura , Ganadera,
Pesca y Alimentos (SAGPyA) aprob la utilizacin de una variedad de
maz con la suma de tres desarrollos biotecnolgicos en un mismo
producto, variedad HX+LL+RR (tolerancia a los herbicidas Glyphosate y
Glufosinate y resitencia a Lepidoptera).
HX (Herculex I technology) proteccin contra insectos
LL (Liberty Link technology) resistencia al glufosinato de amonio y RR
(Rounup Ready technology) resistencia al glifosato; ambos herbicidas.

134

En la Argentina hay doce variedades biotecnolgicas aprobadas para

su produccin y comercializacin:
- 1 para soja (empresa Monsanto)
- 2 para algodn (Monsanto)
- 9 para maz ( Ciba-Geigi. AgrEvo, Monsanto, Novartis, Syngenta,
Dow/Pioneer y Pioneer.
Soja
-En 1996 fue liberado el cultivo de soja tolerante a glifosato
(Roundup Ready soybean). Este cultivo fue el primero introducido en
la agricultura Argentina y permiti la incorporacin del cultivo doble
de soja (siguiendo al de trigo) en muchas reas donde solo se
plantaba un cultivar.
- En Argentina la economa de la soja esta orientada casi totalmente
a la exportacin: 2%, uso domestico, 30% exportado como grano y
el 68% es procesado por la industria de los aceites de semilla.
-93% del aceite de semilla y 99% de los productos laterales
(alimentos) son exportados.

135

En 2007 el gobierno simplific el proceso de aprobacin para eventos

apilados, permitiendo aplicaciones para un cultivo transgnico
combinando dos eventos ya aprobados sin un anlisis total del nuevo
cultivo.

Maz
-En Agosto de 2007 se aprob en la Argentina el primer producto en
el cual se haba apilado la suma de dos desarrollos biotecnolgicos
permitiendo a la empresa Monsanto la introduccin de un maz de una
variedad modificada para producir una sustancia txica para los
parsitos taladradores de maz y para la resistencia a glifosato, un
herbicida para el control de malezas (variedad NK603x810).
- En Mayo de 2008 Pioneer recibi aprobacin para una variedad de
maz conteniendo un desarrollo para la proteccin contra insecto y
resistencia a los herbicidas glufosinato y glifosato.
74% del rea plantada representa variedades biotecnolgicas.
63% variedad de maz Bt
9% tolerante a glifosato
2% variedades con eventos apilados (aproximadamente 82.000
hectreas).

136

Algodn
90% del rea plantada corresponde a algodn modificado por
biotecnologa. 44% resistente a glifosato y 57% resistente a lepidptero
(variedad Bt). Debido al menor uso de insecticidas se mostr una
ventaja econmica al usar las variedades modificadas.
Se estn llevan a cabo en el INTA investigaciones para obtener
variedades de algodn coloreadas.
Aceite de semillas de colza
El Instituto Nacional de Semillas (INASE) tiene prohibido la importacin
de semillas de colza biotecnolgica y estableci el requerimiento de un
certificado de ausencia de semillas de colza biotecnolgica en los
embarques de semillas.
Vacas clonadas: tecnologa de vanguardia
Argentina fue el primer pas de Amrica latina en desarrollar dos
generaciones de vacas clonadas capaces de producir la hormona de
crecimiento humana.

137

En Marzo de 2006, CONABIA (Comit Asesor Nacional de Biotecnologa

en Agricultura) y SENASA (Servicio Nacional de Agricultura y Calidad y
Sanidad Animal) aprob el primer paso para autorizar la produccin de
hormona de crecimiento humana en leche. El prximo paso que
necesita para ser completada es la aprobacin por la Secretara de
Salud Pblica.
Los terneros clonados, Pampa Mansa II, Pampa Mansa III y Pampero,
desarrollados por la compaa Biosidus, llevan un gen que produce la
hormona de crecimiento humana en la leche. La leche producida por
una sola vaca puede alcanzar para la demanda entera de nuestro pas.
En el 2007, la compaa Biosidus desarroll otra lnea de vacas
clonadas, esta vez para producir insulina. Despus de 4 aos de
investigacin y mas de 4 millones de dlares invertidos, Patagonia
fue la primera vaca clonada. En este caso, la insulina producida por 25
vacas como Patagonia podran satisfacer la demanda anual de nuestro
pas a un costo bajo (30% menos que el costo actual de la insulina).
La intencin es producir suficiente insulina como para ser capaces de
exportar en un futura cercano.

138

139

Poltica Biotecnolgica
Sistema regulatorio de Bioseguridad
El sistema regulatorio de bioseguridad en la Argentina esta basado
sobre la evaluacin del producto y no del proceso a travs del cual
este es obtenido. La evaluacin tiene lugar sobre la base de caso
por caso, tomando en consideracin el proceso solo en el caso
donde el medio ambiente, la produccin de la agricultura o la salud
de animales o humanos puedan estar en riesgo.
La oficina clave dentro de la SAGPyA que centraliza todas las
actividades biotecnolgicas y la informacin es la Oficina de
Biotecnologa creada en 2004. Esta oficina coordina tres reas
tcnicas:
- Asuntos de bioseguridad (la autoridad es un miembro de la
CONABIA)
- Polica de anlisis y formulacin
- Diseo Regulatorio

140

PROCESO DE BIOSEGURIDAD NACIONAL

Los cultivos mejorados por la biotecnologa moderna son

autorizados en la Argentina por la Secretara de Agricultura,
Ganadera, Pesca y Alimentacin (SAGPyA), a partir de los
informes de sus comisiones asesoras:
La Comisin Nacional Asesora de Biotecnologa Agropecuaria
(CONABIA).
El Comit de Evaluacin de Organismos Genticamente
modificados (OMG) del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria (SENASA).
La Direccin Nacional de Mercados Agroalimentarios (DNMA).

141

PROCESO DE BIOSEGURIDAD NACIONAL

CONABIA
Evala el posible
impacto ambiental y
autoriza la liberacin del
cultivo transgnico al
agroecosistema.
El Comit de evaluacin
de OGM del SENASA
estudia la seguridad
alimentaria del cultivo
transgnico (o de sus
subproductos) y lo
autoriza para el consumo
humano y animal.

DNMA
Estudia el impacto del
cultivo transgnico en
el mercado nacional e
internacional.

Secretario de
Agricultura,
Ganadera,
Pesca y
Alimentacin

APROBACIN
Hoy en la Argentina hay tres cultivos transgnicos: el maz, el algodn y la soja.

142

143

144

Bibliografa: USDA Foreing Agricultural Service

Gain Report
Date: 7/14/2008 Gain Report Number:AR8028
Argentina Biotechnology Annual Report 2008

145

146

Integran en Estados Unidos la producci

produccin de carne y etanol
En USA se puso en marcha la primera planta de etanol a partir de ma
maz que opera en
circuito cerrado
cerrado, con un sistema de engorde de ganado vacuno con una capacidad de
de
28.000 cabezas de ganado. Del ma
maz se obtiene un biocombustible,
biocombustible, el etanol, y con el
residuo se engordan novillos.
La empresa es E3 BioFuels Genesis y producir
producir 100.000 metros c
cbicos de etanol por a
ao,
para lo cual requerir
requerir unas 50.000 toneladas de ma
maz.
La tecnolog
tecnologa implementada ofrece grandes beneficios econ
econmicos y ambientales.
La materia prima que utiliza el sistema integrado es el ma
maz, que ingresa en la planta de
etanol. All
All se muele y se pone a fermentar en agua para obtener el etanol, que luego se
separa por un proceso de destilaci
destilacin.
El residuo de la fermentaci
grains es un excelente alimento para
fermentacin llamado wet distillers grains
el ganado vacuno. Por eso se construy
construy, al lado de la planta, un corral de engorde de
novillos con piso ranurado.
ranurado. Por las ranuras caen los excrementos de la hacienda, que
alcanzan a las 300.000 toneladas anuales.
Un sistema autom
automtico traslada la bosta a un par de tanques anaer
anaerbicos en los que se
convierte en biog

s,
por
medio
de
la
fermentaci

n
bacteriana.
Esto evita el principal
biog
fermentaci
problema de los sistemas de engorde intensivo de ganado, que es la poluci
polucin del medio
ambiente. Se reducen dr
drsticamente los olores y la contaminaci
contaminacin de las aguas. Las heces
del ganado quedan siempre atrapadas en el fermentador. El agua luego
luego es tratada como en
una f
fbrica y los residuos s
slidos vuelven al campo como fertilizantes.
El mayor beneficio es el ahorro de energ
energa ya que el biogas se utiliza en la caldera que
produce el vapor necesario para el proceso de destilaci
destilacin. La planta de etanol, de esta
manera, no requiere aporte externo de energ
energa.

147

UN PROCESO
REVOLUCIONARIO
Biodigestor

(Produce Biogas metano)

El biogas provee el
100 % de la energa
que requiere la planta
de etanol

El ganado produce bosta

que luego se convierte
en metano

Integracin en
circuito cerrado
Ganado en engorde

Maz

Planta de Etanol

Carne

Etanol
De la planta de etanol sale la
comida que necesita el ganado

148

Este tema reviste inters para la Argentina por que:

Consolida la demanda de maz, el segundo rubro exportable del pas atrs de la
soja.
2) Da por tierra con la idea de que destinar granos- como el maz- a la produccin
de energa implica restarlos del circuito alimentario. De esta forma se integra todo
en un alto nivel de eficiencia.
Sacado de artculo del Diario Clarn (1 de Marzo de 2007, seccin Agronegocios,
H. A. Huergo) .

149

FIN

150