Mtodos analticos

Determinacin de sodio, de potasio, de calcio, de magnesio,

de zinc y de hierro en muestras de chocolate emulsionadas
por espectrometra de absorcin atmica de llama
Abstracto
En este estudio, las formulaciones de aceite-en-agua se optimizaron para
determinar de sodio, de potasio, de calcio, de magnesio, de cinc, y hierro en
muestras de chocolate emulsionados por espectrometra de absorcin atmica de
llama (FAAS). Este mtodo es ms sencillo y requiere menos reactivos en
comparacin con otros procedimientos de pre-tratamiento de la muestra y permite
la calibracin que se lleva a cabo utilizando estndares acuosas. Estearato de
octilo se utiliz como fase oleosa. De Tween 80 y Triton X100 se probaron como
agentes tensioactivos. El tipo y la proporcin de formulaciones ptima se
determinaron y su eleccin dependan del elemento estudiado. La preparacin de
la emulsin se realiz por un mtodo convencional que implica la mezcla de
ambas fases a 75 5 C por agitacin magntica y de inversin de fase para
cambiar la relacin de agua a aceite al aumentar el volumen de la fase externa de
agua-tensioactivo y, correspondientemente, la disminucin de la volumen de fase
interna. La validacin del mtodo se llev a cabo en contra de un material de
referencia estndar de chocolate para hornear (SRM 2384) y recuperaciones vari
de 88,6% para K a 105,5% para el Zn. El mtodo propuesto permite la evaluacin
de la situacin de metal esencial de chocolate con la mnima manipulacin de la
muestra y fue reproducible y econmico.
Introduccion
El chocolate es un producto obtenido a partir de habas de cacao Theobroma. Con
el fin de procesar los granos de cacao en el chocolate o cacao, se dejan fermentar,
se seca, tostada y, finalmente, se tritur hasta que se transforman en un licor.
Categoras primarias de chocolate son negro, con leche y blanco. El primero est
hecho mediante la mezcla de licor de cacao, manteca de cacao, el azcar y la
vainilla. El segundo utiliza el mismo proceso, con el incremento de la leche, y el
blanco no incluye el licor de cacao, slo la manteca de cacao, leche y azcar
(Afoakwa, Paterson, y Fowler, 2007). El chocolate se consume en todo el mundo,
en todos los segmentos de la sociedad y por la gente de todas las edades. Hoy en
da, el consumidor est cada vez ms preocupado por el estado nutricional de los
productos alimenticios y, teniendo en cuenta que el chocolate es una fuente muy
rica de muchos minerales esenciales, puede contribuir a una dieta saludable. Sin
embargo, la evaluacin de la ingestin de nutrientes es una tarea muy compleja
(Borchers, Keen, Hannum, y Gershwin, 2000). Los datos nutricionales disponibles
son a menudo viejos e incompletos y en muchos casos fiables debido a la falta de
descripcin de los procedimientos analticos (Ribeiro, de Morais, Colugnati, y

Sigulem, 2003). La determinacin de metales en los alimentos se ha convertido en

un campo importante en el anlisis de alimentos (Reyes y Campos, 2006).
Sin embargo, la determinacin precisa de los metales en el chocolate sigue siendo
un reto analtico, debido a las dificultades que surgen de caractersticas de la
matriz. Llama la espectrometra de absorcin atmica (FAAS) es una tcnica de
deteccin de gran alcance para la determinacin de elementos en el rango de
ppm. Las ventajas de la FAAS incluyen interferencias bien caracterizados, bajo la
habilidad del operador requerido para la operacin, y relativamente bajo costo de
la instrumentacin y mantenimiento (Welz y Sperling, 1999). Sin embargo, el
anlisis de chocolate directa por FAAS no es posible y la determinacin de
metales en este tipo de matriz implica necesariamente digestin de la muestra,
teniendo en cuenta que contiene un alto contenido de compuestos orgnicos.
La literatura reporta mtodos de tratamiento de la muestra de chocolate que
involucran la digestin por microondas, la digestin hmeda, y la incineracin en
seco (Dahiya, Karpe, Hegde, y Sharma, 2005; Gldas, 2008;. Jalbani et al, 2007;
Sepe, Costantini, Ciaralli, Ciprotti, y Giordano, 2001). Los cidos y perxidos se
suelen aadir para mejorar la descomposicin de la muestra. Todos estos
procedimientos resultan en medidas adicionales, lo que puede dar lugar a
inconvenientes tales como la contaminacin y las prdidas durante la
manipulacin (Vinas, Pardo-Martnez, y Hernndez-Crdoba, 2000). La emulsin
directa con tensioactivos proporciona un procedimiento rpido para la preparacin
de la muestra ya que este enfoque no requiere ninguna destruccin de la matriz
orgnica (Sanz-Medel, de la Campa, Gonzlez, y Fernndez-Snchez, 1999). Es
simplemente reduce la viscosidad y el contenido orgnico de la muestra, por lo
que las propiedades de la muestra de chocolate de cerca a los que son capaces
de ser analizados por FAAS, mientras se mantiene la homogeneidad y la
estabilidad del sistema.
En estudios anteriores, la emulsificacin de las muestras se utiliza
satisfactoriamente para el anlisis de los huevos de gallina enteros de medicin
Se por horno de grafito espectrometra de absorcin atmica (GFAAS) y Na, K,
Ca, Mg, Zn y Fe por FAAS. La emulsin de aceite en agua estabilizada la muestra,
manteniendo la homogeneidad del sistema y reduce la viscosidad y el contenido
orgnico de la muestra, lo que permite el anlisis de muestras de huevos por
GFAAS y por FAAS (Ieggli, Bohrer, do Nascimento, y de Carvalho, 2010;. Ieggli et
al, 2009). El objetivo de este estudio fue investigar el uso de emulsiones como
preparacin de la muestra para la determinacin rutinaria de Na, K, Ca, Mg, Zn y
Fe en el chocolate por FAAS. Las ventajas esperadas de este procedimiento son
la mayor estabilidad y facilidad de manejo de las emulsiones de la muestra, lo que
permite el uso de estndares acuosas para la calibracin. La fiabilidad del
procedimiento se comprob mediante el anlisis de material de referencia
estndar.
Experimental
2.1. Instrumentacin / procedimiento

Todas las mediciones se llevaron a cabo utilizando un Jena AG ANALYTIK (Jena,

Alemania) modelo novAA 300 Espectrmetro de absorcin atmica equipado con
SpectrAA (Varian, Australia) Lmparas de ctodo hueco, segn la fuente de
radiacin. Se utiliz una llama de aire-acetileno u xido nitroso-acetileno; las
velocidades de flujo de gas y la altura del quemador se ajustaron con el fin de
obtener el mximo de la seal de absorbancia para cada elemento. Otros
parmetros instrumentales se establecen en los valores mostrados en la Tabla 1.
2.2. Los reactivos y muestras
Todos los reactivos fueron de grado analtico, y todas las emulsiones se
prepararon con agua destilada y desionizada que se purific adicionalmente
mediante un dispositivo de Milli-Q agua de alta pureza (resistividad elctrica de
18,0 cm MX) (Millipore, Bedford, EE.UU.). Laboratorio de vidrio se mantuvo
durante la noche en 10% (v / v) de HNO3 en solucin de etanol y poco antes del
uso se lav con agua y se sec en un entorno libre de polvo. cido ntrico
concentrado usado en este estudio fue suministrado por Merck. De sodio, de
potasio, de calcio, de magnesio, de zinc, y soluciones estndar de hierro (1,000
mg l 1) se obtuvieron del Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa (NIST,
EE.UU.) y se diluy como sea necesario para obtener las normas de trabajo. Los
tensioactivos no inicos Triton X100 (Fluka) y Tween 80 (Fluka) se probaron para
la preparacin de la emulsin. Estearato de octilo (Galena, Brasil) se us como la
fase oleosa. El material de referencia certificado (CRM) SRM 2384 Baking
chocolate (NIST) se utiliza para comprobar la exactitud del mtodo propuesto.
Las muestras de chocolate analizadas en este estudio fueron comprados en los
supermercados de Santa Maria (Brasil) y el porcentaje de cacao variaron. Las
muestras de chocolate eran cinco de chocolate blanco (marcas: Neugebauer,
Nestle Classic, Lacta Laka, Neugebauer Dupy, Garoto), cinco de chocolate con
leche (Neugebauer, Nestle Classic, Lacta, Neugebauer Dupy, Garoto), y siete de
chocolate negro (Neugebauer, Nestle Classic , Lacta Amaro, Neugebauer Dupy,
Garoto, el 70% de cacao Neugebauer y Dark & Soft 50% Cacao Lacta).
2.3. Preparacin de la emulsin
Las emulsiones de aceite-en-agua se prepararon utilizando una secuencia
especfica con el fin de garantizar su estabilidad. Las alcuotas de las muestras de
tensioactivo, aceite y chocolate o material de referencia se pesaron y se colocaron
en un vaso de precipitados de 80 ml, y despus con agua caliente (65 C durante
Triton X100 y 75 C para el Tween 80, vase la seccin 3.2) se aadi con
agitacin continua hasta se alcanz el volumen requerido. Agitacin magntica
(3.000 rpm) se mantuvo durante 15 min a temperatura ambiente (22 C). El
volumen total del sistema era de 50 ml, que fue alcanzado por el aumento del
volumen de la fase externa de agua-tensioactivo y, correspondientemente,
disminuyendo el volumen de fase interna. Una emulsin en blanco se prepar de
la misma manera y sin adicin de la muestra. Cantidades de la muestra vari entre
0,2% y 8,0% (w / v) de acuerdo con la cantidad esperada de analito en la muestra.
Para los componentes presentes en concentraciones ms grandes, tales como
sodio, potasio, calcio y magnesio, la emulsin se prepar con una cantidad de

muestra mximo de 0,2%. Por otro lado, para cantidades ms pequeas de zinc y
el hierro, entre 2,0% y 8,0%, eran necesarias.
2.4. Diseo experimental y estudio de estabilidad
Un diseo factorial preliminar se aplic para investigar la influencia de cantidades
de aceite y el emulsionante en estabilidad de la emulsin. Su influencia en la
estabilidad de la emulsin se evalu usando un diseo factorial completo 23. El
diseo requiere un total de nueve experimentos por combinacin de aceite /
emulsionante.
2.5. Estabilidad de la emulsin Estabilidad de la emulsin optimizado se monitoriz
midiendo el grado de separacin de fase gravitacional. Las mejores formulaciones
de diseo experimental se controlaron mediante la prueba de la formacin de nata.
Para la medicin de la estabilidad fsica, 10 ml de cada emulsin de chocolate
preparado se verti en un tubo graduado y se mantiene a temperatura ambiente
(25 C). El volumen de la capa de nata separada en cada tubo se registr
despus de 1, 2, 7, 14, y 21 das de almacenamiento. El ndice de estabilidad de la
emulsin (ESI) se calcul como porcentaje:. ESI (%) = (altura restante emulsin /
altura emulsin inicial) 100 El ESI se calcul para mostrar la estabilidad de las
emulsiones puesto que la mayor sea el valor ESI la mayor estabilidad de la
emulsin .
3. Resultados y discusin
Una emulsin es un sistema termodinmicamente estable compuesta por agua,
aceite y surfactante (Sinko, 2008). Basado en este concepto, emulsiones han sido
poco explotados como una herramienta analtica utilizando todas las condiciones
ideales para producir una emulsin estable y adecuada. A fin de utilizar
emulsiones como preparacin de la muestra para las mediciones de FAAS,
algunos criterios deben tenerse en cuenta en la planificacin de la formulacin: la
emulsin debe contener solamente los componentes necesarios para estabilizar la
muestra, en otras palabras, muestra, tensioactivo, agua y, si es necesario , un
componente oleoso adicional; la emulsin debe ser estable durante un perodo
razonable, que debe durar durante un intervalo de tiempo suficientemente largo
para completar el procedimiento de determinacin; la emulsin debe presentar una
baja viscosidad para permitir la aspiracin de la muestra correcta; y todos los
componentes deben presentar contaminacin con metales de baja y baja de fondo
durante la medicin FAAS.

3.1. Estudios de formulacin

Las emulsiones se clasifican como emulsiones de aceite-en-agua (O / W) cuando

las gotitas de aceites se dispersan en una fase externa acuosa continua; y
emulsiones de agua-en-aceite (W / O) cuando las gotitas de agua se dispersan en
una fase externa oleosa continua. Dado que las emulsiones se comportan de
acuerdo a su fase externa, para fines analticos, emulsiones de aceite-en-agua
son la opcin ms adecuada, ya que permiten la calibracin con estndares
acuosas, adems de presentar caractersticas de estabilidad a largo plazo y de
baja viscosidad (Remington, 1998). El sistema de equilibrio hidrfilo-lipfilo (HLB)
para la seleccin de emulsionantes adecuados para estabilizar emulsiones fue
desarrollado por Griffin y se ha utilizado durante unos cinco dcadas. De acuerdo
con la escala de Griffin, tensoactivos con valores de HLB entre 9,6 y 16,7 se
considera hidrfilo (soluble en agua), y tienden a formar emulsiones de aceite-enagua (Sinko, 2008). Los emulsionantes no inicos tales como Tween 80 y Triton
X100 satisfacer todos los requisitos necesarios: tienen valores de HLB ideales
(13,5 y 15,0, respectivamente), que no tienen propiedades de formacin de
espuma, evitando la distribucin heterognea de las gotas de aceite en la
emulsin (Sanz-Medel et al., 1999), y adems, son baratos y fcilmente
disponibles en la mayora de los laboratorios de anlisis.
La relacin aceite / tensioactivo se determina por la planificacin experimental. La
combinacin de 4% de emulsionante y el aceite de 4% produjo, para cantidades
de muestra que varan de 0,2% a 8%, la emulsificacin sin coalescencia. En todos
los experimentos en los que la cantidad de petrleo era ms pequea que la
cantidad de emulsionante, la separacin de las fases se llev a cabo
inmediatamente despus de la preparacin. Esto muestra que un exceso de
emulsionante en relacin con la fase oleosa favorece inestabilidad de la emulsin.
La Tabla 2 presenta la mejor formulacin de la planificacin experimental y los
metales que se pudo determinar en cada formulacin. Los criterios de seleccin se
discuten en la Seccin 3.3. A pesar de la estabilidad de la formulacin y la
capacidad de determinacin de metal, era necesario analizar el nivel de
contaminacin por los metales estudiados en los aceites y tensioactivos elegidos.
En nuestro trabajo anterior, ya se determin el contenido de metal de aceite y
tensioactivo. Estearato de octilo presenta una relativamente baja contaminacin de
todos los metales investigados. Tween 80 presenta un alto contenido de sodio y
Triton X100 de alto contenido en potasio y calcio. Por lo tanto, para estos
elementos, la contaminacin limita la eleccin de tensioactivo y aceite (Ieggli et al.,
2010).

3.2. Formacin y estabilizacin de la emulsin Por lo general, las emulsiones se

preparan a temperaturas entre 70 y 80 C, y la fase acuosa se calienta 5 C ms
que la fase oleosa. Sin embargo, en este trabajo las mejores temperaturas
observadas fueron 65 C durante Triton X100 y 75 C para el Tween 80. Dado
que el comportamiento de los sistemas estables depende de las condiciones de
preparacin, se tuvo cuidado para asegurar que el procedimiento se llev a cabo
exactamente de la misma manera para todos los experimentos. La inversin de
fases, que cambia la relacin de agua a aceite al aumentar el volumen de la fase
externa de agua-tensioactivo y, correspondientemente, disminuyendo el volumen
de fase interna, proporciona una emulsin finamente dispersada de aceite-enagua con estabilidad a largo plazo (Lachman, Lieberman, y Kanig, 2001). En el
perodo inicial de agitar las gotitas necesario para la emulsificacin se forman. Si
la agitacin excede el perodo necesario para la estabilidad ideal, la adhesin
puede tener lugar debido a la colisin entre las gotas. Este perodo de tiempo es
generalmente determinada empricamente. En este estudio, el tiempo estipulado
era 2 min de agitacin mecnica manual para alcanzar la emulsificacin, seguido
por agitacin magntica a 3000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente para
la estabilizacin de la completa del sistema.
Prueba de formacin de crema tambin se puede usar para determinar la
estabilidad de emulsin (Mirhosseini, Tan, Hamid, Yusof, y Chern, 2009). La final
apariencia de todas las emulsiones era de color blanco lechoso a ligeramente
marrn y todas las emulsiones de chocolate presentan valores relativamente altos
de ESI, ya que la composicin de emulsin se ha optimizado con anterioridad por
la planificacin experimental. La combinacin de la muestra 80/chocolate
estearato de octilo / Tween present mayores valores de ESI (ESI1day = 100%ESI21days = 96,3%). El estearato de octilo / combinacin muestra Triton
X100/chocolate present menores valores de ESI (ESI1day = 97,5%-ESI21days =
94,0%). Las emulsiones presentan un precipitado despus de 24 h. El precipitado
se form probablemente a partir del contenido slido que no se estabiliza por las
micelas, sin embargo homogeneidad se restableci agitando la mezcla.
3.3. Estudio aplicabilidad analtica y validacin
Idealmente, una sola emulsin debe ser utilizado para la determinacin de todos
los elementos, sin embargo, esto no fue posible debido principalmente a la
presencia de los analitos como contaminantes en los dos tensioactivos y
componentes oleosos (Ieggli et al., 2010) y debido a diferentes contenidos de
metales en las muestras. Sobre la base de estos criterios, los metales que podran
ser analizados en la misma emulsin se muestran en la Tabla 2. Las
caractersticas de un mtodo analtico se definen por las figuras de mrito, que
deberan determinarse experimentalmente. El mtodo propuesto fue validado por
seis metales (Na, K, Ca, Mg, Zn y Fe). Las figuras de mrito presentados eran la
linealidad de las curvas de anlisis, exactitud y precisin. Adems, la sensibilidad
se determin por la concentracin de caracterstica (C0).

Las ventajas del procedimiento de emulsificacin para muestras grasos se han

descrito en la literatura. Cuando estabilizado correctamente, la muestra
emulsionado es compatible con la mayora de los instrumentos de anlisis, lo que
permite el uso de procedimientos de calibracin simples debido a la minimizacin
de las interferencias (Sanz-Medel et al., 1999). En este estudio, la calibracin con
estndares acuosas era posible y los rangos de linealidad fueron seleccionados
para abarcar las concentraciones de metales esperados en las muestras reales.
Analticos curvas se construyeron mediante la evaluacin de la relacin entre la
respuesta (altura del pico y la absorbancia) y la concentracin por anlisis de
regresin lineal produciendo los resultados que se muestran en la Tabla 3. En
todos los casos, un ajuste lineal se encontr que era adecuado para el propsito.
Tabla 3 presenta tambin los valores encontrados para la concentracin
caracterstica para todos los elementos. La exactitud del mtodo se confirm
adicionalmente mediante la determinacin de los metales en un CRM chocolate de
hornada. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Comparacin estadstica por
medio de la prueba t mostr que no haba diferencia significativa entre los valores
obtenidos con el mtodo propuesto y los valores certificados.
La precisin de los procedimientos fue determinado a travs de la repetibilidad
(intra-da de precisin). Seis emulsiones de chocolate se ensayaron durante el
mismo da, bajo las mismas condiciones experimentales. La precisin intermedia
(entre-da) se evalu mediante el ensayo de emulsiones recin preparadas en tres
das diferentes (n = 3). La repetibilidad present buena desviacin estndar
relativa (RSD) los valores para todos los metales. La precisin intermedia se
evalu mediante el RSD y F-prueba. Los valores F calculados fueron inferiores a
F-valores tabulados, indica que no hay diferencia significativa entre los resultados
obtenidos en diferentes das. Todos los datos de precisin se muestran en la Tabla
4. Aunque la medicin de la FAAS alcalinos y metales alcalinotrreos podr
requerir la presencia de un tampn de ionizacin (Welz y Sperling, 1999) para la
supresin de la ionizacin del analito, en este estudio no se utiliz.
Probablemente, debido a la naturaleza de las matrices, no se observaron cambios
significativos cuando se utiliz el tampn de cloruro de cesio / lantano para las
mediciones con la llama de xido nitroso-acetileno.
3.4. Aplicacin a muestras reales
El mtodo propuesto se aplic para evaluar Na, K, Ca, Mg, Zn, y los niveles de Fe
en diferentes muestras de chocolate. El objetivo fue contribuir a proporcionar una
lnea de base de estos elementos en diferentes tipos de chocolate (blanco, leche y
oscuras). El anlisis se llev a cabo por triplicado y los resultados se muestran en
la Tabla 5.

El mineral presente en la concentracin ms alta es el potasio (K), con cantidades

que varan desde 2.495 hasta 6.361 g LG 1. Curiosamente, la mayor es el
contenido de cacao ms alto es el nivel de K. La cantidad de sodio result ser
directamente relacionado con el contenido de la leche y el licor de cacao en los
chocolates, sin embargo, tambin presenta grandes variaciones entre las marcas.
Chocolates contienen cantidades variables de calcio 324-4533 LG g 1, donde
los niveles ms altos son en chocolates blancos. El chocolate contiene niveles
365-1.834 g lg 1de Mg, de chocolate blanco y negro, respectivamente.
Los contenidos de componentes de menor importancia, Fe y Zn, variaron desde
1,2 hasta 140 g LG 1 y del 8 al 23 LG g 1, respectivamente. Para ambos
metales, cuanto mayor sea el contenido de cacao ms alto es el contenido de
metal.

Conclusin
Sera ideal si una sola emulsin se podra utilizar para la determinacin de todos
los elementos seleccionados, sin embargo, esto no era posible debido al contenido
de metal de tensioactivo y los diferentes niveles de cada metal en las muestras de
chocolate. Las principales ventajas del mtodo propuesto sobre mtodos de
digestin tradicionales son que no requiere un tratamiento de la muestra a largo o
grandes cantidades de disolventes orgnicos o cidos inorgnicos y es simple y
muestra una buena precisin y reproducibilidad. A medida que los desafos y
principales requisitos para la aplicacin de emulsin en espectrometra atmica
implican la obtencin de emulsiones estables con baja viscosidad, el mtodo
propuesto incluyendo la emulsificacin y la determinacin de metales subsiguiente
para FAAS cumplido estos requisitos y demostr ser sensible, reproducible, simple
y econmico.