UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NCLEO DE NUEVA ESPARTA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS
CATEDRA: MICROBIOLOGA GENERAL

TCNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE CULTIVOS

BACTERIANOS.

Prof. Encargado.
Licdo. Pedro Lpez
Asistente tcnico

Presentado por:
Br. Ana Karina Rojas
C.I: 22-998-942

Yean Carlos Marn

Guatamare, 05 de Diciembre del 2013.

MARCO TERICO.
Aislamiento de bacterias: separacin de un determinado microorganismo del
resto que le acompaan.
Agar XLD: agar ms nutrientes, usado para cultivar microorganismos o pequeas
plantas como la briofita Physcomitrella patens.
Cultivos puros: contienen un solo tipo de microorganismo, obtenidas de colonias
aisladas por resiembras (pase de un medio de cultivo a otro).
Pipeta: instrumento de laboratorio que se utiliza para medir o transvasar
pequeas cantidades de lquido. (Suelen ser de vidrio).
Placa de Petri: recipiente redondo de cristal o plstico con una cubierta de la
misma forma pero algo ms grande de dimetro, para poder cerrar el recipiente.
Siembra para aislamiento: se utiliza parar obtener cultivos puros en placas de
petri, que contienen medios de cultivos slidos.
Siembra para inoculacin: consiste en tomar una pequea porcin de la muestra
y diluirla para dispersarla y que crezca con ms facilidad en el medio de cultivo
(lquido o solido).

OBJETIVOS DE LA PRCTICA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

GENERAL:

Aislar Bacterias puras del tracto bucal, utilizando caldos y agar lactobacilos.

Aislar Bacterias puras de aguas residuales, utilizando caldos y agar lauril

sulfato.

Aislar Bacterias puras de aguas residuales, utilizando caldo enriquecido

selenito cistina y agar XLD.

Determinar el nmero ms probable de bacterias residuales a partir de los

tubos mltiples.

Identificar

bioqumicamente

las

bacterias

puras

producto

de

las

experiencias anteriores, utilizando agar inclinado TSI (hierro tres azucares).

MATERIALES Y MTODOS

Practica 1.- Aislamiento de bacterias puras del tracto bucal, utilizando caldos y
agar lactobacilo.
Se realiz un cepillado bucal y se introdujo el cepillo en una suspensin de
buffer fosfato salino, agitando por aproximadamente de 2 a 4 minutos inoculando
un mililitro, usando una pipeta de 2 ml en medios de cultivo con caldo lactobacilo y
se encub a 37C por 24 horas.
Posteriormente, se realiz un estriado en placas de Petri con agar lactobacilo y
encubados a 37 C por 24 horas, luego de ello se seleccionaron tres colonias las
cuales fueron sembradas con un aza metlica estril en tubos de ensayos con
caldo lactobacilos e encubados a 37 C por 24 horas, este procedimiento se
realiz varias veces hasta obtener colonias puras.
Finalmente estos fueron sembrados por puncin y estriado utilizando una aguja
metlica estril en tubos de ensayo con agar inclinado TSI (hierro tres fosfato) e
encubado a 37 C. Identificando bioqumicamente las colonias sembradas y
comparadas con la bibliografa correspondiente (Ver figura 1).

Se agito en Buffer
fosfato salino 2 a 4 min

2 ml en Caldo
Lactobacilos

37C X 24 horas
Cepillado de la
boca

Aza metaliza estril se

realiz un estriado
Agar lactobacilos

37C X 24 horas

.
C1

C2

C3

Caldo lactobacilos

37C X 24 horas

Agar lactobacilos

37C X 24 horas

Caldo lactobacilos

37C X 24 horas

37C X 24 horas

Pruebas Bioqumicas con agar inclinado TSI

Figura 1.- Procedimiento de aislamiento de bacterias puras a partir de muestras

bucales.

Practica 2.- Aislamiento de bacterias puras de aguas tratadas, utilizando caldos y

agar lauril sulfato.

A partir de muestras de aguas tratadas se extrajo un mililitro con una propipeta,

y se aadi en 50 ml de caldo lauril sulfato, contenidos en una fiola, esta se
encubo a 37 C por 24 horas. Pasado el tiempo correspondiente se produjo un
cultivo polimicrobiano, del cual se tom una muestra con un aza metlica
previamente estril y se realiz un estriado en una placa de Petri con agar lauril
sulfato, encubado por 37 C por 24 horas.
Pasadas las 24 horas se observaron los resultados y se seleccionaron 3
colonias diferentes, cada una de ellas fueron aisladas con una aguja metlica
previamente estril en tubos de ensayos con caldo lauril sulfato e incubadas a 37
C por 24 horas. Seguidamente los tres tubos con colonias fueron resembrados
por estriado en placas de Petri con agar lauril sulfato, encubndolas a 37 C por
24 horas, este procedimiento se repiti varias veces hasta obtener colonias puras.
Una vez puras las colonias seleccionadas al inicio, fueron sembradas con una
aguja estril por puncin y estriado en tubos de ensayos con agar inclinado hierro
tres azucares (TSI), e incubados a 37 C por 24 horas. Identificando
bioqumicamente las colonias sembradas y comparadas con la bibliografa
correspondiente (Ver figura 2).

Se vierte 1 ml
de H2O
residual

Caldo Lauril
Sulfato

37C X 24 horas

Aza metaliza estril se

realiz un estriado
Agar Lauril
Sulfato

C1

37C X 24 horas

C2

C3

Caldo Lauril Sulfato

37C X 24 horas

Agar Lauril Sulfato

37C X 24 horas

Caldo Lauril Sulfato

37C X 24 horas

37C X 24 horas

Pruebas Bioqumicas con agar inclinado TSI

Figura 2.- Procedimiento de aislamiento de bacterias puras de aguas residuales,

utilizando caldos y agar lauril sulfato.

Practica 3.- Determinacin de bateras puras a partir de estriado de Agar XLD.

A partir de aguas residuales se tom una muestra con una propipeta de 5 ml

los cuales se aadieron en 50 ml de caldo enriquecido de selenito cistina y se
incubo a 37 C por 24 horas, pasado el tiempo correspondiente se tom una
muestra con una aza metlica estril y se realiz un estriado en una placa de Petri
con agar XLD, encubados a 37 C por 24 horas.
Se tomaron dos muestras de colonias puras, resultado del estriado en las
placas de Petri con agar XLD, y se sembr por puncin y estriado en cada tubo de
ensayo con agar inclinado hierro tres azucares (TSI), utilizando una aguja metlica
previamente estril, y se encubo por 37 C por 24 horas. Determinando el gnero
de bacterias a partir de esta prueba bioqumica (ver figura 3).

Se vierte 5 ml
de H2O
residual

Caldo enriquecido
selenito cistina

37C X 24
horas

Aza metaliza estril se

realiz un estriado

Agar XLD

C1

37C X 24
horas

C2

37C X 24
horas

Pruebas Bioqumicas con agar inclinado TSI

Figura 3.- Procedimiento de aislamiento de bacterias puras de aguas residuales,

utilizando agar XLD.

Practica 4.- Determinacin del nmero ms probable de bacterias de aguas

residuales, a partir de los Coliformes totales y fecales con tubos mltiples.

A partir de agua residual de efluente de una planta de tratamiento, se procedi

a tomar con una propipeta 10 ml de muestra y se aadieron en tres tubos de
ensayo con 10 ml de caldo bilis verde brillante (50% de muestra), de igual forma
se aadieron 1 ml en tres tubos de ensayos con 10 ml de caldo bilis verde brillante
(10 % de muestra); por ltimo, se tom 1 ml de la muestra y se diluyo en 9 ml de
buffer fosfato salino contenidos en un tubo de ensayo, y de este se extrajo 1 ml y
se aadi en otros tres tubos de ensayos con caldo bilis verde brillante (0.1 % de
la muestra), todos los tubos fueron encubados a 37 C por 24 horas, pasado el
tiempo correspondiente los tubos que resultaron positivos para Coliformes totales
fueron resembrados utilizando un aza metlica estril e incubados a 44 C (bao
de mara) por 24 horas determinando el crecimiento de Coliformes fecales (ver
figura 4).
Se determin el nmero ms probables (NMP/100 ml) comparando los tubos
que dieron positivos a diferentes concentraciones (10 ml, 1 ml y 0,1 ml) con las
referencias aportadas por el profesor de la materia.

Efluente de
Aguas tratadas

Pipeta de 10 ml
1 ml

10 ml

1 ml

Buffer fosfato
salino

9 ml
1 ml

Encuban a
37C x 24 h.
10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

Encuban a
44C x 24 h.

Figura 4.- Procedimiento de la determinacin del nmero ms probable de

bacterias de aguas residuales, a partir de tubos mltiples.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Aislamiento de bacterias puras del tracto bucal, utilizando caldos y agar

lactobacilo.

Figura 5.- Colonias puras en agar lactobacilo.

En la figura 5 se nota la presencia de colonias de color blanco que

posiblemente

pueden

ser

Lactobacilos

casei,

Lactobacilos

leichmannii,

Lactobacilos plantarum o Enterococcus faecalis segn The Himedia manual

(1998).

Aislamiento de bacterias puras de aguas tratadas, utilizando caldos y agar lauril

sulfato.

Figura 6.- Colonias estriadas en agar Lauril sulfato.

En la figura 6, se nota la presencia el crecimiento de colonias de una variedad

de bacterias de las cuales se seleccionaron tres (3): C1: colonia con forma de
nube, color azul con una tonalidad verdosa; C2: colonia circular, color blanquecina
y muy grumosa y C3: colonia en forma de cotufa blanquecina con los bordes
transparentes muy grumosa.

Figura 7.- Tubos de ensayo con crecimiento de bacterias en caldo Lauril sulfato.

En la figura 7 se observ cambio de coloracin comparado con el tubo control,

de igual forma se nota la presencia de gas, lo cual indico digestin bacteriana, con
depsitos de sedimento en el fondo comparando estos resultados con The
Himedia manual (1998), que posiblemente podran ser Enterobacter aerogenes,
Escherichia Coli, Salmonella typhimuriun, Staphylococcus aureus o Enterococcus
faecalis.

Determinacin de bateras puras a partir de estriado de Agar XLD.

Figura 8.- Presencia de colonias puras en placa de agar XLD.

En la figura 8, Se obtuvo como resultado la observacin del crecimiento de

colonias de color amarillo las cuales son posibles Proteus vulgaris, Proteus
mirabilis y la presencia de colonias rojas las cuales posiblemente sean Salmonella
parahyphy a, Salmonella parahyphi b, Shiguella sonnei o Shiguella dysenteriae
segn The Himedia manual (1998).

Prueba bioqumica con agar inclinado TSI (hierro tres azucares):

C1

C2

C3

Figura 9.- Prueba bioqumica en agar inclinado TSI con muestras de agar
Lactobacilo y agar Lauril sulfato.

En la figura 9, en la colonia 1 (C1) se nota la presencia de oxgeno y

produccin de sulfuro de hidrogeno, en la C2 y C3 se nota la formacin de sulfuro
de hidrogeno, esto indica que la glucosa en fermentado con produccin de sulfuro
de hidrogeno segn Infante (2011), por otra parte, en el Manual de Difco (1984) y
The Himedia manual (1998) posiblemente sean las colonias de Proteus vulgaris o
Salmonella enteritidis.

C1

C2

Figura 10.- Prueba bioqumica en agar inclinado TSI, con muestras de agar XLD.

En la figura 10 se nota en C1, la presencia de gas y cambios de coloracin a

amarillo en comparacin con el control, indicando una fermentacin de la glucosa,
lactosa y/o sacarosa (Infante, 2011), mientras que en C2 se nota la presencia de
gas, formacin de sulfuro de hidrogeno, y cambio de coloracin a negro lo que
indica glucosa fermentada con produccin de sulfuro de hidrogeno y gas (Infante,
2011). En comparacin con The Himedia manual (1998), indica que posiblemente
puedan ser C1: Escherichia coli y C2: Salmonella typhimurium.

Determinacin del nmero ms probable de bacterias de aguas residuales, a partir

de los coliformes totales y fecales con tubos mltiples.

Tabla 1.- Nmero ms probable bacterias de aguas tratadas a temperaturas de 37

C y 44C.
Tubos que dan positivos
Temp

NMP/100

Coliformes

10 ml

1 ml

0.1 ml

ml

37C

3/3

3/3

3/3

>1100

Totales

44C

3/3

3/3

3/3

>1100

Fecales

En la tabla 1, se nota el crecimiento de coliformes totales a temperaturas de

37C,

en las concentraciones de 10ml (50%), 1ml (10%) y 0,1ml (0,1%)

respectivamente de igual forma a 44C se present el crecimiento de coliformes

fecales. Teniendo un nmero ms probables de >1100 en 100 ml de la muestra.

CONCLUSIN.

En conclusin puedo agregar que en el tracto bucal las placas de agar lactobacilo
obtuvo presencia de bacterias que posiblemente sean Lactobacilos casei,
Lactobacilos leichmannii, Lactobacilos plantarum o Enterococcus faecalis segn
The Himedia manual (1998).
En las bacterias puras de aguas tratadas, utilizando caldos y agar lauril sulfato
crecimiento de colonias de una variedad de bacterias .Tubos de ensayo con
crecimiento de bacterias en caldo Lauril sulfato se observ presencia de gas, lo
cual indico digestin bacteriana, con depsitos de sedimento en el fondo
comparando estos resultados con The Himedia manual (1998), que posiblemente
podran ser Enterobacter aerogenes, Escherichia Coli, Salmonella Typhimuriun,
Staphylococcus aureus o Enterococcus faecalis.
En las placas de agar XLD resultado la observacin del crecimiento de colonias de
color amarillo las cuales son posibles Proteus vulgaris, Proteus mirabilis

y la

presencia de colonias rojas las cuales posiblemente sean Salmonella parahyphy a,

Salmonella parahyphi b, Shiguella sonnei o Shiguella dysenteriae segn The
Himedia manual (1998).
En las prueba bioqumicas todas resultaron + y en el cuadro comparativo el
numero ms probable >1100 para coliformes fecales y totales en 37c y 44c.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

Clavell Luis A., Pedrique de Aulacio Magaly. (1999). Microbiologa manual de

mtodos generales. Primera reimpresin revisada. Facultad de Farmacia.
Universidad Central de Venezuela, Caracas.
Consulta en lnea:
02/12/2013.

http://www.pomif.com/pages/.../

aislamientos.

Consulta

Manacorda, Cuadros y lvarez. (2007). Manual prctico de microbiologa - tomo

II: microbiologa ambiental ii. Captulo 3. Tcnica de fermentacin en tubo
mltiple (NMP) para miembros del grupo de los coliformes: colimetra.
Manual difco. (1984), Medios de cultivos deshidratados y reactivos para la
microbiologa dcima edicin Detroit michigan. Usa.
Sasson, Albert (1984). Las biotecnologas: desafos y promesas Investigaciones
Biolgicas. La Habana.
The HiMedia Manual for Microbiology Laboratory Practice. (1998).editorial
HiMedia. 524pp.
Tp laboratorio qumico. blogspot.com/2008/08/ pipetas.htm l#.Up0W9dL56ns
Consulta: 02/12/2013
Wikipedia Fundacin Wikimedia, Inc., una organizacin sin nimo de lucro
.http://es.wikipedia.org/wiki/Tubo_de_ensayo . Consulta 02/12/2013.

ANEXOS.