BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Bahan
2.1.1 ISONIAZIDE (INH)
2.1.1.1 Sifat Fisikokimia
Rumus Struktur

Rumus Molekul

: C6H7N3O

Berat Molekul

: 137,14

Nama Kimia

: Asam Isonikotinat Hidrazida

Kandungan

: Tidak kurang dari 98% dan tidak lebih dari 102,0%

C6H7N3O,

dihitung

terhadap

zat

yang

telah

dikeringkan.
Pemerian

: Hablur putih atau tidak berwarna atau serbuk hablur

putih; tidak berbau, perlahan lahan dipengaruhi oleh
udara dan cahaya.

Kelarutan

: Mudah larut dalam air; agak sukar larut dalam etanol;

sukar larut dalam kloroform dan dalam eter.

pH

: Antara 6,0 dan 7,5

Baku Pembanding : Sebelum digunakan lakukan pengeringan pada suhu

1050 selama 4 jam (DitJen POM, 1995)

Universitas Sumatera Utara

2.1.1.2 Kegunaan
Isoniazid berkhasiat tuberkulostatis paling kuat terhadap M. Tuberculosis
(dalam fase istirahat) dan bersifat bakterisid terhadap basil yang sedang tumbuh
pesat (Tjay, T.H. dan Rahardja, K., 2002)
2.1.1.3 Efek Samping
Mual, muntah, anoreksia, letih, malaise, lemah, gangguan saluran
pencernaan

lain,

neuritis

perifer

(paling

sering

terjadi

dengan

dosis

5mg/kgBB/hari), neuritis optikus, reaksi hipersensitivitas, demam, ruam, ikterus,

diskrasia darah, psikosis, kejang, sakit kepala, mengantuk, pusing, mulut kering,
gangguan BAK, kekurangan vitamin B6, hiperglikemia, asidosis metabolik,
ginekomastia, gejala reumatik, gejala mirip Systemic Lupus Erythematosus.
2.1.1.4 Dosis
Oral/i.m. dewasa dan anak-anak 1 dd 4-8 mg/kg/hari sehari atau 1 dd 300400 mg. Profilaksis 5-10 mg/kg/hari. (Tjay, T.H. dan Rahardja, K., 2002).
2.1.1.5 Farmakologi
Isoniazid menghambat sintesis dari mycolic acid yang merupakan
komponen penting dari dinding sel mikobakteri. Resorpsinya dari usus sangat
cepat; difusinya kedalam jaringan dan cairan tubuh baik sekali, bahkan menembus
jaringan yang sudah mengeras. Didalam hati INH diasetilasi oleh enzim
asetiltransferase menjadi metabolit inaktif. PP-nya ringan sekali, plasma t nya
antara 1 dan 4 jam tergantung pada kecepatan asetilasi. Eksresinya terutama
melalui ginjal (75-95% dalam 24 jam) dan sebagian besar sebagai asetilisoniazid.
(Tjay, T.H. dan Rahardja, K., 2002).

Universitas Sumatera Utara

2.1.2 VITAMIN B6
2.1.2.1 Sifat Fisikokimia
Rumus Struktur :

Rumus Molekul

: C8H11NO3.HCI

Berat Molekul

: 205,64

Nama Kimia

: Piridoksol hidroklorida
Pyridoxini Hydrochloridum

Kandungan

: Tidak kurang dari 98% dan tidak lebih dari 102,0%

C8H11NO3.HCI, dihitung terhadap zat yang telah
dikeringkan.

Pemeriaan

: Hablur atau serbuk hablur putih atau hampir putih;

stabil di udara; secara perlahan-lahan dipengaruhi oleh
cahaya matahari.

Kelarutan

: Mudah larut dalam air; sukar larut dalam etanol; tidak

larut dalam eter

pH

: lebih kurang 3

Baku Pembanding : Sebelum digunakan lakukan pengeringan dalam

hampa udara diatas silika gel p selama 4 jam.
(DitJen POM, 1995)

Universitas Sumatera Utara

2.1.2.2 Kegunaan
Vitamin B6 selain untuk mencegah dan mengobati defisiensi vitamin B6
dengan gejala berupa kelainan kulit (dermatitis), peradangan lendir mulut dan
lidah- kelainan susunan syaraf pusat dan gangguan eritopoetik berupa anemia
hipokrom mikrositer, juga diberikan bersama vitamin B lainnya.
2.1.2.3 Efek Samping
Jarang terjadi dan berupa reaksi alergi. Penggunaan lama dari 500mg/hari
dapat mencetuskan ataxia (jalan limbung) dan neuropati serius (Tjay, T.H. dan
Rahardja, K., 2002).
2.1.2.4 Dosis
Oral selama terapi dengan antagonis-piridoksin 10-100mg (HCl) sehari,
profilaksis 2-10mg (Tjay, T.H. dan Rahardja, K., 2002).
2.1.2.5 Farmakologi
Didalam hati Vitamin B6 dengan bantuan ko-faktor riboflavin dan
magnesium diubah menjadi zat aktifnya piridoksal-5-fosfat (P5P). Zat ini
berperan penting sebagai ko-enzim pada metabolisme protein dan asam-asam
amino (Tjay, T.H. dan Rahardja, K., 2002).
2.2 Spektrofotometri Ultraviolet
2.2.1 Teori Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan radiasi dengan panjang
gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk

Universitas Sumatera Utara

mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan

atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang (Khopkar,1990).
Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara
radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang
sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet,
cahaya tampak, infra merah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang
untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm, daerah cahaya tampak 380-780 nm,
daerah infra merah dekat 780-3000 nm, dan daerah infra merah 2,5-40 m atau
4000-250 cm-1 ( Ditjen POM, 1995).
Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik
aromatik, molekul yang mengandung elektron- terkonyugasi dan atau atom yang
mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari
tingkat energi elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi.
Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit
yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif
(Satiadarma, 2004).
Panjang gelombang cahaya ultraviolet dan cahaya tampak bergantung
pada mudahnya promosi elektron, dimana molekul-molekul yang memerlukan
lebih banyak energi untuk promosi elektron, akan menyerap pada panjang
gelombang yang lebih pendek sedangkan molekul yang memerlukan energi lebih
sedikit akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa
yang menyerap cahaya dalam daerah tampak mempunyai elektron yang lebih
mudah dipromosikan daripada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang
ultraviolet yang lebih pendek (Fessenden dan Fessenden, 1992).

Universitas Sumatera Utara

Gugus fungsi yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dekat dan daerah
tampak disebut kromofor dan hampir semua kromofor mempunyai ikatan tak
jenuh. Pada kromofor jenis ini transisi terjadi dari *, yang menyerap pada
max kecil dari 200 nm (tidak terkonyugasi), misalnya pada >C=C< dan -CC-.
Khromofor ini merupakan tipe transisi dari sistem yang mengandung elektron
pada orbital molekulnya. Untuk senyawa yang mempunyai sistem konyugasi,
perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan tereksitasi menjadi lebih kecil
sehingga penyerapan terjadi pada panjang gelombang yang lebih besar.
Gugus fungsi seperti OH, -NH2 dan Cl yang mempunyai elektronelektron valensi bukan ikatan disebut auksokrom yang tidak menyerap radiasi
pada panjang gelombang lebih besar dari 200 nm, tetapi menyerap kuat pada
daerah ultraviolet jauh. Bila suatu auksokrom terikat pada suatu kromofor, maka
pita serapan kromofor bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang (efek
batokrom) dengan intensitas yang lebih kuat. Efek hipsokrom adalah suatu
pergeseran pita serapan ke panjang gelombang lebih pendek, yang sering kali
terjadi bila muatan positif dimasukkan ke dalam molekul dan bila pelarut berubah
dari non polar ke pelarut polar (Noerdin, 1985; Dachriyanus, 2004).
2.2.2 Hukum Lambert Beer
Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel
yang disinari. Menurut Hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya
monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan
konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu
dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus
terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dapat ditulis dalam persamaan:

Universitas Sumatera Utara

A=a.b.C
Dimana: A = serapan (tanpa dimensi)
a = absorptivitas (l g-1 cm-1)
b = ketebalan sel (cm)
C = konsentrasi(g. l-1)
Jadi dengan Hukum Lambert-Beer konsentrasi dapat dihitung dari
ketebalan sel dan serapan. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik
untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu.
Menurut Roth dan Blaschke (1981), absorptivitas spesifik juga sering
digunakan sebagai ganti absorptivitas. Harga ini memberikan serapan larutan 1%
(b/v) dengan ketebalan sel 1 cm, sehingga dapat diperoleh persamaan:
A = A11 . b . C
Dimana: A11 = absorptivitas spesifik (ml g-1 cm-1)
b = ketebalan sel (cm)
C = konsentrasi senyawa terlarut (g/100 ml larutan)
2.2.3 Penggunaan Spektrofotometri Ultraviolet
Pada umumnya spektrofotometri ultraviolet dalam analisis senyawa
organik digunakan untuk:
1.

Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonyugasi dan

auksokrom dari suatu senyawa organik

2.

Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang serapan

maksimum suatu senyawa

3.

Mampu

menganalisis

senyawa

organik

secara

kuantitatif

dengan

menggunakan hukum Lambert-Beer (Dachriyanus, 2004).

Universitas Sumatera Utara

Analisis kualitatif
Kegunaan spektrofotometri ultraviolet dalam analisis kualitatif sangat
terbatas, karena rentang daerah radiasi yang relatif sempit hanya dapat
mengakomodasi sedikit sekali puncak absorpsi maksimum dan minimum, karena
itu identifikasi senyawa yang tidak diketahui, tidak memungkinkan.
Penggunaannya terbatas pada konfirmasi identitas dengan menggunakan
parameter panjang gelombang puncak absorpsi maksimum, max, nilai
absorptivitas, a, nilai absorptivitas molar, , atau nilai ekstingsi, A1%,

1 cm,

yang

spesifik untuk suatu senyawa yang dilarutkan dalam suatu pelarut dan pH tertentu
(Satiadarma, 2002).
Analisis Kuantitatif
Penggunaan utama spektrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis
kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang
mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai
detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul
adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi rendah nilainya sebanding
dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan dasar
analisis kuantitatif. Penentuan kadar senyawa organik yang mempunyai gugus
khromofor dan mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar tampak, penggunaannya
cukup luas. Konsentrasi kerja larutan analit umumnya 10 sampai 20 g/ml, tetapi
untuk senyawa yang nilai absorptivitasnya besar dapat diukur pada konsentrasi
yang lebih rendah. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar
tampak dapat juga ditentukan dengan spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak,

Universitas Sumatera Utara

apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya menjadi khromofor atau dapat
disambungkan dengan suatu pereaksi khromofor (Satiadarma, 2004).
Analisis

kuantitatif

dengan

metode

Spektrofotometri

UV

dapat

digolongkan atas beberapa pelaksanaan pekerjaan, yaitu;

1. Analisis kuantitatif zat tunggal (analisis satu komponen)
a. Metode Regresi
Analisis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan
persamaan garis regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi
standar yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan 5
rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan yang linier,
kemudian diplot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva kalibrasi.
Konsentrasi suatu sampel dapat dihitung berdasarkan kurva tersebut.
b. Metode Pendekatan
Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan
serapan standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel. Syarat
cara pendekatan yaitu serapan sampel tidak jauh berbeda dengan serapan baku
pembanding. Konsentrasi sampel (Cs) dihitung dengan rumus:
AP = a. b. Cp / As = a. b. Cs

Keterangan:
Ap

= Absorbansi baku pembanding

As

= Absorbansi sampel

Cp

= Konsentrasi baku pembanding

Cs

= Konsentrasi sampel

(Holme dan Peck, 1983).

Universitas Sumatera Utara

2. Analisis Kuantitatif Campuran Dua Macam Komponen atau Lebih

Analisis campuran dua atau lebih bahan kadang-kadang ditentukan secara
simultan dalam sekali pengamatan tanpa dipisahkan. Hal ini didasarkan pada
asumsi bahwa absorbansi total dari campuran komponen merupakan jumlah
serapan masing-masing komponen tersebut.
Ada tiga kemungkinan analisis campuran dua komponen atau lebih, yaitu;
a. Spektrum tanpa tumpang tindih (Overlap)
Spektrum tidak saling tumpang tindih memungkinkan untuk menemukan
suatu panjang gelombang dimana X menyerap dan Y tidak menyerap, serta
panjang gelombang serapan maksimum dimana Y menyerap dan X tidak
menyerap (Gambar 1). Komponen X dan Y masing-masing diukur pada 1 dan
2.

Gambar 1. Spektrum absorpsi senyawa X dan Y (tidak ada tumpang tindih

pada pada kedua panjang gelombang yang digunakan)
b. Spektrum tumpang tindih satu arah
Spektrum dari X dan Y tumpang tindih satu arah (Gambar 2). Y tidak
mengganggu pengukuran X pada 1 tetapi X menyerap cukup banyak bersama
sama dengan Y pada 2. Pemecahan masalah ini pada prinsipnya cukup

Universitas Sumatera Utara

sederhana. Konsentrasi X ditetapkan langsung dari serapan larutan pada 1.

Kemudian serapan yang diberikan oleh konsentrasi X pada 2 dihitung dari
absorptivitas molar X pada 2 yang sebelumnya telah diketahui. Serapan ini
dikurangkan dari serapan terukur larutan pada 2 sehingga diperoleh serapan
yang disebabkan oleh komponen Y. Kemudian konsentrasi Y dapat dihitung
dengan cara yang biasa.

Gambar 2. Spektrum absorbs senyawa X dan Y (tumpang tindih satu arah, X

dapat diukur tanpa gangguan Y, tetapi X mengganggu pada
pengukuran langsung dari Y).
c. Spektrum tumpang tindih dua arah
Spektrum dari X dan Y saling tumpang tindih dua arah (Gambar 3), pada
keadaan ini tidak ada panjang gelombang serapan maksimum dimana X dan Y
menyerap tanpa gangguan. Maka perlu penyelesaian dua persamaan dengan
dua variabel yang tidak diketahui. Hal ini karena serapan total dari campuran
beberapa komponen merupakan jumlah serapan masing-masing komponen
tersebut. Sehingga konsentrasi X dan Y yang belum diketahui dalam kedua
persamaan dapat diukur dengan mudah. Dengan ditentukan bila nilai-nilai
absorptivitas molar () harus diketahui dari pengukuran terhadap larutan murni

Universitas Sumatera Utara

komponen X dan Y pada kedua panjang gelombang itu. Pada perinsipnya

persamaan-persamaan dapat disusun untuk berbagai komponen, asal nilai
absorbansi diukur pada panjang gelombang yang sama banyak dengan
komponen itu.

Gambar 3. Spektrum absorbsi X dan Y (tumpang tindih dua arah. Tidak ada
panjang gelombang dimana masing-masing senyawa dapat diukur
tanpa mengalami gangguan oleh yang lainnya)
(Day and Underwood, 1999)
2.2.4 Peralatan Untuk Spektrofotometri
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitans atau serapan
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Alat ini terdiri dari spektrometer
yang menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan
fotometer sebagai alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang
diabsorpsi (Khopkar, 1990; Day and Underwood, 1999).
Unsur-unsur terpenting suatu spektrofotometer ditunjukkan secara skematik dalam
gambar berikut:

Universitas Sumatera Utara

Sumber
1

Monokromator
2

Kuvet

Detektor

Bagian optik
Penguat

Bagian listrik

5
Pembacaan,
pengamatan
6

Keterangan Gambar :
1.

Suatu sumber energi radiasi yang berkesinambungan yang meliputi daerah

spektrum, dimana instrumen itu dirancang untuk beroperasi.

2.

Monokromator, yang merupakan suatu alat untuk mengisolasi suatu berkas

sempit cahaya pada panjang gelombang tertentu dari spektrum luas yang
dipancarkan oleh sumber.

3.

Kuvet sebagai wadah untuk sampel.

4.

Detektor yang merupakan suatu transducer yang mengubah energi radiasi

menjadi isyarat listrik sehingga dapat mendeteksi sinyal yang dipancarkan.

5.

Suatu amplifier (penguat) dan rangkaian yang berkaitan yang membuat

isyarat listrik dapat untuk diamati.

6.

Sistem pembacaan yang memperlihatkan besarnya isyarat listrik.

(Day and Underwood, 1999)

2.3 Validasi
Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada
prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Universitas Sumatera Utara

Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi,

kespesifikan, limit deteksi, limit kuantitasi, kelinieran dan rentang.
Akurasi (kecermatan) adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen
perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan dan dapat ditentukan
melalui dua cara yaitu metode simulasi (spiked placebo recovery) dan metode
penambahan bahan baku (standard addition method). Dalam metode simulasi,
sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia) ditambahkan kedalam
campuran bahan sediaan farmasi (plasebo), lalu campuran tersebut dianalisis dan
hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar
sebenarnya). Dalam metode adisi (penambahan bahan baku), sejumlah sampel
yang dianalisis ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai
120% dari kadar analit yang diperkirakan), dicampur dan dianalisis kembali.
Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang
diharapkan). Dalam kedua metode tersebut, persen perolehan kembali dinyatakan
sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya.
% perolehan kembali =

Keterangan:

x 100%

= Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan

larutan baku

cA

= Konsentrasi sampel sebelum penambahan larutan baku

c *A

= Konsentrasi baku yang ditambahkan

Presisi (keseksamaan) adalah derajat kesesuain diantara masing-masing

hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulang kali pada sejumlah cuplikan

Universitas Sumatera Utara

yang diambil dari satu sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi
standar atau deviasi standar relative (RSD). Presisi dapat diartikan pula sebagai
derajat

reprodusibilitas

(ketertiruan)

atau

repeatabilitas

(keterulangan)

(satiadarma, 2004; WHO, 1992). Nilai RSD antara 1-2% biasanya dipersyaratkan
untuk senyawa-senyawa aktif dalam jumlah yang banyak, sedangkan untuk
senyawa-senyawa dengan kadar sekelumit RSD berkisar antara 5-15% (Rohman,
2007).
Batas deteksi adalah nilai parameter, yaitu konsentrasi analit terendah
yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan
dengan blanko. Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Batas deteksi =

3 x SB
slope

Batas kuantitasi adalah jumlah analit terkecil dalam sampel yang masih
dapat diukur dalam kondisi percobaan yang sama dan memenuhi kriteria ceermat
dan seksama. Batas Kuantitasi =

10 x SB
slope

Kelinieran suatu metode analisis adalah kemampuan untuk menunjukkan

bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah secara secara matematika,
proporsional dengan konsentrasi analitt dalam sampel dalam batas rentang
konsentrasi tertentu (satiadarma, 2004; WHO, 1992).

Universitas Sumatera Utara