TITULO : Aislamiento de Rhizobium

OBJETIVO:

Reconocer ndulos en races de leguminosas

Preparar medio de cultivo Extracto Levadura Manitol
Realizar la tcnica de Squash para aislar bacterias
Aislar microorganismos

FUNDAMENTO TEORICO
A. FIJACION BIOLOGICA DEL NITROGENO
El nitrgeno es uno de los elementos qumicos esenciales para todos los seres vivos
ya que forma parte de los cidos nucleicos y de las protenas y, por lo tanto, es
fundamental en la estructura y el metabolismo celular (Paerl, 1998). Las plantas toman
el nitgeno directamente desde el suelo en forma de nitratos (NO3-) o amonio (NH4+),
algo que no pueden hacer los animales, que precisan tomarlo en forma de
compuestos

orgnicos.

Slo

algunosprocariotas

pueden

tomar

el

nitrgeno

directamente desde la atmsfera, via fijacin de nitrgeno, convirtiendo el nitrgeno

molecular en nitrgeno asimilable por otros seres vivos.
Teniendo en cuenta que este elemento es muy abundante en la atmsfera, la
obtencin de
nitrgeno directamente desde sta es una de las vas ms importantes para el
mantenimiento del ciclo del nitrgeno, del que forman parte las bacterias fijadoras de
nitrgeno, junto con otros grupos de bacterias que llevan a cabo procesos intermedios
de transformacin de compuestos nitrogenados y de desnitrificacin, que devuelve
finalmente el nitrgeno a la atmsfera. Por lo tanto, la existencia de un equilibrio en el
ciclo del nitrgeno es fundamental para la vida en la tierra y esto conlleva el
mantenimiento de los ecosistemas microbianos presentes en los medios terrestres y
acuticos.
B. SIMBIOSIS RHIZOBIUM LEGUMINOSA
La asociacin mutualista de rhizobia y leguminosas ha sido desde siempre la ms
estudiada por la importancia agronmica, econmica y social que tiene el cultivo de
estas plantas

a escala

mundial. Ambos

partcipes

son

capaces

de

vivir

independientemente, sin embargo, los dos se benefician mutuamente de la interaccin

que se caracteriza por la formacin de ndulos fijadores de nitrgeno que, en la
mayora de las leguminosas, se forman en la raz. Los ndulos son rganos
especializados que se desarrollan como resultado de un dilogo molecular por parte
de los rhizobia y de las plantas.
El establecimento de una simbiosis rhizobia-leguminosa eficiente conlleva una serie
de etapas que comienzan con un intercambio de seales entre ambos organismos: las
races de la planta liberan a la rizosfera flavonoides molculas de naturaleza fenlica
que promueven la expresin en las bacterias de los genes nod, lo cual origina la
sntesis y secrecin de lipo-oligoquitinas llamadas factores nod.
En las leguminosas en las que la infeccin se produce a travs de pelos radicales se
produce una deformacin de los mismos que origina un cambio en la direccin del
crecimiento, producindose en el extremo apical la morfologa tpica denominada
cayado de pastor, de modo que algunas de las bacterias quedan recluidas en el
interior de la curvatura de la misma. Los rhizobia, una vez invadidas las clulas de la
planta, proliferan y se diferencian a bacteroides, responsables de la fijacin de
nitrgeno, que estn rodeados por una membrana peribacteroidea de origen vegetal y
constituyen un nuevo orgnulo enominado simbiosoma.
C. TAXONOMIA DE LA RHIZOBIA
La identificacin consiste en determinar la identidad de un aislado como miembro de
un taxn establecido, teniendo en cuenta que el grupo taxonmico bsico en
taxonoma bacteriana es la especie.
La especie es un grupo de cepas que comparten caractersticas fenotpicas y
genotpicas que son diferentes significativamente de otros grupos de cepas.
La caracterizacin fenotpica de los rhizobia, al igual que la de otras bacterias, debe
incluir fundamentalmente la descripcin morfolgica de clulas y colonias, la velocidad
de crecimiento y las condiciones de cultivo en las que se produce, la asimilacin de
diferentes fuentes de carbono y nitrgeno, la produccin de exoenzimas y la
resistencia natural a antibiticos. No obstante, este tipo de clasificacin (fentica) no
est muy desarrollada en el caso de los rhizobia puesto que no se han estudiado este
tipo de caractersticas de manera uniforme en todas las cepas por lo que su utilidad
est prcticamente limitada, por el momento, a la descripcin de nuevas especies.
MATERIALES Y METODOS

A. MATERIALES
Matraz
Balanza
Agua Destilada
Material biolgico : Rhizobium
Obtenido a partir de la raz de alfalfa ( Medicago sativa)
B. METODOLOGIA
PRIMERO : Se procede a preparar el medio YMA, que en este caso ser Agar
Levadura Manitol o tambin llamado Rojo de Congo , para empezar pesamos una
cantidad determinada de Agar Levadura Manitol . Aqu se presenta la composicin
del medio YMA.
Agua Destilada
Manitol
K2HPo4
MgSO4.7H2O
NaCl
Extracto de Levadura

1L
10.0 g
0 .5 g
0.2 g
0.1 g
0.2 g

SEGUNDO : Procedencia de los ndulos

Los ndulos fueron extraidos de plantaciones de alfalfa silvestre en algunos casos
en estado fenologico de floracin como en algunas zonas de plantacin en el
distrito de Pocollay y Miculla ; por otro lado se pudo encontrar plntaciones de
alfalfa con ausencia de flores como es el caso de las zonas de Ilabaya , Pachia
de la Region Tacna .
La obtencin de los ndulos se realizo de manera aleatoria , por cada rea de 16
m2 se tomaron 3 plantones de manera aleatoria ,es decir al azar bien separadas
una de otras y de cada planta se tomaron 2 a 7 nodulos , tmando en cuenta que
algunos plantones posean pocos ndulos a diferencia de otros que carecan de
ndulos ; cada uno posea diferentes caractersticas .
Los ndulos eran de aproximadamente 2 mm , por falta de materiales se extrajo el
plantn completo (tallo y raz ) para poder conservarlo hasta la fecha de laboratorio
; la manera correcta hubiera sido cortar 1 cm de raz para luego ser introducidos
en frascos conteniendo el desecante (cloruro clcico anhdrido cubierto con
algodn hidrfilo).
Los ndulos se mantuvieron en sombra hasta su traslado a laboratorio.

TERCERO :
Los ndulos deben ser lavados cuidadosamente con agua destilada y secados con
papel celulosa para eliminar restos de suelo
TERCERO:
Los ndulos se esterilizaron en superficie sumergindolos en una solucin de
HgCl2 al 1,0% durante 4,5-6,0 minutos. Despus, en condiciones aspticas, se
lavaron diez veces con agua estril para eliminar los restos de HgCl2.
CUARTO : Posteriormente se trituraron uno a uno con ayuda de una varilla de
vidrio estril y se sembraron en placas con medio de cultivo YMA

DISCUSION
La ausencia

de Rhizobium en las races de Medicago sativa , puede ser

ocasionado por algunas condiciones adversas que impiden la infeccin y la

actividad benfica de Rhizobium en alfalfa
pesados , pesticidas ,etc.

, por concentraciones de metales