IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS

EN PLANTAS DE Aloe vera CULTIVADAS EN MUNICIPIOS DE RISARALDA

POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

MARIA FERLLEY VLEZ SERNA

NATHALY VILLA PULGARN

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGA
QUMICA INDUSTRIAL
PEREIRA
2012

RESUMEN
Se realiz la identificacin de antraquinonas y cromonas presentes en acbar y gel
de Aloe vera en las fincas La Magdalena en Mistrat, Pite tierra en Santuario, La
Esperanza en Beln de Umbra, La Aurora en Marsella y La Palma en Pereira en
el corregimiento de La Florida ubicados en el departamento de Risaralda. Se
implemento un mtodo de secado del gel con el fin de concentrar el contenido total
de antraquinonas y cromonas. La identificacin y cuantificacin se llevo a cabo
mediante la tcnica de Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (CLAE) en fase
reversa usando detector UV-Vis y para la obtencin de espectros UV se us
detector DAD; el mtodo empleado para el anlisis de las antraquinonas y
cromonas es precisa, exacta, reproducible y adecuada para el anlisis de
muestras de Aloe vera.
Se encontraron diferencias significativas en cuanto al contenido de antraquinonas
y cromonas haciendo uso del software InfoStat mediante el anlisis de varianza
ANOVA y el anlisis de conglomerados. El mayor contenido de estos metabolitos
se encontr en la finca La Palma en La Florida en acbar y gel, las fincas La
Magdalena en Mistrat y La Aurora en Marsella presentaron contenidos similares
e intermedios, mientras que en la finca Pite tierra en Santuario se encontr el
menor contenido de antraquinonas y cromonas, estos resultados aporta a los
productores de Aloe vera en el departamento informacin para darle uso comercial
a sus plantas de acuerdo al contenido de estos metabolitos.

12

1. JUSTIFICACIN

Durante los ltimos treinta aos se han emprendido en diferentes partes del
mundo programas dedicados a la investigacin de Aloe vera, debido a sus
propiedades teraputicas, nutricionales y cosmticas. A nivel mundial el mercado
crece continuamente, debido a que el muclago y el acbar extrados de este
vegetal son productos cada vez mas apetecidos por la industria alimenticia,
farmacutica y cosmtica [1].
En Estados Unidos, la mayor parte de Aloe vera es cultivada en el Valle de Ro
Grande al sur de Texas, en Florida y al sur de California. Internacionalmente, el
aloe se puede encontrar en Mxico, en los pases a lo largo del pacfico, la India,
Amrica del sur, Amrica central, el Caribe, frica y Australia. Los mercados ms
atractivos para productos de Aloe vera son los Estados Unidos, Francia, Reino
Unido, Alemania, Italia, Canad, Japn, Espaa, Suecia y Corea [2].
En Latinoamrica la gran produccin de cultivos de Aloe vera se da en Mxico,
seguido por Repblica Dominica y Venezuela. En Colombia los cultivos de Aloe
vera, se encuentran repartidos en diferentes departamentos, siendo de mayor
participacin los departamentos de atlntico y magdalena, El eje cafetero no tiene
una participacin considerable dentro de las estadsticas nacionales ya que sus
cultivos son menores al 5%; esto debido a que la planta se introdujo a la regin en
el 2004 [3].
En la regin cafetera con el nimo de aprovechar las bondades del clima y la
excelente calidad de sus suelos y a su vez como un fin social para dar una nueva
alternativa a los cultivadores se ha implementado el cultivo del Aloe vera en los
departamentos de Risaralda y Quindo [4].
En la planta de Aloe vera se pueden encontrar diversos componentes como agua,
enzimas, vitaminas, minerales, aminocidos, azcares y antraquinonas [5]. Las
antraquinonas son muy estudiadas debido a que otorgan propiedades curativas,
laxantes, entre otras, a las plantas en las que se encuentran presentes. Estos
metabolitos secundarios son de gran importancia debido a que actan en la planta
como mecanismo de defensa; es decir, son una respuesta al medio, el cual incide
en su contenido tanto en el gel como en el acbar.

13

En la regin se han realizado diversos estudios de caracterizacin del Aloe vera;

en cuanto a antraquinonas se desarrollo un trabajo para dar cumplimiento a lo
exigido por el INVIMA quien es el ente dedicado al control y vigilancia en la calidad
y seguridad de los productos farmacuticos y alimenticios; el cual pide que el
anlisis sea realizado por medio de la tcnica fotomtrica; sin embargo con este
mtodo solo se conoce el contenido total de antraquinonas. Teniendo en cuenta la
importancia de estos compuestos en la planta y por sus diferentes aplicaciones, se
considera necesario realizar un estudio que permita cualificar y cuantificar los
diferentes ismeros de antraquinonas mediante tcnica cromatogrfica que brinde
mayor informacin y permita establecer diferencias entre los cultivos de las zonas
de la regin cafetera y su posible aplicacin.

14

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Realizar el estudio comparativo del contenido de antraquinonas y cromonas
presentes en las hojas de Aloe vera procedentes de diferentes municipios del
departamento de Risaralda, mediante la tcnica de cromatografa lquida de alta
eficiencia, con el fin de ampliar la informacin de los cultivos en la regin.
2.2.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Desarrollar una tcnica de cromatografa lquida de alta eficiencia para

cualificar y cuantificar ismeros de antraquinonas y cromonas.
Cualificar los principales ismeros de antraquinonas y cromonas presentes en
hojas de Aloe vera cultivados en diferentes municipios de Risaralda.
Cuantificar los principales ismeros de antraquinonas y cromonas presentes
en hojas de Aloe vera cultivados en diferentes municipios de Risaralda.
Determinar el contenido de antraquinonas totales en plantas de Aloe vera
procedentes de uno de los municipios de estudio empleando la tcnica
espectrofotomtrica segn el requerimiento de INVIMA y compararlo con el
establecido por la tcnica de cromatografa liquida de alta eficiencia en este
estudio.

15

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En Colombia, existen cultivos de Aloe vera localizados en varios departamentos.

En la regin cafetera se inici el cultivo en el 2004, sin embargo se importa
materia prima para la elaboracin de productos a base de Aloe vera. Desde su
establecimiento en la regin se han realizado diferentes estudios sobre su
adaptacin, plagas y suelos, pero no sobre sus caractersticas qumicas
generando esto una carencia de soporte tcnico para productores y procesadores
de Aloe vera.
Se plantea el estudio comparativo del contenido de antraquinonas y cromonas
presentes en los cultivos de Aloe vera en el departamento de Risaralda, por el
mtodo de cromatografa lquida de alta eficiencia (CLAE), para ampliar el
conocimiento de la composicin qumica del Aloe vera cultivado en Risaralda.
Ser posible mediante el anlisis cualitativo y cuantitativo de antraquinonas por
CLAE establecer diferencias o similitudes entre plantas de Aloe vera cultivadas en
diferentes municipios de Risaralda y as contribuir al mejor aprovechamiento de
esta materia prima?

16

Tabla 8. Composicin qumica del mucilago de Aloe vera

Azcares

COMPONENTES

Vitaminas

Vitamina A, B1, B2, B5,

trazas de B12, C, E, cido
flico, colina
Niacina [5].

Enzimas

Lipasa, amilasa, catalasa,

oxidasa, fosfatasa alcalina
[5].

Minerales

Calcio, potasio, cloro, hierro,

zinc, cobre, azufre, sodio,
cromo,
manganeso,
aluminio,
magnesio
y
germanio [38].

Polisacridos

Monosacridos

Compuestos fenlicos

Aminocidos

Fructosa, alorido, celulosa,

glucomananos
neutros,
galactogalacturonanos,
glucogalactomananos,
arabinosa, entre otros.
Glucosa, manosa, xilosa,
galactosa,
ramnosa,
arabinosa y cidos urnicos.
Lisina,
valina,
cistena,
glicina,
fenilalanina,
metionina, leucina,
cido
asprtico, cido glutmico,
arginina y serina [5]

Derivados
hidroxiantracnicos

Alona, aloe emodina,

4Hidroxialona,
5hidroxialona, aloinsidos A y
B.

Derivados
cromnicos

Aloesina, aloeninas A y B,
aloeresina A y B,
8-Cglucosil-7-o-metil-(s)aloesil.

CARACTERISTICAS
Al igual que otros vegetales, el Aloe vera
es rico en vitaminas y tiene un bajo
contenido de grasa y alto en fibra, que
son responsables de sus usos
teraputicos y propiedades funcionales
como antioxidante [37].
La catalasa integra parte del sistema
antioxidante y es importante ya que su
funcin es destruir el H2O2 generado
durante el metabolismo celular [28].
Actan como biocatalizadores que
permiten la transformacin qumica de
sustratos, a partir de los cuales se
producen los diferentes componentes
necesarios para los procesos vitales
[39].
Se ha demostrado que los polisacridos,
contribuyen a la actividad farmacolgica
en la estimulacin de la proliferacin
celular y en actividades biolgicas como
anti
-inflamatorias,
antivirales,
inmunomoduladoras,
anti-ulcerativas,
desinfectante, cicatrizante y como antioxidadante [25, 33, 40, 41]
El Aloe vera proporciona 20 de los 22
aminocidos requeridos por el cuerpo
humano y 7 de los 8 aminocidos
esenciales que el cuerpo no sintetiza [5,
13]
Ejercen una amplia gama de actividades
biolgicas
como:
antifngico,
antimicrobiano,
anticancergeno
y
antioxidante [42]. Funcionan como
analgsicos
y
poseen
potentes
propiedades antibiticas, tanto para
virus como para bacterias [5]

5.1.7. Estudios sobre diferentes aplicaciones del Aloe vera. Debido a la gran
cantidad de metabolitos secundarios que posee la planta y a sus mltiples
aplicaciones se han realizado diversos estudios a nivel nacional e internacional,
algunos de estos estudios se presentan en las tablas 9 y 10.

29

Tabla 9. Estudios sobre diversas aplicaciones del Aloe vera

RESULTADOS

Disminucin
de
la
concentracin de aloina
y aloe-emodina por
adsorcin en columna
con carbn activado

Composicin qumica y
aplicaciones del Aloe
vera

Revisar la historia, sus

productos qumicos, el
uso medico, morfologa
vegetal, extractos y
agronoma de Aloe
vera.

Conservacion de fresa
(fragaria x ananassa
duch cv. camarosa)
mediante la aplicacin de
recubrimientos
comestibles de muclago
de Aloe barbadensis
Miller.

Obtener
un
recubrimiento
comestible a partir del
gel de Aloe vera para
prolongar la vida til de
las fresas.

Se logro aumentar la vida til de las

fresas
frescas
en
10
das,
disminuyendo las prdidas
de
humedad [45].

Composicin y
aplicaciones del gel de la
hoja de Aloe vera

Resaltar los efectos

descubiertos
recientemente
y
aplicaciones del gel de
la hoja.

Las diferencias en la composicin de

la planta debido a la ubicacin
geogrfica, as como las diferencias
en los mtodos de extraccin de gel y
tcnicas de preparacin de muestras,
han contribuido a las discrepancias
en los resultados obtenidos en
numerosos estudios en trminos de la
composicin qumica y la actividad
biolgica del gel de Aloe vera [46].

Antraquinonas en Aloe
vera barbadensis Miller
de zonas semiridas de
Falcn Venezuela, como
inhibidores de corrosin

Aislar la resina del Aloe

vera, y determinar su
accin inhibidora de
corrosin en el acero.

Se aislaron y caracterizaron tres

grupos
de
compuestos
de
antraquinonas responsables de la
actividad inhibidora [47].

Efecto protector del Aloe

vera (sbila) en lesiones
gstricas inducidas con
etanol en ratas.

Determinar el efecto
citoprotector del gel de
Aloe vera sobre la
mucosa
gstrica
y
compararla con la del
sucralfato en animales
de experimentacin.

El tratamiento con Aloe vera redujo

significativamente el porcentaje de
rea hemorrgica con respecto al
grupo control.
Respecto a la
profundidad de lesin, no existen
diferencias significativas entre los
valores
promedios
del
grupo
sucralfato y el grupo Aloe vera [48].

Per 2007

Colombia
2011

Estabilizacin del gel de

Aloe barbadensis Miller y
disminucin de su
concentracin.

Turqua
2011

Se evidencia la poca influencia del

proceso de estabilizacin en el
contenido de aloe-emodina en el gel
de Aloe, como si ocurre en el caso de
la alona. Se muestra la eficacia de la
tcnica
propuesta
para
la
estabilizacin del gel de Aloe
barbadensis
Miller,
con
concentraciones
de
alona
en
solucin permitdas por el Aloe
Science Council [43].
Los extractos de Aloe vera son
ampliamente utilizados en alimentos,
cosmticos, salud, cuidado de la piel
e industria medica. La administracin
de alimentos y frmacos de EE.UU.
ha aprobado el estudio del desarrollo
de Aloe vera en el tratamiento del
cncer y el SIDA. En el futuro se
requieren estudios controlados para
probar la eficacia del Aloe vera en
distintas condiciones [44].

Colombia
2009

OBJETIVO

Sudfrica
2008

ESTUDIO

Venezuel
a 2008

PAS

30

ESTUDIO
Gel de Aloe vera (L). N.L.
Burm. y harina de Sag
como soporte slido de
medio de cultivo para
plantas medicinales

Korea
2003

PAS
Cuba 2006

Tabla 10. Estudios sobre diversas aplicaciones del Aloe vera

OBJETIVO

Revisin de la relacin
entre los componentes
del Aloe vera y sus
efectos biolgicos

Estudiar
el
comportamiento del gel
de Aloe vera y harina
de sag, como soporte
solido del medio de
cultivo
de
plantas
medicinales
Establecer la relacin
entre los componentes
del Aloe vera y sus
efectos sobre la base
de
los
informes
publicados
y
otros
hallazgos recientes.

RESULTADOS

Se demostr que es posible la

sustitucin total o parcial del agar
empleado tradicionalmente, se
logra un beneficio econmico[49]
A la luz de muchas actividades
farmacolgicas de los componentes
de Aloe vera, cada componente
activo tiene varios factores de
interaccin, cada uno de los cuales
puede ser afectado por otra sustancia
[5].

5.2. COMPUESTOS FENLICOS

5.2.1. Definicin. Los compuestos fenlicos constituyen una de las familias ms
numerosas y ampliamente distribuidas en el reino vegetal, con ms de 8000
estructuras actualmente conocidas. Estos compuestos han sido de inters porque
son esenciales para la fisiologa y la morfologa de las plantas. Estn involucrados
en el crecimiento y la reproduccin, y confieren resistencia a las plantas frente a
agentes patgenos y depredadores [50].
Tienen un anillo aromtico en comn con uno o ms grupos hidroxilos. Estos
compuestos pueden ser divididos en varios grupos de acuerdo con su estructura
qumica bsica [50].
5.2.2. Clasificacin de los compuestos fenlicos. En la tabla 11 se puede
observar la clasificacin de los principales compuestos fenlicos de acuerdo con
su estructura qumica.
Tabla 11. Clasificacin de los compuestos fenlicos [50]
Estructura carbonada
C6
C6-C1
C6-C2
C6-C3
C6-C4
C6-C1-C6
C6-C2-C6
C6-C3-C6
(C6-C3)2
(C6-C3-C6)2
(C6-C3)n
(C6)n
(C6-C3-C6)n

Clasificacin
Fenoles simples, benzoquinonas
Acidos fenlicos
Acido feniacetico, acetofenoles
Acido hidroxicinamico, polipropano, cumarina, isocumarina
Naftoquinona
Xantanos
Antraquinona, estilbeno
Flavonoides, isoflavonas
Lignanos, neolignano
Bioflavonoides
Ligninas
Melanoidinas
Taninos

31

5.2.3. Antraquinonas. Entre los compuestos fenlicos caben destacar las

antraquinonas, que son por mucho el grupo ms amplio de las quinonas naturales
y son la base y fuente de una importante cantidad de colorantes [51]; adems son
una clase de metabolitos secundarios vegetales con una funcionalidad p-quinoide
en un ncleo antracnico [52].
5.2.3.1. Definicin y estructura. Las antraquinonas tienen dos grupos ceto-, su
mayora en posicin 9,10 (ver figura 5). La antraquinona basal (9,10
dioxoantraceno), puede ser sustituida de varias formas, resultando en una gran
diversidad de estructuras [53]. Exhibiendo numerosas actividades biolgicas que
los hacen buenos candidatos para nuevas investigaciones biolgicas o
farmacolgicas, entre otras aplicaciones [54].
O
8

10

2
3
4

5
O

Figura 5. Estructura general de las antraquinonas

5.2.3.2. Propiedades generales de las antraquinonas
Las agliconas antraquinnicas son compuestos slidos, cuyo color va desde el
amarillo al pardo rojizo.
Son solubles en solventes orgnicos: ter, cloroformo, alcohol caliente,
benceno.
Los glucsidos antraquinnicos son cristalizados, estas tienen un color ms
plido que la aglicona correspondiente y son solubles en agua caliente y
soluciones hidroalcohlicas.
5.2.3.3. Funciones de las antraquinonas. Se ha reportado que las antraquinonas
ejercen una amplia gama de actividades biolgicas incluyendo antifngico,
antimicrobiano, anticancergeno y antioxidante [42]. Funcionan como analgsicos
y poseen potentes propiedades antibiticas, tanto para virus como para bacterias
[55].
5.2.3.4. Fuentes de las antraquinonas. Las antraquinonas estn ampliamente
distribuidas en microorganismos, plantas, equinodermos e insectos. Las familias
vegetales ms ricas en compuestos antracnicos son las rubiceas, las

32

ramnceas y las poligonceas; y en una menor proporcin las liliceas,

leguminosas, bignoniceas, melastomatceas, droserceas, vismiceas, etc.
En las plantas inferiores como los lquenes se conoce una gran variedad de
antraquinonas, incluyendo antraquinonas halogenadas. Estas sustancias pueden
encontrarse en diferentes partes de la planta como hojas, tallos, madera y frutos;
se les encuentra principalmente en forma de glicsidos y en menor proporcin en
forma libre o agliconas.
Sus componentes ms importantes y activos son los derivados hidroxiantracnicos
(15 40%) como la antraquinona glicosidada alona A y B; aloinsido A y B y 5hidroxialona [13].
5.2.4. Alona. Es un liquido amarillo de sabor amargo, considerada el compuesto
antraquinnico ms importante del Aloe vera, es una antrona-C-glucsido con
nombre
IUPAC
10-glucopiranosil-1,8-dihidroxi-3-(hidroximethil)-9(10H)antracenona, tambin conocida como barbalona, est presente en las hojas de
especies de aloe, su contenido vara desde la estacin, la especie y la edad de la
hoja. Varios estudios indican un contenido entre 10 - 25% del peso seco de
exudado de las hojas [56].
La alona se produce de forma natural como una mezcla de diastereismeros,
alona A (Ajuste a C10, C1,: S, S) y alona B (en la configuracin C10, C1,: R, S)
como se observa en la figura 6; que difieren unos de otros solamente en la
configuracin en el carbono 10 (C-10) en la molcula de antrona aloe-emodina
[56].
OH

OH

OH

OH

OH

OH

H
H
OH

H
OH

H
H

HO

OH

H
H

Alona A

OH
Alona B

Figura 6. Estructura de la Alona A y B

33

OH

HO

OH

5.2.4.1. Funciones de la alona. La alona es el principal componente de una

sustancia amarilla que la planta de Aloe vera secreta como defensa para alejar a
posibles depredadores por su olor y sabor desagradables. Tambin parece
intervenir en el proceso de control de la evapotranspiracin en condiciones de
elevada insolacin y sequa. Esta antraquinona es un veneno, laxante y abortivo
[57]. Con efecto catrtico, adems tiene aplicaciones dermatolgicas, ya que es un
potente compuesto anti-malarico, antifungico, con propiedades antibacterianas y
antivirales [58]. Se utiliza en preparados farmacuticos produciendo en ocasiones
alergias a personas sensibles y en la legislacin europea se admite como mximo
un 0,1 % y Est completamente prohibida la presencia de alona en productos
alimentarios [57].
5.2.5. Cromonas
5.2.5.1. Definicin y estructura general. Las cromonas son un grupo de
compuestos de origen natural muy abundantes; especialmente en las plantas. Son
compuestos heterocclicos que contienen oxigeno con un anillo benzo--pirona
como se observa en la figura 7 [59]. Dentro de ellas podemos encontrar la
aloesina, tambin denominada aloeresina B y la aloeresina A [56].
O

O
Figura 7. Estructura general de las cromonas

5.2.5.2. Funciones. Las molculas que tiene estructura de cromona tienen un

amplio rango de actividades biolgicas; son componentes bio-activos en fuentes
naturales, se utilizan como anti-inflamatorios y antibiticos [28].
5.2.5.3. Fuentes. Como se haba mencionado anteriormente las cromonas se
encuentran en la naturaleza distribuida en hongos como: Aspergillus, nigers,
lquenes como: Roccella fuciformis D.C. y plantas superiores como: Cassia
obtusifolia y Aloe vera [60].
5.2.6. Aloeresina A. Segundo componente del Aloe vera Similar a la alona, la
aloeresina tiene un azcar C-glicosdico como se aprecia en la figura 8. El enlace
carbono-carbono que une al azcar aglicona es muy fuerte. La cromona se

34

distribuye a lo largo del gnero, se presenta en aproximadamente el 40% de las

especies ya examinadas [56].

Figura 8. Estructura de la Aloeresina A

5.2.6.1. Actividad biolgica. Tiene propiedades antioxidantes y propiedades antiinflamatorias, tpicamente puede absorber la luz ultravioleta [38].
Este compuesto tiene actividad inhibidora sobre la enzima tirosinasa. que cataliza
la conversin de tirosina en dopaquinona, y la cual es una subsecuente
polimerizacin a la melanina; por lo tanto, reduce la formacin de melanina y
cualquier tendencia a la hiperpigmentacin [56].
5.2.7. Extraccin de antraquinonas. Existen varios mtodos de extraccin para
antraquinonas, los procedimientos usados para el aislamiento de estas sustancias
dependen del tipo de ncleo de inters, es decir si se desea obtener las agliconas,
los glicsidos, las formas reducidas o las formas oxidadas. La agliconas presentes
en la muestra vegetal se extraen con solventes poco polares como ter etlico o
benceno. Los compuestos glicosdicos se extraen ya sea con etanol, agua o
mezclas de etanol-agua [52].
Los mtodos de extraccin empleados son los siguientes:
Extraccin Soxhlet. Esta extraccin se lleva a cabo usando un disolvente
orgnico, el cual refluye a travs de la muestra contenida en un dedal poroso de
celulosa o vidrio. Las ventajas mas importantes son el contacto continuo de la
muestra con disolvente fresco, simplicidad, bajo coste de adquisicin y la
posibilidad de procesar grandes cantidades de muestra; sus limitaciones son: el
tiempo necesario para la extraccin, y los volmenes de disolvente, en general

35

muy elevados frente a la extraccin con otras tcnicas lo que implica la necesidad
de concentrar los extractos orgnicos obtenidos [61].
Extraccin por ultrasonido. Es una tcnica sencilla de extraccin slidolquido, en donde la muestra se pone en contacto con un disolvente adecuado y se
somete a los ultrasonidos generados en un bao de agua o por una sonda de
ultrasonidos. De este modo, se produce la agitacin continua de la matriz con el
disolvente orgnico. El efecto mecnico de los ultrasonidos provoca una mayor
penetracin del disolvente en los materiales slidos, facilitando la transferencia de
los analitos de la matriz al disolvente. La eleccin del disolvente es esencial para
que el mtodo permita obtener elevadas recuperaciones de los analitos de inters
[61].
5.3. TCNICA DE ANLISIS
Para la cuantificacin de antraquinonas se han utilizado diferentes mtodos
instrumentales, entre ellos el espectrofotomtrico, esta es una tcnica que permite
cuantificar las antraquinonas totales presentes en la matriz a analizar. Los
mtodos cromatogrficos permiten una identificacin ms especfica de estos
analitos, como por ejemplo los ismeros A y B de la Alona, en esta tcnica no se
requiere la preparacin de derivados como en la espectrofotomtrica, permitiendo
as la lectura de los compuestos en la regin ultravioleta (UV) [42].
Existen otros mtodos que han sido reportados para la identificacin y
cuantificacin de derivados de antraquinonas en extractos de plantas como
cromatografa en contracorriente de alta velocidad (HSCCC), cromatografa
electrocintica micelar (MEC), electroforesis capilar de zona, cromatografa en
capa fina de alto rendimiento (HPTLC) [62].
5.3.1. Cromatografa. La cromatografa es un procedimiento de separacin de
los constituyentes de una mezcla. Se ha convertido en un mtodo analtico de
primer orden para identificar y cuantificar los compuestos de una fase liquida o
gaseosa homognea. Se fundamenta en los equilibrios de concentracin de los
compuestos presentes entre dos fases no miscibles de la que una llamada
estacionaria, esta inmovilizada en una columna o fija sobre un soporte y la otra,
llamada mvil, se desplaza al contacto de la primera. La elucin a velocidades
diferentes de los compuestos presentes conduce a su separacin [63].
5.3.2. Clasificacin de las tcnicas cromatogrficas. Las tcnicas
cromatogrficas pueden clasificarse segn la naturaleza fsica de las fases, el

36

procedimiento utilizado o el fenmeno fsico-qumico. A continuacin se realiza

una breve descripcin de las diferentes tcnicas segn la naturaleza de las fases
involucradas [63]
Cromatografa plana.
Cromatografa en capa delgada. Es una tcnica de adsorcin slido-lquido
que cuenta con la capacidad de separar varias muestras simultneamente
en una sola placa de vidrio revestida con una capa delgada adherente de
partculas finamente divididas. La fase mvil se desplaza por la fase
estacionar por accin capilar [64, 65].
Cromatografa en papel. El papel cromatogrfico se fabrica de celulosa
pura y con un estricto control de porosidad y grosor. El papel contiene
suficiente agua adsorbida para que constituya la fase estacionaria acuosa.
La fase mvil es un solvente orgnico saturado en agua [65].
Cromatografa en columna. Como fase estacionaria (adsorbente) se usa,
generalmente, slice o almina contenida en una columna y la fase mvil pasa a
travs de la columna por medio de los espacios abiertos entre las partculas del
material de relleno. La elucin implica la purificacin de una especie por lavado
mediante adicin continua de solvente nuevo [65].
Cromatografa gaseosa. Es una tcnica donde el analito se hace pasar en
forma gaseosa a travs de la columna, arrastrado por una fase mvil
gaseosa, llamado gas portador [66].
Cromatografa de adsorcin gas-solido. Se basa en una fase estacionaria
slida en la cual la retencin de los analitos ocurre por adsorcin, es til para
la separacin de especies que no se retienen en columnas de gas-lquido;
esta cromatografa se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en
columnas tubulares abiertas [65].
Cromatografa de particin gas-liquido. En esta tcnica el analito se divide
entre una fase mvil gaseosa y una fase estacionaria lquida sobre la
superficie de una relleno slido inerte o en las paredes de un tubo capilar
[65].
En la figura 9 se observa un esquema de las tcnicas cromatogrficas existentes.

37

Cromatografa
Capa delgada
Cromatografa
Plana
Cromatografa
de papel

Gas-Slido

Clasificacin
tcnicas
cormatogficas

Cromatografa
de Gases
F.M: Gaseosa
Gas-Lquida

Cromatografa
en Columna

Lquida-Slida

Lquida-Lquida
Cromatografa
Lquida
F.M: Lquida

Cromatografa
lquida de alta
eficiencia

Intercambio
Inico
Exclusin
Molecular

Figura 9. Esquema de clasificacin de las tcnicas cromatogrficas

5.3.3. Cromatografa lquida de alta eficiencia (CLAE)
La cromatografa liquida se basa en la combinacin de un alto intervalo de
posibles propiedades de la fase mvil, junto con la eleccin de numerosos tipos de
fases estacionarias, significativamente diferentes, as como una amplia variedad
de detectores [67]. En la CLAE el compuesto pasa por la columna cromatogrfica
a travs de la fase estacionaria mediante el bombeo de lquido a alta presin a
travs de la columna. La muestra a analizar se inyecta en pequeas cantidades y
sus componentes eluyen diferencialmente dependiendo de las interacciones
qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que pasan por la columna. El
grado de retencin de los componentes de la muestra depende de su naturaleza,
afinidad hacia la fase estacionaria y fase mvil; y la composicin de las mismas
[67, 68]
5.3.3.1. Tipos de separacin por cromatografa liquida. En CLAE el mtodo
dominante es la cromatografa de fase ligada que puede clasificarse en fase
normal (NP-BPC) y fase reversa de acuerdo a la polaridad relativa de la fase mvil
y de los grupos funcionales qumicamente ligados a la matriz [69].

38

Cromatografa de fase normal. En esta cromatografa la fase estacionaria es

polar, utilizndose rellenos en los que R en la estructura del siloxano puede ser un
grupo ciano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), AMINO (-C3H6NH2) y
dimetilamino (-C3H6N(CH3)2); La elucin se lleva a cabo con solventes no polares
como etilter, cloroformo o n-hexano. El componente menos polar eluye primero,
debido a que es el ms soluble en la fase mvil, y un aumento de la polaridad de
sta hace disminuir el tiempo de elucin [70].
Cromatografa en fase reversa. En esta tcnica la fase estacionaria es menos
polar que la fase mvil. La columna esta rellena de partculas de slicagel unidas a
cadenas C18 como Octadecilsilano (fase estacionaria ms utilizada); a cadenas
C8 octilsilano, ciclohexilo y grupos fenilo [71]; los componentes ms polares
aparecen primero y al aumentar la polaridad de la fase mvil aumenta el tiempo de
retencin de los componentes [70].
La fase mvil est constituida por un solvente polar, mezcla de agua y un
modificador orgnico, a los que se les puede agregar aditivos, sales o buffers. A
mayor modificador orgnico, menor retencin y a mayor proporcin de agua,
mayor retencin. Los solventes de mayor empleo adems de agua son: metanol,
acetonitrilo, isopropanol y tetrahidrofurano [69]. Estos solventes se pueden
clasificar en trminos de polaridad de la siguiente manera:
Agua > MeOH > AcCN > IsoPOH > THF

A medida que disminuye la polaridad en los solventes, aumenta su poder de

elucin; en la tabla 12 se mostraran algunas de sus propiedades.
Solvente
Agua
Metanol
Acetonitrilo
Isopropanol
Tetrahidrofurano

ndice de
polaridad
9.0
6.6
6.2
4.3
4.2

Fuerza
dispersiva
0.03
0.04
-0.10
-0.15

Donador de
protones
0.40
0.51
0.33
0.28
0.41

Aceptor de
protones
0.34
0.19
0.26
0.39
0.19

Momento
dipolar
0.26
0.30
0.41
0.33
0.40

Tabla 12. Propiedades de los solventes en CLAE

La cromatografa en fase reversa puede clasificarse segn su forma operativa
como se observa en la tabla 13.

39

Tabla 13. Clasificacin de la cromatografa en fase reversa segn su forma

operativa
Cromatografa
Supresin inica

Par inico

Complejacin con
iones metlicos

RP en medio no
acuoso

De reparto

Descripcin
Los solutos ionizables dan picos con baja retencin y fuerte
asimetra; en fase reversa solo se retendr favorablemente la
especie no inica. As, los factores que modifican ese equilibrio,
ya sean pH o fuerza inica, modificaran la retencin [69].
En esta cromatografa la fase mvil contiene un par-in, es decir,
una especie qumica de carga opuesta al analito; estos forman un
complejo neutro que se transporta dentro de la
columna, particionndose entre la fase mvil y la fase
estacionaria. Se trata de mantener el analito en su forma inica
[69].
Esta modalidad se conoca como cromatografa de intercambio
de ligandos, por el intercambio del soluto (ligando) con iones
metlicos inmovilizados en la fase estacionaria [69].
El soluto puede ser insoluble en AcCN, MeOH o THF, y sus
mezclas con agua. Estas muestras altamente lipoflicas pueden
ser resueltas en fase normal; pero la fase reversa con fase mvil
de baja polaridad, sin agua agregada tiene muchas veces la
suficiente selectividad y poder de retencin para permitir su
resolucin[69]
Para este tipo de cromatografa se emplea como fase mvil una
mezcla de agua y un modificador orgnico MeOH, AcCN o THF,
en mezclas binarias, terciarias y en casos complejos, an
cuaternarias [69].

5.4. INSTRUMENTACIN PARA CORMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA

EFICIENCIA
5.4.1. Bomba. las bombas de CLAE impulsan la fase mvil proveniente del
reservorio de solvente hacia el inyector, y desde all hacia la columna.
Bsicamente existen dos tipos de bomba: las de pistn y las de desplazamiento
[69].
5.4.2. Inyector. Es el dispositivo que permite introducir la muestra en solucin sin
interrumpir el caudal de solvente a travs del sistema. Actualmente la totalidad de
los inyectores de CLAE son vlvulas que orientan el caudal hacia la columna, las
vlvulas pueden accionarse manual o automticamente [69].
5.4.3. Columna. Consta de un soporte rgido, ms una fase estacionaria adjunto
[64]. La fase estacionaria est contenida en un tubo que debe ser capaz de
contener la presin generada en su interior durante su uso [72].

40

5.4.4. Detectores. El detector es un transductor que convierte una caracterstica

fsica o qumica de un analito eluido en una seal elctrica que puede estar
relacionada con la concentracin del analito [64], y luego transmitir la seal
elctrica a la pantalla donde se muestra como una desviacin de la lnea [71].
Los detectores pueden clasificarse en generales y selectivos. Los detectores
generales miden el cambio en alguna propiedad fsica de la fase mvil que
contiene el analito, como el detector de ndice de refraccin y de conductividad;
los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del
soluto como el detector UV, de arreglo de diodos (DAD), de fluorescencia,
ndice de refraccin y el electroqumico [69, 71].
5.4.4.1. Detector de adsorcin UV-visible. Los detectores ms utilizados en la
HPLC moderna son fotmetros basados en rayos ultravioleta (UV) y la absorcin
de luz visible. Estos detectores tienen una alta sensibilidad para muchos solutos,
pero las muestras deben absorber en la regin UV (o visible). La concentracin de
la muestra es linealmente proporcional a la absorbancia, de luz transmitida a
travs de la celda.
5.4.4.2. Detector de arreglo de diodos. Puede ser operado para recopilar datos
en una o ms longitudes de onda a travs de un cromatograma, o para recoger
espectros completos de uno o ms analitos en una corrida. Si dos picos eluidos
estrechamente tienen espectros suficientemente diferentes, puede ser posible
distinguir los dos picos espectralmente con este detector [64]
5.3.3. Espectroscopia ultravioleta visible. La absorcin en el UV-VIS se debe a
las vibraciones de los electrones, con cambio de su nivel energtico, se da ms
fcilmente en los compuestos que tienen enlaces dobles y triples conjugados y
electrones no compartidos y esta favorecida por la resonancia. Esta tcnica da
informacin sobre la distribucin de electrones en la molcula (espectros
electrnicos) y de ella se obtienen algunos datos sobre la estructura molecular
[73].
La regin UV-Vis del espectro electromagntico, que se extiende de unos 200 a
unos 800 nm, es la regin espectral ms utilizada en anlisis qumico. Los
instrumentos que se utilizan en el visible y el ultravioleta son comunes,
relativamente sencillos y bien adaptados al anlisis cuantitativo. Existen dos
clases generales de compuestos qumicos que absorben en la regin ultravioleta-

41

visible y que se pueden determinar cuantitativamente midiendo esta absorcin. Se

trata de los compuestos orgnicos que poseen dobles enlaces conjugados o
anillos aromticos, y los iones de los metales de transicin.
Los equipos destinados a la medicin de la absorcin de radiacin contienen una
fuente de radiacin continua. Para la luz visible, esta fuente o foco es una lmpara
de filamento de wolframio [74].
5.5. ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO
5.5.1. Anlisis cualitativo. Las mediciones cualitativas son las que identifican o
ayudan a identificar la estructura de un analito. En general, la cromatografa es
una dbil herramienta para el anlisis cualitativo, pero un sistema CLAE de buen
comportamiento acoplado a un detector apropiado puede hacer que sea mucho
ms adecuado. Existen tres mtodos comunes para el anlisis cualitativo por
CLAE:
Tiempo de retencin: La tcnica ms comn para el anlisis cualitativo por
HPLC es comparar el (tR) tiempo de retencin del analito a la de un patrn de
referencia.
Anlisis en lnea: La elucidacin estructural de analitos desconocidos se
puede realizar con la ayuda de detectores de CLAE, pero rara vez esta deteccin
es tan eficaz como los procedimientos cualitativos off-line. Varios detectores de
como UV, RMN, o IR proporcionan informacin cualitativa espectral sobre la
muestra; mientras que otros detectores, como dispersin lser de luz, MS o
detectores quirales generan informacin ms especfica y cuantitativa sobre el
analito.
Anlisis fuera de lnea: Si se recogen fracciones de la corriente de efluente en
CLAE en modo semipreparativa o preparativa, una cantidad suficiente de analito
puro puede ser recogido para permitir el anlisis fuera de lnea para la
determinacin estructural [64].
5.5.2. Anlisis cuantitativo.
5.5.2.1. Calibracin. La calibracin es el proceso mediante el cual se determina
la respuesta del detector por unidad de concentracin (o masa) del analito. La

42

calibracin puede realizarse con tres mtodos diferentes: estndar externo,

estndar interno y adicin de estndar [64].
5.5.2.1.1. Estndar externo. Se preparan estndares de concentracin
semejante al analito en la muestra y en el ensayo cromatogrfico de ambas,
muestra y estndar, en las mismas condiciones operativas. La concentracin de
analito en la mezcla se determina comparando el rea del pico en cuestin con el
rea correspondiente al estndar de referencia. Como se observa en la ecuacin
1.
Ecuacin 1
Donde P es el porcentaje de analito en la muestra, Am y As son las reas de la
muestra y el estndar respectivamente, Cs es la concentracin del estndar y D es
un factor de dilucin.
Este mtodo requiere, obviamente, la utilizacin de un estndar de referencia y su
exactitud depender ampliamente de la calidad del estndar utilizado. La precisin
de los datos que se obtienen depende tanto de la preparacin de la muestra y el
estndar como de la inyeccin de ambos [69].
5.5.2.1.2. Estndar interno. Consiste en agregar cantidades exactamente
medidas de una sustancia as denominada, tanto a la muestra como a un estndar
que contiene al analito, preparado con la misma concentracin que la muestra.
Para determinar la concentracin de analito en la muestra se calcula la relacin de
reas de analito a estndar interno tanto en la muestra y como en el estndar y se
efecta el cociente entre amabas como se observa en la ecuacin 2:
Ecuacin 2
Donde P es el porcentaje de analito en la muestra, Rm y Rs son las relaciones de
rea de analito a estndar interno en la muestra y el estndar respectivamente, C s
es la concentracin del estndar y D es un factor de dilucin [69].
5.5.2.1.3. Adicin de estndar: Esta tcnica es utilizada cuando una muestra en
blanco no est disponible, y la matriz de la muestra puede afectar el tiempo de
retencin y la respuesta o rea del pico del analito [64]. Consiste en inyectar dos
muestras para realizar un anlisis, una de ellas es la muestra original y la otra es
la muestra a la que se le agrega una cantidad conocida de estndar de referencia.

43

Esta segunda muestra se usa como estndar. La concentracin del analito en la

muestra se calcula con la ecuacin 3.
Ecuacin 3
Donde P es el porcentaje de analito en la muestra Am y Ams son las areas del
analito en la muestra tal cual y la muestra a la que se le ha agregado estndar
respectivamente, Cs es la concentracin del estndar y D es un factor de dilucin
[69].
Debido al gran nmero de determinaciones realizadas en un anlisis qumico se
hace necesario el empleo de parmetros estadsticos que simplifican el anlisis de
los resultados obtenidos [69]. Estos parmetros son:
5.5.2.1.4. Linealidad. Se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin del
analito y su respuesta. Conjuntamente se determina el rango lineal o sea el
intervalo comprendido en la concentracin mnima y mxima de analito para el
cual el mtodo y dentro del cual se puede efectuar el clculo por interpolacin en
una curva estndar [69].
Para su determinacin se prepara una serie de al menos cinco patrones de un
estndar, se determina la curva de regresin
por el mtodo de los
mnimos cuadrados [69].
5.5.2.1.5. Precisin. Est relacionada con la dispersin de las medidas alrededor
de su valor medio y corresponde al grado de concordancia entre ensayos
individuales cuando el mtodo se aplica repetidamente a mltiples alcuotas de
una muestra homognea. Se expresa matemticamente como la desviacin
estndar ( ), como la desviacin estndar relativa (
) o coeficiente de variacin
( ) el cual tiene un criterio de aceptacin no mayor al 2 %. Estos estimadores
permiten evaluar la incertidumbre en la estimacin de la medida [69].
La precisin debe medirse en condiciones repetitivas (mismo analista, mismo da,
mismo instrumento) y en condiciones reproducibles (diferente analista, diferente
da, diferente instrumento). El cociente repetibilidad/reproducibilidad es un
parmetro muy til para evaluar la precisin de un mtodo analtico. Su valor esta
normalmente comprendido entre 1.5 y 2 [69].

44

5.5.2.1.6. Exactitud. Se conoce tambin como error sistemtico o tendencia y

corresponde a la diferencia entre la media de los valores obtenidos y el valor
verdadero. Se puede expresar de los siguientes modos: desviacin, desviacin
relativa y recuperacin. La exactitud debe ser tan pequea para que sea posible
que el valor medido se aproxime al de referencia [69] .
5.5.2.1.7. Sensibilidad. Corresponde a la mnima cantidad de analito que puede
producir un resultado significativo. Se debe diferenciar claramente entre dos tipos
[69]:
Sensibilidad de calibracin: Correspondiente a la curva de calibracin.
Sensibilidad analtica: Correspondiente al cociente entre la sensibilidad de
calibracin y la desviacin estndar de la medida.
Al evaluar la sensibilidad se debe tener en cuenta los siguientes parmetros:
Limite de deteccin: Es la menor concentracin de analito que puede
detectarse, pero no necesariamente cuantificarse en una muestra, en las
condiciones establecidas; se expresa en unidades de concentracin. Se
calcula como la seal del blanco,
ms tres veces la desviacin estndar
del blanco,
[69], como se observa en la ecuacin 4:
Ecuacin 4
Limite de cuantificacin: Es la menor concentracin de analito que puede
determinarse con precisin y exactitud en las condiciones establecidas y se
expresa en unidades de concentracin. Se calcula como la seal del blanco,
ms diez veces la desviacin estndar del blanco,
[69], como se puede
observar en la ecuacin 5:
Ecuacin 5
5.6. ANLISIS ESTADSTICO
5.6.1. Anlisis de varianza y paquete estadstico. El anlisis de varianza
ANOVA de una va es una herramienta estadstica, de gran utilidad para el
control de procesos y mtodos analticos [75], cuando el nmero de medias
obtenidas es mayor de dos. Cuando se varan factores como mtodos,
laboratorios, analista etc., siempre existen dos fuentes de error, la primera, el
45

error aleatorio de medida y la segunda, los errores debidos al cambio de los

factores anteriormente mencionados. Mediante el ANOVA se puede controlar el
error introducido por esta segunda fuente, por lo que se habla de ANOVA de un
factor [76]. El objetivo del ANOVA es comparar los diversos valores medios para
determinar si alguno de ellos difiere significativamente del resto.
5.6.2. Anlisis de conglomerados. Es una tcnica estadstica que permite
organizar la informacin de las variables para formar grupos homogneos,
denominados clusters (grupos, clases). Los grupos que se obtienen se forman
por ser internamente homogneos (todos los miembros del grupo son parecidos)
y externamente heterogneos (los miembros de un grupo son muy diferentes de
los otros grupos). Es decir, con el mtodo de cluster se pueden incluir objetos en
grupos segn su grado de asociacin, que ser mximo si pertenecen al mismo
grupo o mnimo si son de grupos diferentes [77].

46

6. METODOLOGA
6.1. INSTRUMENTACIN Y REACTIVOS
Los equipos utilizados para este anlisis fueron: estufa BINDER, ultrasonido
marca BRANSON 3510, cromatgrafos HITACHI LaChrom y Jasco; y microjeringa HAMILTON de 100L. Los reactivos fueron acetonitrilo grado CLAE,
metanol grado CLAE, agua destilada y desionizada, alona A de pureza >97% de
hojas de Aloe barbadensis Miller, y estndar de Aloe curaao.
6.2. LUGAR DE ANLISIS
El anlisis se llevo a cabo en el laboratorio de Oleoqumica de la Universidad
Tecnolgica de Pereira ubicada a una latitud norte 04 48 N, longitud oeste de 75
41 O, altitud de 1411 msnm con una temperatura promedio de 22 C y una
precipitacin de 2700 mm/ao.
6.3. MUESTRAS DE ANLISIS
Para el anlisis se utilizaron hojas adultas no menores a 3 aos recolectadas de la
parte baja de la planta de Aloe vera; frescas y de aspecto sano, cultivadas en
cinco fincas del departamento de Risaralda las cuales se mencionan en la tabla
14.
Tabla 14. Lugares de recoleccin de las hojas de Aloe vera
MUNICIPIO
Marsella
Mistrat
Beln de Umbra
Santuario
Pereira - Corregimiento de La Florida

FINCA
La Aurora
La Magdalena
La Esperanza
Pite Tierra
La Palma

6.3.1. Recoleccin y transporte de las muestras de Aloe vera. Se tomaron

hojas de plantas adultas, realizando un recorrido en forma de zig-zag o diagonal,
segn la topografa y el tamao del terreno. Se recolectaron las hojas en bolsas
negras de polietileno y se trasladaron hasta la Universidad Tecnolgica de Pereira
en el menor tiempo posible.
6.3.2. Pre-tratamiento. Las hojas de Aloe vera se llevaron al laboratorio de
Oleoqumica de la Universidad Tecnolgica de Pereira, se dejaron a temperatura
ambiente por un da, se lavaron con agua de la llave y jabn TEGO 51 para
alimentos y se conservaron a 4C para posterior anlisis.

47

6.3.2.1. Obtencin del acbar. Se realiz una incisin sobre el extremo inferior de
la hoja empleando un cuchillo plstico, para obtener el acbar por gravedad y
recolectarlo en un vaso de precipitados protegido de la luz (ver figura 10). Este
procedimiento se realizo con dos hojas de cada zona, y cada hoja se analizo por
triplicado.

Figura 10. Obtencin de acbar

6.3.2.2. Obtencin y secado del gel de Aloe vera. Se pes la hoja entera,
posteriormente se realiz un corte alrededor del borde de la hoja que permiti la
remocin de la corteza para obtener el muclago; se peso y corto en lminas
delgadas que fueron dispuestas en bandejas forradas con papel vinilo (ver figura
11), las cuales se colocaron en una estufa BINDER a 40C durante dos das. Para
concentrar los analitos de inters. Este procedimiento fue realizado con dos hojas
de cada zona, las cuales se analizaron por triplicado.

(a)

(b)

Figura 11. Obtencin del muclago de la hoja de Aloe vera en base hmeda
(a) y en base seca (b)

48

6.4. EXTRACCIN DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS PARA ANLISIS

POR CLAE
Se emplearon muestras de mucilago seco y acbar. La extraccin se realizo en
ultrasonido marca BRANSON referencia 3510 usando metanol grado CLAE como
solvente de extraccin con una relacin muestra solvente 1:10 (0.5g de muestra y
5mL de metanol) durante 10 minutos a temperatura ambiente [2, 13].
6.5. EXTRACCIN
DE
ANTRAQUINONAS
PARA
ANALISIS
POR
ESPECTROSCOPIA UV-VIS
Se empleo mucilago seco. La extraccin se realizo en ultrasonido marca
BRANSON referencia 3510 usando una mezcla agua:etanol 1:1 como solvente de
extraccin con una relacin muestra solvente 1:2,5 (1 g de muestra y 2.5 mL de
mezcla) durante 40 minutos a temperatura ambiente [2].
6.5.1. Obtencin de derivados. A los extractos obtenidos por ultrasonido se les
adiciona cido clorhdrico 0,1M y tricloruro frrico (ver figura 12); se realiza
ultrasonido durante 30 minutos. Posteriormente se le realizaron 4 extracciones
sucesivas con ter de petrleo. Los extractos etreos fueron concentrados por
rotaevaporacin, los residuos obtenidos se redisolvieron con solucin metanlica
de acetato de magnesio al 1%. La solucin se someti a reflujo a una temperatura
de 40C durante 10 min para propiciar el desarrollo del color rosado o rojo, se dej
reposar hasta alcanzar temperatura ambiente y se afor a 10 mL con solucin
metanlica de acetato de magnesio al 1% para su posterior anlisis por
espectrofotometra [2]

Figura 12. Reaccin de hidrlisis de la alona

49

6.6. ANLISIS DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS POR CLAE

Para el anlisis de antraquinonas y cromonas por CLAE se trabajo bajo las
condiciones descritas en la tabla 15.
Tabla 15. Condiciones de anlisis por CLAE para antraquinonas y cromonas

Cromatgrafo
Columna
Fase mvil

Condiciones de anlisis
HITACHI LaChrom
L 2130
Bomba
L 2300
Horno
L 2420
Detector

Jasco*
PU 2089
CO 2065
MD 2015
Symmetry C18, 100, 5 m, 4,6 x 250 mm
Agua (A) : Acetonitrilo (B)

Gradiente
Despus de cada
corrida se realizaba
una re-equilibracin
de 15 minutos.

Tiempo
0 min
12 min
37 min
50 min
60 min

Proporcin
84% A
84% A
67% A
40% A
100% B

Detector
Longitud de onda
Flujo
Temperatura
Volumen de
Inyeccin
Software

UV

DAD
296 nm
1 mL/min
45 C
20 L

EZChrom Elite Data System

* Este equipo fue utilizado para el anlisis cualitativo.

6.6.1. Anlisis cualitativo de las antraquinonas y cromonas presentes en el

Aloe vera. Para establecer la identificacin de antraquinonas y cromonas, se
realiz la comparacin con los tiempos de retencin (tr); preparando un patrn del
estndar de Aloe curaao Sigma-Aldrich; y una muestra de acbar; los cuales se
inyectaron bajo las condiciones previamente establecidas (ver tabla 15).
Adems se realiza un anlisis en un cromatgrafo equipado con detector de
arreglo de diodos (DAD), para la obtencin de los espectros UV de cada pico,
determinar su naturaleza y establecer la identidad de las antraquinonas y
cromonas presentes en la muestra de anlisis.
6.6.2. Anlisis cuantitativo de las antraquinonas y cromonas presentes en el
Aloe vera. La cuantificacin se realiz empleando las condiciones de separacin
descritas en la tabla 16 y por el mtodo de estndar externo, realizando una curva

50

de calibracin de 5 puntos utilizando el estndar de alona al 97% Sigma-Aldrich

(ver tabla 16), cada patrn se preparo en baln aforado de 5 mL, protegidos de la
luz con papel aluminio.
Tabla 16. Concentracin de los patrones de alona al 97%
Patrn
1
2
3
4
5

Concentracin
20 ppm
40 ppm
60 ppm
80 ppm
100 ppm

Para la curva de calibracin se evaluaron los parmetros de linealidad, precisin,

sensibilidad (LD y LC) y exactitud para determinar que el mtodo utilizado en el
anlisis sea el adecuado.
6.7. ANLISIS DE ANTRAQUINONAS TOTALES POR LA TCNICA
ESPECTROFOTOMETRCA
La cuantificacin de los derivados antraquinnicos se realiz por
espectrofotometra UV-Visible, empleando un espectrofotmetro Marca
ThermoScientific Evolution 60. Las muestras fueron analizadas a una longitud de
onda de 495 nm en el espectrofotmetro y la cuantificacin se realiz utilizando
una curva de calibracin realizada con un estndar de Aloe curaao Sigma-Aldrich
(ver tabla 17) [2]
Tabla 17. Concentracin de los patrones de Aloe curaao
Patrn
1
2
3
4
5
6
7
8

Concentracin
10 ppm
20 ppm
40 ppm
60 ppm
80 ppm
100 ppm
200 ppm
312 ppm

Absorbancia
0,000
0,003
0,005
0,006
0,0091
0,011
0,021
0,034

6.8. TOMA DE DATOS Y ANLISIS ESTADSTICO

Se realiz un anlisis de varianza ANOVA y un anlisis de conglomerados
mediante el Software InfoStat versin 2011e para contribuir con el establecimiento

51

de diferencias y/o similitudes en cuanto al contenido de las antraquinonas y

cromonas en las diferentes zonas de estudio.
Se realiz una comparacin de las medias para determinar la homogeneidad de
las muestras a travs del nivel de significancia de los datos con un criterio del 5%
y los valores crticos de la distribucin F (0,05); tanto para las muestras de gel
como para las muestras de acbar. Para esto se plantearon dos hiptesis:
H0= hiptesis nula: la cual sugiere que las concentraciones de las muestras son
iguales en todas las zonas de cultivo.
H1= hiptesis alterna: sugiere que las concentraciones de al menos dos zonas
sean diferentes.

52

Anexo 3. Curva de calibracin de alona por CLAE

Curva de alona por CLAE

7000000
6000000

rea

5000000
4000000
3000000
2000000

y = 66893,864x + 4.590,00
R = 0,99996

1000000
0
0

20

40

60

Concentracin (mg/L)

97

80

100

Anexo 6. Curva de calibracin de alona por espectrofotometra

Curva de alona por espectrofotometra

0,04

Absorbancia

0,035
0,03
0,025
0,02
0,015

0,01
y = 0,000106x + 0,000407
R2 = 0,9978

0,005
0
0

50

100

150

200

Concentracin (mg/L)

100

250

300

350